Protokol pro proteomiku: Bezkontaktní sonikace zlepšuje přípravu peptidových vzorků pro MS
Proteomika typu „bottom-up“ se stala základním kamenem moderního objevování biomarkerů, strukturální biologie a klinické diagnostiky. Díky štěpení proteinů na peptidy před analýzou pomocí hmotnostní spektrometrie (MS) mohou výzkumníci dosáhnout hlubšího pokrytí sekvencí a spolehlivější kvantifikace. Příprava biologických vzorků s vysokou komplexností pro MS však zůstává technicky náročná. Nedávné metodologické pokroky poukazují na to, jak kontrolované ultrazvukové zpracování – konkrétně s bezkontaktním sonikátorem VialTweeter Multi-Tube a sonikátorem pro mikrodestičky UIP400MTP – může tento pracovní postup výrazně zefektivnit, zlepšit reprodukovatelnost a zabránit běžným úzkým místům při práci s přístroji.
Najděte podrobný postup přípravy vzorků, který vám umožní získat peptidy vhodné velikosti pro analýzu pomocí MS.
Kdo by měl při přípravě peptidových vzorků využívat bezkontaktní sonikaci?
- Proteomika zdola nahoru & Discovery Labs: Výzkumní pracovníci, kteří připravují vysoce komplexní vzorky pro LC-MS nebo MALDI a potřebují konzistentní výtěžnost peptidů v různých biologických matricích.
- S-Trap™ & Zablokování uživatelů v režimu pozastavení: Týmy, které využívají čištění pomocí mikrokoloidů a potřebují řízené štěpení DNA, aby zabránily ucpání kolony a zajistily plynulé nanášení vzorků a jejich štěpení.
- klinický & Skupiny zabývající se translačním výzkumem: Laboratoře zabývající se zpracováním tkání, buněk, plazmy, séra nebo mozkomíšního moku, kde je rozhodující reprodukovatelnost mezi jednotlivými šaržemi a zachování integrity vzorků.
- Kvantitativní & Cílové týmy v MS Teams: Laboratoře provádějící přísné srovnávací studie, v nichž sonikátory s opakovaně použitelnými sondami představují riziko křížové kontaminace, které by mohlo ohrozit kvantifikaci peptidů s nízkou koncentrací.
- Hlavní zařízení & Operace s vysokou propustností: Skupiny, které současně zpracovávají více biologických replikátů a pro které je výhodné použití zařízení VialTweeter k sonikaci v uzavřených zkumavkách v blocích s více zkumavkami, což eliminuje nutnost čištění sondy, zkracuje dobu ruční práce a zachovává aseptické podmínky.
- Rodičovská schůzka & Výzkumníci zabývající se strukturálními proteiny: Výzkumníci, kteří potřebují šetrné zpracování s regulací teploty, aby zachovali labilní modifikace a maximalizovali pokrytí sekvence během lýzy a homogenizace buněk.
Sonikátor s více vzorky “VialTweeter” pro bezkontaktní přípravu vzorků z více uzavřených lahviček pro proteomiku
Přehled protokolu: Od tkání a buněk k peptidům připraveným pro MS
Široce používaný proteomický postup typu „bottom-up“, popsaný Wojtkiewiczem a kol., představuje spolehlivou a škálovatelnou metodu pro přípravu peptidových vzorků z různých biologických matric. Protokol, který vychází z 50–100 mg bleskově zmrazené tkáně nebo 1–20 milionů buněk, využívá technologii zachycování suspenzí (S-Trap™) k účinnému odstranění detergentů, solí a kontaminantů před enzymatickým štěpením.
Po lýze, kvantifikaci proteinů, redukci a alkylaci se vzorek okyselí a nanese na spinovou kolonu S-Trap™, kde proběhne štěpení trypsinem a LysC. Výsledné peptidy se eluují, vysuší a podrobí analýze LC-MS. Při použití na 50 mg lidské srdeční tkáně tento pracovní postup konzistentně poskytuje dostatečné množství peptidů pro 30–40 injekcí, přičemž v každém běhu identifikuje více než 4 000 jedinečných proteinů. Zatímco chemické postupy a čištění pomocí kolon jsou dobře definovány, úspěch celého postupu do značné míry závisí na počátečních krocích fyzického rozrušení tkáně a nakládání s DNA.
