Sonikace mikrodestiček v proteomice typu „shotgun“ – Aplikační poznámka

Proteomika typu „shotgun“ závisí na efektivní a reprodukovatelné přípravě vzorků, která umožňuje přeměnit komplexní biologický materiál na peptidy připravené pro analýzu metodou LC-MS/MS. Sonikátor pro mikrotitrační destičky UIP400MTP tento proces podporuje tím, že umožňuje standardizovanou a paralelní sonikaci vzorků s malým objemem, čímž pomáhá laboratořím zlepšit rozrušení, extrakci a opětovné rozpuštění v pracovních postupech založených na mikrotitračních destičkách. Tato aplikační poznámka popisuje, jak lze přístroj UIP400MTP integrovat do přípravy proteomických vzorků, a to na příkladu laboratorně ověřeného postupu s extracelulárními vezikuly, který byl publikován v rámci studií PLA2G12A/Th17.

Sonikace mikrodestiček pro reprodukovatelnější proteomiku typu „shotgun“

Pro výzkumníky v oblasti proteomiky je reprodukovatelná příprava vzorků klíčová pro získání vysoce kvalitních dat z LC-MS/MS. Sonikátor pro mikrodestičky UIP400MTP umožňuje standardizovanou, paralelní sonikaci v pracovních postupech využívajících mikrodestičky i v postupech s malými objemy a vysokou propustností.

Je to obzvláště užitečné pro laboratoře, které se zabývají:

• Rozsáhlé soubory vzorků, které vyžadují jednotné zpracování v mnoha jamkách
• Materiál s omezeným množstvím vstupních vzorků, u kterého je třeba minimalizovat ztráty vzorků a variabilitu
• Vzorky s vysokým obsahem lipidů, jako jsou například extracelulární vezikuly
• Složité biologické přípravky, které vyžadují účinné rozrušení, extrakci nebo opětovné rozpuštění
• Srovnávací proteomika typu „shotgun“, u níž je zásadní reprodukovatelnost napříč podmínkami a opakovanými měřeními

Díky začlenění sonikace v mikrodestičkách před štěpením mohou výzkumníci zlepšit připravenost vzorků pro:

• Extrakce a opětovná solubilizace bílkovin
• Trávení trypsinem/Lys-C
• Získávání dat pomocí Nano-LC/MS/MS
• Kvantitativní proteomická analýza v následných fázích

 

Rozšiřujte přípravu vzorků pro proteomiku s jistotou!
Zjistěte, jak sonikace v mikrodestičkách pomáhá omezit variabilitu při ruční práci, zlepšit rozrušení vzorků a připravit komplexní biologické vzorky pro spolehlivou analýzu metodou LC-MS/MS.

Žádost o informace


E-mailová adresa (vyžadováno)


Produkt nebo oblast zájmu



Souhlasím se Zásadami ochrany osobních údajů









Získat informace

Ultrazvuková léčba v mikrodestičkách může přinést následující výhody:

• Základní proteomická pracoviště
• Výzkumné laboratoře v oblasti elektromobilů
• Laboratoře imunologie a buněčné biologie
• Skupiny zabývající se translačním výzkumem
• Týmy v oblasti přírodních věd, které rozšiřují své činnosti od přípravy jednotlivých vzorků až po pracovní postupy s vyšší propustností

Příprava vzorků s vysokou propustností pro analýzu proteomu extracelulárních vezikul

Co je to „shotgun proteomika“?

Proteomika typu „shotgun“ se stala klíčovou analytickou strategií pro charakterizaci komplexních biologických vzorků, od lyzátů celých buněk a tkáňových extraktů až po purifikované organely, extracelulární vezikuly a klinické vzorky s malým množstvím výchozího materiálu. Jeho hlavní přednost spočívá ve spojení štěpení proteinů, vysokorozlišovací kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní spektrometrií a výpočetní analýzy pro odvození proteinů z peptidů. Kvalita konečného proteomického datového souboru je však určena již dlouho předtím, než se vzorek dostane do hmotnostního spektrometru. Účinné rozrušení vzorku, solubilizace proteinů, odstranění rušivých látek, reprodukovatelné enzymatické štěpení a spolehlivá izolace peptidů – to vše má rozhodující vliv na hloubku pokrytí a spolehlivost kvantitativních výsledků.
Pro výzkumníky v oblasti proteomiky a laboratoře zabývající se přírodními vědami, které pracují s omezeným množstvím nebo vzácnými vzorky, představuje příprava vzorků často úzké místo.

