Protokol pro proteomiku: Bezkontaktní sonikace zlepšuje přípravu peptidových vzorků pro MS

Proteomika typu bottom-up se stala základním kamenem moderního objevování biomarkerů, strukturní biologie a klinické diagnostiky. Štěpením proteinů na peptidy před analýzou hmotnostní spektrometrií (MS) mohou výzkumníci dosáhnout hlubšího pokrytí sekvence a spolehlivější kvantifikace. Příprava vysoce komplexních biologických vzorků pro MS však zůstává technicky náročná. Nedávné metodické pokroky ukazují, jak řízené ultrazvukové zpracování – konkrétně s bezkontaktním sonikátorem VialTweeter Multi-Tube a mikrodestičkovým sonikátorem UIP400MTP – může výrazně zefektivnit tento pracovní postup, zlepšit reprodukovatelnost a předejít běžným úzkým místům přístrojů.
Najděte podrobný protokol přípravy vzorků pro získání peptidů vhodné velikosti pro analýzu pomocí MS.

Kdo by měl používat bezkontaktní sonikaci pro přípravu peptidových vzorků?

• Laboratoře proteomiky bottom-up a objevného výzkumu: Výzkumníci připravující vysoce komplexní vzorky pro pracovní postupy LC-MS nebo MALDI, kteří vyžadují konzistentní získávání peptidů s vysokým výtěžkem napříč různými biologickými matricemi.
• Uživatelé S-Trap™ a suspenzního záchytu: Týmy spoléhající na přečištění na mikrokolonkách, které potřebují řízené smykové štěpení DNA, aby zabránily ucpávání kolonek a zajistily hladké nanášení vzorků a štěpení.
• Klinické a translační výzkumné skupiny: Laboratoře zpracovávající tkáně, buňky, plazmu, sérum nebo mozkomíšní mok, kde je zásadní reprodukovatelnost mezi šaržemi a integrita vzorků.
• Týmy kvantitativní a cílené MS: Laboratoře provádějící přísně srovnávací studie, u nichž sondové sonikátory přinášejí riziko křížové kontaminace, které by mohlo ohrozit kvantifikaci peptidů s nízkým zastoupením.
• Servisní laboratoře a vysokokapacitní provozy: Skupiny zpracovávající současně více biologických replikátů, kterým prospívá bloková sonikace více uzavřených zkumavek se zařízením VialTweeter, jež odstraňuje nutnost čištění sondy, zkracuje dobu manuální práce a udržuje aseptické podmínky.
• Výzkumníci v oblasti PTM a strukturních proteinů: Výzkumníci vyžadující šetrné zpracování s řízenou teplotou pro zachování labilních modifikací a maximalizaci pokrytí sekvence během lyze buněk a homogenizace.

Přehled protokolu: Od tkání a buněk k peptidům připraveným pro MS

Široce používaný pracovní postup proteomiky bottom-up popsaný autory Wojtkiewicz et al. poskytuje robustní, škálovatelnou metodu přípravy peptidových vzorků z různých biologických matric. Protokol, vycházející z 50–100 mg šokově zmrazené tkáně nebo 1–20 milionů buněk, integruje technologii suspenzního záchytu (S-Trap™) k účinnému odstranění detergentů, solí a kontaminantů před enzymatickým štěpením.
Po lyzi, kvantifikaci proteinů, redukci a alkylaci se vzorek okyselí a nanese na centrifugační kolonku S-Trap™, kde probíhá štěpení trypsinem/lysC. Výsledné peptidy se eluují, vysuší a podrobí analýze LC-MS. Při aplikaci na 50 mg lidské srdeční tkáně tento postup konzistentně poskytuje dostatek peptidů pro 30–40 nástřiků a identifikuje více než 4 000 unikátních proteinů na jeden běh. Ačkoli jsou chemie a přečištění na kolonce dobře definovány, úspěch celého postupu silně závisí na počátečních krocích fyzikální dezintegrace a zpracování DNA.
Protokol doporučuje použití sonikátoru VialTweeter Multi-Tube k lyzi buněk sonikací a smykovému štěpení DNA – oba kroky jsou pro analýzu peptidů zásadní.