Protokol doporučuje použití ultrazvukového zařízení VialTweeter Multi-Tube Sonicator k rozrušení buněk a štěpení DNA pomocí ultrazvuku – Oba kroky jsou pro analýzu peptidů zásadní.
Přístroj VialTweeter provádí ultrazvukovou úpravu uzavřených zkumavek Eppendorf o objemu 1,0, 1,5 a 2,0 ml, stejně jako různých zkumavek NUNC
Ultrazvuková lýza buněk a tkání pro extrakci bílkovin
V proteomickém postupu typu „bottom-up“ představuje sonikace klíčový krok při lýze buněčných vzorků za účelem extrakce proteinů pro následnou analýzu pomocí hmotnostní spektrometrie. Po přidání SDS pufru pro lýzu buněk k buněčnému peletu jsou vzorky podrobeny ultrazvukovému zpracování pomocí sonikátoru VialTweeter Multi-Tube. Protokol používá 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky a stanoví provoz sonikátoru na 30 % výkonu v režimu 10 sekund zapnuto a 10 sekund vypnuto, a to ve 3 cyklech. Po 1 minutě čekání se cyklus opakuje ještě dvakrát. Vzorky se průběžně chladí ledem.
Tento proces nejenže napomáhá k rozrušení buněk, ale je také nezbytný zejména pro štěpení genomové DNA uvolněné během lýzy. Účinné štěpení DNA je klíčové pro snížení viskozity vzorku a zabránění ucpání kolon S-Trap™, čímž se zajistí optimální výtěžnost proteinů a spolehlivé následné štěpení peptidů.
Klíčová role ultrazvukového štěpení DNA
Jednou z nejčastějších poruch v pracovních postupech využívajících S-Trap™ je ucpání kolony, které je téměř výlučně způsobeno genomovou DNA s vysokou molekulovou hmotností uvolňovanou během homogenizace buněk nebo tkání. Nezměněná DNA výrazně zvyšuje viskozitu vzorku, zachycuje peptidy a blokuje mikroporézní sorbentní lože S-Trap™.
Ultrazvukové zpracování tento problém řeší mechanickým rozštěpením DNA na malé, rozpustné fragmenty. Díky použití řízené akustické energie zařízení VialTweeter účinně štěpí nukleové kyseliny, aniž by docházelo k nadměrnému zahřívání nebo k vnášení cizích nečistot. Toto snížení viskozity zajišťuje plynulé plnění vzorků, stálé průtokové rychlosti a nepřerušovanou kinetiku štěpení.
Optimalizované parametry sonikace pomocí zařízení VialTweeter
Tento protokol stanovuje vysoce reprodukovatelný postup sonikace, který je optimalizován s ohledem na zachování integrity biologických vzorků a kompatibilitu s následnými MS analýzami. U vzorků v mikrocentrifugačních zkumavkách o objemu 1,5 ml, při použití bezkontaktního blokového sonikátoru Hielscher VialTweeter, zajišťují následující parametry lýzu a optimální štěpení DNA při zachování struktury bílkovin:
- Amplituda: 30 % výkonu
- Cyklický režim: 10 sekund zapnuto / 10 sekund vypnuto
- Doba trvání: 3 cykly (10 s zapnuto / 10 s vypnuto) → 1 minuta odpočinku na ledu → opakovat ještě 2krát
- Regulace teploty: Vzorky se během zpracování ukládají na led, aby se zabránilo tepelné denaturaci a předčasné enzymatické aktivitě
Tento přístup založený na pulzní sonikaci zabraňuje lokálnímu přehřátí, minimalizuje oxidaci peptidů a zajišťuje rovnoměrné akustické působení na všechny lahvičky. Uzavřená trubková sestava navíc eliminuje nutnost čištění sondy mezi jednotlivými vzorky, čímž výrazně snižuje čas potřebný na ruční zásahy a variabilitu způsobenou obsluhou.
Hlavní výhody pro moderní proteomické pracovní postupy
Začlenění zařízení VialTweeter do vašeho proteomického postupu typu „bottom-up“ přináší řadu provozních i vědeckých výhod:
- Trvalá fragmentace DNA: Rovnoměrné dodávání akustické energie do všech lahviček zajišťuje reprodukovatelné snížení viskozity a zabraňuje kolísání při plnění S-Trap™ mezi jednotlivými šaržemi.
- Zachování labilních modifikací: Zpracování při nízké teplotě v ledové lázni chrání posttranslační modifikace (PTM) a zabraňuje agregaci proteinů vyvolané teplem během lýzy buněk.
- Zefektivnění následného zpracování: Lyzáty zpracované pomocí VialTweeteru lze přímo vyčistit odstředěním a kvantifikovat bez dalších kroků čištění, což urychluje postup k štěpení pomocí S-Trap™.
- Škálovatelnost & Flexibilita: Stejná nastavení sonikace platí jak pro tkáňové vzorky s vysokou komplexností, tak pro buněčné suspenze, což podporuje pracovní postupy v oblasti objevné proteomiky, cílené kvantifikace a glykoproteomiky. Sonikátory pro mikrotitrační destičky společnosti Hielscher umožňují snadné rozšíření na velké počty vzorků v mikrotitračních destičkách s více jamkami.
Bezkontaktní ultrazvukový přístroj Multi-Tube Sonicator VialTweeter lze provozovat v chladicích skříních
Ultrazvukové přístroje pro přípravu proteomických vzorků
Příprava vysoce kvalitních vzorků peptidů pro hmotnostní spektrometrii vyžaduje více než jen účinnou lýzu – Vyžaduje to přesnou kontrolu nad štěpením DNA, teplotou a prevencí kontaminace. Začleněním zařízení Hielscher VialTweeter do vašeho proteomického pracovního postupu typu „bottom-up“ můžete eliminovat ucpávání S-Trap™, zajistit reprodukovatelný výtěžek proteinů a udržet čistotu nezbytnou pro citlivé MS analýzy. Ať už zpracováváte lidskou tkáň, kultivované buňky nebo komplexní lyzáty, ultrazvukové blokové zpracování poskytuje spolehlivost, škálovatelnost a kontrolu procesu, které moderní proteomické laboratoře vyžadují.
Chcete-li zpracovávat větší počet vzorků, využijte modely Hielscherových fokuzovaných bezkontaktních ultrazvukových zařízení pro mikrotitrační destičky UIP400MTP a UIP550MTP! Zpracujte jakoukoli standardní destičku s více jamkami pro proteomiku s vysokou propustností!
Zpracování v uzavřené trubici vs. tradiční ultrazvukové přístroje se sondou
V minulosti se vědci při štěpení DNA spoléhali na ultrazvukové přístroje s přímým kontaktem. Ačkoli jsou tyto systémy účinné, přinášejí do proteomických pracovních postupů několik zásadních omezení:
- Riziko křížové kontaminace: Opakované použití sondy u více vzorků vede k přenosu aerosolu a způsobuje křížovou kontaminaci, která zkresluje kvantitativní výsledky hmotnostní spektrometrie.
- Ztráta vzorku: Přímé nanesení může vést k rozstřikování, odpařování a ulpívání cenných peptidů na povrchu sondy.
- Čištění: Důkladná dekontaminace sondy mezi jednotlivými cykly je časově náročná a často neúplná, což zhoršuje výsledky studií proteinů s nízkou koncentrací.
Sonikátor VialTweeter zpracovává vzorky výhradně v uzavřených mikrocentrifugačních zkumavkách. Tato konstrukce uzavřeného systému eliminuje kontakt sondy se vzorkem, zabraňuje tvorbě aerosolu a udržuje přísné aseptické podmínky během celého procesu homogenizace a lýzy. Pro laboratoře zpracovávající vysoce komplexní tkáňové lyzáty nebo více buněčných linií to znamená čistší data z hmotnostní spektrometrie, vyšší výtěžnost peptidů a spolehlivější biologické replikáty.
