Deparafinizace a extrakce proteinů z FFPE

Usnadněte extrakci proteinů z řezů tkání fixovaných formalínem a zalitých v parafínu (FFPE) pomocí optimalizované kombinace deparafinizace, solubilizace a sonikace s víceeprouvetovým ultrazvukovým přístrojem VialTweeter. Tento protokol podporuje navazující proteomiku založenou na hmotnostní spektrometrii a je kompatibilní s postupy přečištění SP3 a enzymatického štěpení.

Tento SOP je určen pro laboratorní personál zabývající se proteomickou analýzou vzorků tkání FFPE s využitím vysoce výkonné sonikace. Je optimalizován pro až deset vzorků FFPE zpracovávaných paralelně pomocí víceeprouvetového sonikátoru VialTweeter.

Protokol: Extrakce proteinů ze vzorků FFPE pomocí přístroje VialTweeter

Materiály a činidla

Činidla

• Xylen (histologické čistoty)
• Ethanol (absolutní 96%)
• Lyzační pufr:

6 M guanidinhydrochlorid
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (tris(2-karboxyethyl)fosfin)
40 mM CAA (2-chloracetamid)

• Inhibitor proteáz (volitelně; např. cOmplete™ mini EDTA-free)

Vybavení

• Víceeprouvetový ultrazvukový přístroj VialTweeter
• Mikrocentrifugační zkumavky 1,5 mL nebo 2,0 mL s nízkou vazebností
• Topný blok nebo inkubátor (nastavení 95°C a 80°C)
• Mikrocentrifuga
• Termomixér (volitelně, ale doporučeno)

Vstupní vzorek

• 1–2 řezy tkáně FFPE o tloušťce 10 µm na vzorek (tj. na vialku)

NEBO

• Celkem ~100 µg tkáně na vzorek (tj. na vialku)

Poznámka: Pro mikrotomii používejte nové čepele, abyste minimalizovali kontaminaci zbytky parafínu.

Postup

1. Deparafinizace
   1. Přeneste řezy FFPE do mikrocentrifugačních zkumavek s nízkou vazebností.
   2. Přidejte 1 mL xylenu a krátce promíchejte na vortexu.
   3. Inkubujte 10 minut při pokojové teplotě.
   4. Centrifugujte při 14 000 × g po dobu 2 minut; supernatant odstraňte.
   5. Promytí xylenem zopakujte ještě jednou (kroky 2–4).
   6. Promyjte pelet 1 mL 96% ethanolu, promíchejte na vortexu a poté centrifugujte při 14 000 × g po dobu 2 minut. Supernatant odstraňte.
   7. Promytí ethanolem zopakujte ještě jednou (celkem 2 promytí ethanolem).
   8. Pelet sušte na vzduchu 10 minut při pokojové teplotě s otevřenými víčky, aby se odpařil zbytkový ethanol.
2. Extrakce proteinů a sonikace
   1. Ke každému suchému peletu přidejte 200 µL lyzačního pufru.

      Poznámka: Přestože sonikátor pojme až 1 mL, pro navazující zpracování je optimální 200 µL.

   2. Promíchejte na vortexu nebo jemným pipetováním.
3. První tepelná inkubace
   1. Inkubujte zkumavky při 95 °C po dobu 30 min za třepání při 400 rpm pomocí termomixéru nebo topného bloku.
   2. Nechte vzorky 5 min vychladnout při pokojové teplotě.
4. První sonikace s přístrojem VialTweeter
   1. Vložte zkumavky do přístroje VialTweeter.
   2. Nastavte VialTweeter UP200St na níže uvedené hodnoty a sonikujte.
Nastavení sonikátoru
• Nastavte amplitudu (A) na 100%
• Nastavte pulzní režim (C) na 100%
• Časovač period (Period Clock): zapnuto
• Doba zapnutí (On Time): 60s
• Doba vypnutí (Off Time): 30s
• Mezní hodnota (Limit Value): 15 min (odpovídá 10 cyklům)
(Poznámka k výpočtu: (60 s zapnuto + 30 s vypnuto) × 10 cyklů = 900 s = 15 min)
5. Druhá tepelná inkubace
   Vyjměte zkumavky a znovu inkubujte při 95 °C po dobu 15 min, 400 rpm.
6. Druhá sonikace
   Zopakujte sonikaci v přístroji VialTweeter se stejným nastavením (viz výše) po dalších 10 cyklů (celkem 15 min).
7. Vyčiření lyzátu
   1. Centrifugujte vzorky při 13 000 × g po dobu 10 min při 23°C (pokojová teplota).
   2. Opatrně odeberte supernatant do nové 2,0 mL zkumavky Eppendorf Safe-lock. Dejte pozor, abyste nenarušili pelet.
8. Navazující zpracování
   Lyzát je nyní připraven k přečištění SP3 a enzymatickému štěpení.

Poznámky a osvědčené postupy

1. Riziko přehřátí během sonikace je zmírněno naprogramovaným cyklováním ZAP/VYP.
2. Po sonikaci nepoužívejte vortex, abyste zabránili agregaci proteinů.

Likvidace odpadu a bezpečnost

Níže uvedená tabulka vám poskytne představu o přibližné kapacitě zpracování našich laboratorních ultrazvukových přístrojů: