Sonikace v mikrodestičkách v shotgun proteomice – aplikační poznámka

Shotgun proteomika závisí na účinné a reprodukovatelné přípravě vzorků, která převádí komplexní biologický materiál na peptidy připravené pro LC-MS/MS. Sonikátor pro mikrodestičky UIP400MTP tento proces podporuje tím, že umožňuje standardizovanou paralelní sonikaci vzorků malého objemu, a pomáhá tak laboratořím zlepšit dezintegraci, extrakci a resolubilizaci v pracovních postupech založených na mikrodestičkách. Tato aplikační poznámka popisuje, jak lze UIP400MTP začlenit do přípravy proteomických vzorků, přičemž jako laboratorně ověřený příklad využívá publikovaný pracovní postup pro extracelulární vezikuly ze studií PLA2G12A/Th17.

Sonikace v mikrodestičkách pro reprodukovatelnější shotgun proteomiku

Pro výzkumníky v oblasti proteomiky je reprodukovatelná příprava vzorků zásadní pro získání vysoce kvalitních dat LC-MS/MS. Sonikátor pro mikrodestičky UIP400MTP podporuje standardizovanou paralelní sonikaci v pracovních postupech založených na destičkách a v pracovních postupech s malými objemy / vysokou kapacitou zpracování vzorků.

Je obzvláště užitečný pro laboratoře pracující s:

• Velkými sadami vzorků, které vyžadují konzistentní zpracování v mnoha jamkách
• Materiálem s omezeným vstupním množstvím, u něhož je nutné minimalizovat ztráty vzorku a variabilitu
• Vzorky bohatými na lipidy, jako jsou extracelulární vezikuly
• Komplexními biologickými preparáty, které vyžadují účinnou dezintegraci, extrakci nebo resolubilizaci
• Srovnávací shotgun proteomikou, kde je zásadní reprodukovatelnost napříč podmínkami a replikáty

Začleněním sonikace v mikrodestičkách před štěpením mohou výzkumníci zlepšit připravenost vzorků pro:

• Extrakci a resolubilizaci proteinů
• Štěpení trypsinem/Lys-C
• Akvizici nano-LC/MS/MS
• Kvantitativní navazující proteomickou analýzu

Sonikace v mikrodestičkách může být přínosem pro:

• Centrální proteomická pracoviště
• Laboratoře výzkumu EV
• Laboratoře imunologie a buněčné biologie
• Skupiny translačního výzkumu
• Týmy z oblasti věd o živé přírodě, které přecházejí od přípravy jednotlivých vzorků k vysokokapacitnějším pracovním postupům

Vysokokapacitní příprava vzorků pro proteomovou analýzu extracelulárních vezikul

Co je shotgun proteomika?

Shotgun proteomika se stala ústřední analytickou strategií pro charakterizaci komplexních biologických vzorků, od celobuněčných lyzátů a tkáňových extraktů až po purifikované organely, extracelulární vezikuly a klinické vzorky s nízkým vstupním množstvím. Její hlavní síla spočívá v propojení štěpení proteinů, vysokorozlišovací kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní spektrometrií a výpočetní inference od peptidů k proteinům. Kvalita výsledného proteomového datového souboru je však určena dlouho předtím, než vzorek dorazí do hmotnostního spektrometru. Účinná dezintegrace vzorku, solubilizace proteinů, odstranění interferujících látek, reprodukovatelné enzymatické štěpení a robustní výtěžnost peptidů jsou rozhodující pro hloubku pokrytí a kvantitativní spolehlivost.
Pro výzkumníky v oblasti proteomiky a laboratoře věd o živé přírodě, které pracují s omezenými nebo vzácnými vzorky, je příprava vzorků často úzkým hrdlem.

Extracelulární vezikuly jako výzva v proteomice

Například extracelulární vezikuly (EV) představují obzvláště náročnou třídu vzorků. Jde o membránově ohraničené, na lipidy bohaté částice nanometrové velikosti s relativně nízkým výtěžkem proteinů a vysokým potenciálem přenosu lipidů, solí, detergentů, sérových proteinů a dalších složek matrice. Tyto vlastnosti mohou narušovat účinnost štěpení, chromatografický výkon, stabilitu elektrospreje a identifikaci peptidů. Pracovní postup přípravy pro proteomiku EV proto musí být dostatečně silný, aby rozrušil struktury vezikul a solubilizoval proteinový náklad, a přitom zůstal kompatibilní s navazujícím enzymatickým štěpením a analýzou LC-MS/MS.
V této souvislosti nabízí ultrazvukové zpracování kompatibilní s mikrodestičkami praktický přístup k reprodukovatelnému paralelizovanému zpracování vzorků. Modely sonikátorů pro mikrodestičky Hielscher UIP400MTP (400 W) a UIP550MTP (550 W) jsou určeny pro sonikaci vzorků ve vícejamkových destičkách a nádobách malého objemu a podporují vysokokapacitnější pracovní postupy než konvenční sonikátory s jednou sondou. Pro proteomické laboratoře je tento formát atraktivní, protože může snížit variabilitu způsobenou ruční manipulací, zlepšit paralelní ošetření více vzorků a přirozeněji se začlenit do linek přípravy vzorků založených na destičkách.

Příkladný pracovní postup

Nedávný pracovní postup proteomiky extracelulárních vezikul v biologii buněk Th17 řízené PLA2G12A poskytuje užitečný, laboratorně ověřený příklad toho, jak lze sonikátor pro mikrodestičky UIP400MTP začlenit do přípravy vzorků pro shotgun proteomiku. V této sérii studií byly vzorky EV zpracovány pro proteomovou analýzu pomocí ošetření methanolem, sonikace přístrojem UIP400MTP, centrifugace, sušení, štěpení trypsinem/Lys-C a nanoprůtokové LC s vysokorozlišovací tandemovou MS. Biologickou práci publikovali v roce 2026 Mochizuki-Ono a kolegové, přičemž proteomická analýza pomohla charakterizovat, jak PLA2G12A mění proteiny nákladu EV v kontextu patogenních T-buněčných odpovědí.

Sonikátor pro vícejamkové destičky UIP400MTP

Proč sonikace v mikrodestičkách?
UIP400MTP umožňuje standardizovanou paralelní sonikaci vzorků malého objemu. To je užitečné, když záleží na reprodukovatelnosti, nízkém vstupním množství vzorku a kapacitě zpracování více vzorků.


Kontrolní seznam řízení kvality

• Ověřte stejné vstupní množství EV v ekvivalentu proteinu u všech vzorků.
• Používejte randomizovaná nebo vyvážená rozvržení zpracování vzorků.
• Udržujte konzistentní objem methanolu, dobu sonikace, dobu sušení a objem pro štěpení.
• Sledujte výtěžek peptidů a celkový počet identifikovaných proteinů.
• Kontrolujte míru vynechaných štěpení a distribuci délek peptidů.
• Zkontrolujte tvar chromatografických píků a reprodukovatelnost retenčních časů.
• Zařaďte slepé vzorky ke sledování přenosu (carryover).
• U rozsáhlejších studií používejte směsné (pooled) QC vzorky.
• Vyhodnoťte variační koeficient replikátů.
• K identifikaci šaržových efektů nebo odlehlých vzorků použijte PCA nebo příbuzné metody.

Doporučení pro protokolování

Při publikování nebo dokumentování tohoto pracovního postupu uveďte vstupní množství EV, formát destičky, objem methanolu, amplitudu a dobu sonikace UIP400MTP, podmínky centrifugace, metodu sušení, pufr pro štěpení, koncentraci enzymu, dobu štěpení, podmínky okyselení, platformu LC-MS/MS, režim akvizice, verzi softwaru, databázi, prahovou hodnotu FDR, metodu normalizace a statistický postup.
Všechny sonikátory pro mikrodestičky Hielscher automaticky zaznamenávají důležité procesní parametry, jako je amplituda, doba sonikace a teplota, s datem a časovým razítkem jako soubor CVS na integrovanou SD kartu. Protokolování dat pro reprodukovatelnost a řízení kvality nebylo nikdy snazší!

Studie podrobně: shotgun proteomika EV ve studii PLA2G12A

Studie PLA2G12A poskytuje konkrétní příklad použití UIP400MTP v pracovním postupu shotgun proteomiky. Biologickou otázkou bylo, jak secernovaná fosfolipáza PLA2G12A modifikuje extracelulární vezikuly pocházející z buněk Th17, a tím ovlivňuje patogenní diferenciaci T-buněk. Autoři prokázali, že PLA2G12A působí na membrány EV za vzniku lysofosfolipidů, včetně 1-oleoyl-lysofosfatidylethanolaminu, a že navazující signalizace kyseliny lysofosfatidové prostřednictvím LPA2 přispívá k diferenciaci Th17. Kromě lipidové signalizace studie zkoumaly také náklad EV, včetně obsahu RNA a proteinů, díky čemuž se shotgun proteomika stala důležitou součástí charakterizační strategie.
V pracovním postupu přípravy EV byly buňky Th17 kultivovány v médiu obsahujícím fetální bovinní sérum zbavené exozomů. Supernatanty kultur byly nejprve centrifugovány k odstranění buněk, přefiltrovány přes 0,22 µm filtr, zakoncentrovány ultrafiltrací/ultracentrifugací, promyty, resuspendovány v PBS a kvantifikovány pomocí proteinového stanovení BCA. Tato předcházející příprava EV zajistila, že do proteomického pracovního postupu bylo možné převést definované množství materiálu EV v ekvivalentu proteinu.
Pro shotgun proteomickou analýzu autoři použili vzorky EV odpovídající 5 µg ekvivalentu proteinu. Tyto vzorky byly vysušeny v PCR zkumavkách a bylo k nim přidáno 25 µL methanolu. Vzorky byly poté sonikovány po dobu 3 minut pomocí sonikátoru pro mikrodestičky UIP400MTP. Po sonikaci byly vzorky centrifugovány při 4°C po dobu 20 minut při 19 000 × g. Po odebrání 20 µL supernatantu byly vzorky centrifugovány do sucha. Proteiny byly poté rozpuštěny sonikací ve 4 µL roztoku trypsinu/Lys-C o koncentraci 100 ng/µL v 50 mM hydrogenuhličitanu amonném. Štěpení probíhalo 2 hodiny při 37°C za třepání při 300 rpm. Štěp byl okyselen 1 µL 1,25% kyseliny trifluoroctové a podroben nanoprůtokové LC s vysokorozlišovací tandemovou hmotnostní spektrometrií.
Tento pracovní postup ilustruje několik užitečných principů pro proteomiku EV s nízkým vstupním množstvím. Zaprvé byl vstup normalizován podle ekvivalentu proteinu, což je důležité při srovnávání EV z různých genotypů nebo ošetření. Zadruhé byl před sonikací použit methanol, který podporuje dezintegraci a extrakci a zároveň umožňuje vyhnout se detergentním systémům, jež mohou komplikovat LC-MS/MS. Zatřetí byl krok sonikace krátký a standardizovaný, což je kompatibilní s paralelním zpracováním vzorků. Začtvrté bylo štěpení trypsinem/Lys-C provedeno ve velmi malém objemu, což snižuje ředění a podporuje výtěžnost peptidů při nízkém vstupním množství. Nakonec přímý přechod od štěpení k okyselení a LC-MS/MS minimalizoval zbytečné manipulační kroky.
Navazující metoda LC-MS/MS využívala nanoprůtokovou separaci s reverzní fází spojenou s hmotnostním spektrometrem Q-Exactive HF Orbitrap. Vzorky byly zachyceny na předkoloně C18 a poté separovány na analytické koloně s vnitřním průměrem 50 µm při 200 nL/min a 40°C. Gradient probíhal od nízkého podílu organického rozpouštědla do 35% rozpouštědla B během 60 minut, následovalo promytí vysokým podílem organické složky a opětovná ekvilibrace. Akvizice MS probíhala v režimu kladných iontů s využitím akvizice nezávislé na datech s disociací indukovanou srážkami s vyšší energií. Surové soubory DIA byly analyzovány pomocí DIA-NN 1.8 s in silico predikovanou spektrální knihovnou.