Výzva, kterou představují extracelulární vezikuly v proteomice

Například extracelulární vezikuly (EV) představují obzvláště náročnou třídu vzorků. Jedná se o membránou ohraničené, na lipidy bohaté částice v nanoměřítku s relativně nízkým výtěžkem bílkovin a vysokým rizikem přenosu lipidů, solí, detergentů, sérových bílkovin a dalších složek matrice. Tyto vlastnosti mohou narušovat účinnost štěpení, chromatografický výkon, stabilitu při elektrospreji a identifikaci peptidů. Pracovní postup přípravy vzorků pro proteomiku EV proto musí být dostatečně účinný, aby rozbil struktury vezikul a rozpustil obsažené proteiny, a zároveň musí zůstat kompatibilní s následným enzymatickým štěpením a analýzou LC-MS/MS.
V této souvislosti představuje ultrazvuková обробka kompatibilní s mikrodestičkami praktický přístup k reprodukovatelnému a paralelnímu zpracování vzorků. Modely ultrazvukových sonikátorů Hielscher pro mikrodestičky UIP400MTP (400 W) a UIP550MTP (550 W) jsou určeny pro sonikaci vzorků v mikrodestičkách a nádobách s malým objemem a podporují pracovní postupy s vyšší propustností než konvenční sonikátory s jednou sondou. Pro proteomické laboratoře je tento formát atraktivní, protože může snížit variabilitu způsobenou ruční manipulací, zlepšit paralelní zpracování více vzorků a přirozeněji se integrovat do procesů přípravy vzorků založených na destičkách.

Příkladný pracovní postup

Nedávný proteomický postup zaměřený na extracelulární vezikuly v rámci biologie Th17 buněk řízených PLA2G12A představuje užitečný, v laboratoři ověřený příklad toho, jak lze sonikátor pro mikrodestičky UIP400MTP začlenit do přípravy vzorků pro proteomiku typu „shotgun“. V této sérii studií byly vzorky EV zpracovány pro proteomovou analýzu pomocí ošetření metanolem, sonikace přístrojem UIP400MTP, odstředění, sušení, štěpení trypsinem/Lys-C a nano-flow LC s tandemovou hmotnostní spektrometrií s vysokým rozlišením. Tato biologická práce byla nejprve zveřejněna jako preprint na bioRxiv a následně publikována v časopise Cell Reports, kde proteomická analýza pomohla charakterizovat, jak PLA2G12A mění proteiny obsažené v EV v kontextu patogenních reakcí T-buněk.

Vícejamkový sonikátor destiček UIP400MTP

Proč sonikace mikrodestiček?
Přístroj UIP400MTP umožňuje standardizovanou paralelní sonikaci vzorků malého objemu. To je užitečné v případech, kdy je důležitá reprodukovatelnost, malé množství vzorku a vysoká průchodnost více vzorků.

Kontrolní seznam pro kontrolu kvality

• Ověřte, zda je množství bílkovin v EV ve všech vzorcích stejné.
• Používejte náhodně rozložené nebo vyvážené uspořádání zpracování vzorků.
• Objem metanolu, dobu sonikace, dobu sušení a objem rozkladu udržujte na stejné úrovni.
• Sledujte výtěžek peptidů a identifikaci celkových bílkovin.
• Zkontrolujte míru nevyříznutých úseků a rozložení délky peptidů.
• Zkontrolujte tvar chromatografického píku a reprodukovatelnost retenčního času.
• Vložte prázdná místa, abyste mohli sledovat přenos.
• Pro rozsáhlejší studie použijte sdružené vzorky pro kontrolu kvality.
• Vypočítejte koeficient variability replik.
• K identifikaci vlivů šarže nebo odlehlých vzorků použijte metodu PCA nebo podobné metody.

Doporučení týkající se vedení zápisu

Při zveřejnění nebo dokumentaci tohoto pracovního postupu uveďte množství vstupního EV, formát destičky, objem metanolu, amplitudu a dobu sonikace přístrojem UIP400MTP, podmínky odstřeďování, způsob sušení, rozkladný pufr, koncentraci enzymu, dobu rozkladu, podmínky okyselení, platformu LC-MS/MS, režim sběru dat, verzi softwaru, databázi, prahovou hodnotu FDR, metodu normalizace a statistický pracovní postup.
Všechny mikrotitrační ultrazvukové přístroje značky Hielscher automaticky zaznamenávají důležité parametry procesu, jako jsou amplituda, doba sonikace a teplota, včetně data a času, do souboru ve formátu CSV na integrované SD kartě. Zaznamenávání dat pro účely reprodukovatelnosti a kontroly kvality nikdy nebylo snazší!