Ultrazvuková lyze buněk a tkání pro extrakci proteinů

V pracovním postupu proteomiky bottom-up je sonikace klíčovým krokem lyze buněčných vzorků za účelem extrakce proteinů pro následnou analýzu hmotnostní spektrometrií. Po přidání lyzačního pufru s SDS k buněčné peletě jsou vzorky podrobeny ultrazvukovému zpracování pomocí sonikátoru VialTweeter Multi-Tube. Protokol používá mikrozkumavky o objemu 1,5 mL a předepisuje provoz sonikátoru při 30% výkonu po dobu 10 sekund zapnuto a 10 sekund vypnuto, opakovaně ve 3 cyklech. Po 1 minutě čekání se cyklus opakuje ještě dvakrát. Vzorky jsou nepřetržitě chlazeny ledem.
Tento proces nejen napomáhá dezintegraci buněk, ale je konkrétně nezbytný ke smykovému štěpení genomové DNA uvolněné během lyze. Účinné smykové štěpení DNA je zásadní pro snížení viskozity vzorku a zabránění ucpání kolonek S-Trap™, čímž zajišťuje optimální výtěžnost proteinů a spolehlivé následné štěpení na peptidy.

Klíčová role ultrazvukového smykového štěpení DNA

Jedním z nejčastějších selhání v postupech založených na S-Trap™ je ucpání kolonky, které je téměř výhradně způsobeno vysokomolekulární genomovou DNA uvolněnou během homogenizace buněk nebo tkání. Intaktní DNA dramaticky zvyšuje viskozitu vzorku, zachycuje peptidy a blokuje mikroporézní sorbentové lože S-Trap™.
Ultrazvukové zpracování tento problém řeší mechanickou fragmentací DNA na malé, rozpustné fragmenty. Aplikací řízené akustické energie VialTweeter účinně štěpí nukleové kyseliny smykem, aniž by vytvářel nadměrné teplo nebo vnášel cizí kontaminanty. Toto snížení viskozity zajišťuje hladké nanášení vzorku, konzistentní průtok kolonkou a nepřerušenou kinetiku štěpení.

Optimalizované parametry sonikace pro VialTweeter

Protokol stanovuje vysoce reprodukovatelný režim sonikace optimalizovaný z hlediska integrity biologických vzorků a kompatibility s následnou MS. Pro vzorek v mikrocentrifugačních zkumavkách o objemu 1,5mL při použití bezkontaktního blokového sonikátoru Hielscher VialTweeter zajišťují lyzi a optimální smykové štěpení DNA při zachování struktury proteinů následující parametry:

• Amplituda: 30% výkonu
• Průběh cyklu: 10 sekund ZAP / 10 sekund VYP
• Trvání: 3 cykly (10sec ZAP/10sec VYP) → 1minutová pauza na ledu → opakovat ještě 2krát
• Řízení teploty: Vzorky jsou během zpracování umístěny na ledu, aby se zabránilo tepelné denaturaci a předčasné enzymatické aktivitě

Tento přístup pulzní sonikace zabraňuje lokálnímu přehřátí, minimalizuje oxidaci peptidů a zajišťuje rovnoměrné akustické působení na všechny lahvičky. Uspořádání s uzavřenými zkumavkami navíc odstraňuje potřebu čištění sondy mezi vzorky, což drasticky zkracuje dobu manuální práce a snižuje variabilitu mezi operátory.

Klíčové výhody pro moderní pracovní postupy v proteomice

Začlenění zařízení VialTweeter do Vašeho postupu proteomiky bottom-up přináší řadu provozních a vědeckých výhod:

1. Konzistentní fragmentace DNA: Rovnoměrný přenos akustické energie do všech lahviček zajišťuje reprodukovatelné snížení viskozity a zabraňuje variabilitě mezi šaržemi při nanášení na S-Trap™.
2. Zachování labilních modifikací: Zpracování při nízké teplotě v ledové lázni chrání posttranslační modifikace (PTM) a zabraňuje teplem indukované agregaci proteinů během lyze buněk.
3. Zjednodušené následné zpracování: Lyzáty zpracované zařízením VialTweeter lze přímo vyčeřit centrifugací a kvantifikovat bez dalších kroků přečištění, což urychluje cestu ke štěpení na S-Trap™.
4. Škálovatelnost a flexibilita: Stejná nastavení sonikace platí pro vysoce komplexní tkáňové vzorky i buněčné suspenze, což podporuje pracovní postupy objevné proteomiky, cílené kvantifikace a glykoproteomiky. Mikrodestičkové sonikátory Hielscher umožňují snadné škálování na velký počet vzorků v multijamkových destičkách.

Literatura / Reference

• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
• Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
• Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.