Přechod na přípravu vzorků s vysokou propustností v destičkách s více jamkami
S mikrotitračními ultrazvukovými přístroji modelů UIP400MTP a UIP550MTP, lze zpracování zkumavek snadno přizpůsobit pro vysoce výkonné zpracování vzorků v jakékoli standardní destičce s více jamkami.
Vícejamkový sonikátor destiček UIP400MTP pro vysoce výkonnou extrakci proteinů ze vzorků
Často kladené otázky týkající se sonikace při přípravě peptidových vzorků
Proč je před zpracováním peptidů pomocí technologie S-Trap™ nutné provést sonikaci?
Ultrazvukové ošetření je nezbytné k rozštěpení genomové DNA s vysokou molekulovou hmotností, která se uvolňuje při lýze buněk nebo tkání. Nezměněná DNA výrazně zvyšuje viskozitu vzorku, což může způsobit ucpání mikrokoloňky S-Trap™ a zachycení peptidů, čímž se výrazně sníží výtěžnost a kompatibilita s MS.
V čem spočívá zlepšení přípravy vzorků pomocí sonikátoru VialTweeter s blokem ve srovnání s tradičními sondovými sonikátory?
Na rozdíl od ultrazvukových zařízení s přímým kontaktem, která vyžadují pečlivé čištění mezi jednotlivými cykly a u nichž hrozí přenos aerosolů, zařízení VialTweeter zpracovává vzorky výhradně uvnitř uzavřených lahviček a mikrocentrifugačních zkumavek. Tato konstrukce s uzavřenými zkumavkami eliminuje křížovou kontaminaci, zabraňuje ztrátě vzorku a udržuje přísné aseptické podmínky během celé homogenizace a lýzy buněk.
Jaké jsou optimální parametry sonikace pro přípravu vzorků pro proteomiku?
U biologických vzorků, jako jsou buňky a tkáně, doporučený postup počítá s použitím ultrazvukového zařízení VialTweeter při 30 % výkonu s cyklem 10 sekund zapnuto / 10 sekund vypnuto, který se opakuje třikrát. Vzorky by měly být během zpracování uchovávány na ledu a v případě zpracování ≥5 milionů buněk by se cyklus měl opakovat ještě dvakrát. (viz Wojtkiewicz et al., 2021)
Co mám dělat, pokud se mi během vkládání vzorku ucpe kolona S-Trap™?
Ucpání kolony je obvykle způsobeno vysokou viskozitou DNA nebo nedostatečným vyčištěním. Chcete-li tento problém vyřešit, před pipetováním lyzát důkladně odstřeďte a zajistěte, aby byla DNA pomocí ultrazvuku dostatečně rozštěpena.
Jakým způsobem bezkontaktní sonikace přispívá k pracovním postupům v kvantitativní proteomice?
V kvantitativních studiích může i nepatrná křížová kontaminace mezi vzorky zkreslit měření peptidů s nízkým obsahem. Technologie VialTweeter, která umožňuje zpracování více zkumavek v uzavřeném systému, eliminuje nutnost zavádění sondy, zajišťuje reprodukovatelnost mezi jednotlivými šaržemi a zachovává integritu vzorků pro přesné srovnávací analýzy.
Jaký výtěžek bílkovin a hloubku MS mohu od tohoto protokolu očekávat?
Při použití 50 mg lidské srdeční tkáně nebo 5 milionů buněk poskytuje pracovní postup S-Trap™ obvykle dostatečné množství peptidů pro 30–50 injekcí do LC-MS, přičemž v každém běhu se konzistentně identifikuje více než 4 000 jedinečných proteinů. (viz Wojtkiewicz et al., 2021)
Literatura / Reference
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
- Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
- Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.
Společnost Hielscher Ultrasonics dodává výkonné bezkontaktní ultrazvukové přístroje pro přípravu vzorků a klinické analýzy. Ultrazvukový přístroj pro vícejamkové destičky UIP400MTP, přístroj VialTweeter, přístroj CupHorn a průtokový ultrazvukový přístroj GDmini2 zpracovávají vzorky bez jejich fyzického kontaktu.