Podrobný popis studie: Proteomika EV Shotgun v rámci studie PLA2G12A

Studie PLA2G12A představuje konkrétní příklad využití přístroje UIP400MTP v rámci proteomického workflow typu „shotgun“. Biologickou otázkou bylo, jak sekretovaná fosfolipáza PLA2G12A modifikuje extracelulární vezikuly pocházející z buněk Th17 a tím ovlivňuje diferenciaci patogenních T-buněk. Autoři prokázali, že PLA2G12A působí na membrány extracelulárních vezikul (EV) a vede k tvorbě lysofosfolipidů, včetně 1-oleoyl-lysofosfatidylethanolaminu, a že následná signalizace kyseliny lysofosfatidové zprostředkovaná LPA2 přispívá k diferenciaci buněk Th17. Kromě lipidové signalizace se studie zabývaly také obsahem EV, včetně obsahu RNA a proteinů, čímž se proteomika typu „shotgun“ stala důležitou součástí strategie charakterizace.
V rámci postupu přípravy EV byly buňky Th17 kultivovány v médiu obsahujícím fetální bovinní sérum zbavené exozomů. Kultivační supernatanty byly nejprve odstředěny za účelem odstranění buněk, filtrovány přes 0,22 µm filtr, koncentrovány pomocí ultrafiltrace/ultracentrifugace, promyty, resuspendovány v PBS a kvantifikovány pomocí BCA testu na proteiny. Tento předběžný krok přípravy EV zajistil, že do proteomického postupu mohlo být přeneseno definované množství materiálu EV, ekvivalentní danému množství bílkovin.
Pro proteomickou analýzu metodou „shotgun“ autoři použili vzorky EV odpovídající 5 µg proteinových ekvivalentů. Tyto vzorky byly vysušeny v PCR zkumavkách a bylo k nim přidáno 25 µL metanolu. Následně byly vzorky sonikovány po dobu 3 minut pomocí sonikátoru pro mikrotitrační destičky UIP400MTP. Po sonikaci byly vzorky odstředěny při 4 °C po dobu 20 minut při 19 000 × g. Po odebrání 20 µl supernatantu byly vzorky odstředěny do sucha. Proteiny byly poté rozpuštěny sonikací ve 4 µL roztoku trypsinu/Lys-C o koncentraci 100 ng/µL v 50 mM roztoku hydrogenuhličitanu amonného. Trávení probíhalo po dobu 2 hodin při 37 °C za míchání při 300 ot./min. Trávenina byla okyselena 1 µl 1,25% kyseliny trifluoroctové a podrobena nano-flow LC s vysokým rozlišením a tandemovou hmotnostní spektrometrií.
Tento pracovní postup zdůrazňuje několik užitečných principů pro proteomiku EV s malým množstvím vstupního materiálu. Za prvé, vstupní množství bylo normalizováno na proteinový ekvivalent, což je důležité při porovnávání EV z různých genotypů nebo při různých způsobech ošetření. Za druhé, před sonikací byl použit methanol, který podporuje rozrušení a extrakci a zároveň umožňuje vyhnout se použití detergentních systémů, které by mohly zkomplikovat analýzu LC-MS/MS. Za třetí, krok sonikace byl krátký a standardizovaný, což je v souladu s paralelním zpracováním vzorků. Za čtvrté, trypsinové/Lys-C štěpení bylo provedeno ve velmi malém objemu, čímž se snížilo ředění a podpořila se výtěžnost peptidů při malém množství vstupního materiálu. A konečně, přímý přechod od štěpení k okyselení a LC-MS/MS minimalizoval zbytečné manipulační kroky.
Metoda LC-MS/MS v následném kroku využívala separaci s reverzní fází v nano-průtoku spojenou s hmotnostním spektrometrem Q-Exactive HF Orbitrap. Vzorky byly zachyceny na předkoloně C18 a následně separovány na analytické koloně s vnitřním průměrem 50 µm při průtoku 200 nL/min a teplotě 40 °C. Gradient probíhal od nízkého obsahu organického rozpouštědla k 35 % rozpouštědla B v průběhu 60 minut, načež následovalo propláchnutí vysokým obsahem organického rozpouštědla a reekvilibrace. Sběr dat MS byl prováděn v režimu pozitivních iontů s využitím datově nezávislého sběru (DIA) s kolizní disociací s vyšší energií. Surové soubory DIA byly analyzovány pomocí softwaru DIA-NN 1.8 s knihovnou spekter předpovězených in silico.