Deparafinizace a extrakce proteinů z FFPE

Usnadněte extrakci proteinů z tkáňových řezů zalitých v parafínu (FFPE) fixovaných ve formalínu pomocí optimalizované kombinace deparafinizace, solubilizace a sonikace pomocí vícetrubicového ultrazvuku VialTweeter. Tento protokol podporuje proteomiku založenou na downstream hmotnostní spektrometrii a je kompatibilní s pracovními postupy čištění SP3 a enzymatického rozkladu.

Tento SOP je určen pro laboratorní pracovníky zabývající se proteomickou analýzou vzorků tkáně FFPE pomocí vysoce účinné sonikace. Je optimalizován až pro deset vzorků FFPE zpracovaných paralelně pomocí VialTweeter Multi-Tube Sonicator.

Protokol: Extrakce proteinů ze vzorků FFPE pomocí VialTweeteru

Materiály a činidla

Činidla

• Xylen (histologický stupeň)
• Etanol (absolutní 96%)
• Lýzní pufr:

6 M guanidin hydrochlorid
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (Tris(2-karboxyethyl)fosfan)
40 mM CAA (2-chloracetamid)

• Inhibitor proteázy (volitelný; např. cOmplete™ mini EDTA-free)

Vybavení

• VialTweeter Multi-Tube Ultrasonicator
• Mikrocentrifugační zkumavky o objemu 1,5 ml nebo 2,0 ml s nízkou vazbou
• Tepelný blok nebo inkubátor (nastavení 95 °C a 80 °C)
• Mikrocentrifuga
• Termomixér (volitelný, ale doporučený)

Vzorový vstup

• 1–2 sekce po 10 μm silné FFPE tkanině na vzorek (tj. na lahvičku)

nebo

• Celkem ~100 μg tkáně na vzorek (tj. na lahvičku)

Poznámka: Pro mikrotomii používejte čerstvé čepele, abyste minimalizovali kontaminaci parafínovými nečistotami.

Procedura

1. deparafinizace
   1. Přeneste FFPE sekce do mikrocentrifugačních zkumavek s nízkou vazbou.
   2. Přidejte 1 ml xylenu, krátce protřepejte.
   3. Inkubujte 10 minut při pokojové teplotě.
   4. Odstřeďujte při 14 000 × g po dobu 2 minut; zahodit supernatant.
   5. Opakujte xylenové mytí ještě jednou (kroky 2–4).
   6. Peletu promyjte 1 ml 96% ethanolu, vírem, poté odstřeďujte při 14,000 × g po dobu 2 minut. Zahoďte supernatant.
   7. Opakujte proplach etanolem ještě jednou (celkem 2 promytí etanolem).
   8. Pelety sušte na vzduchu po dobu 10 minut při pokojové teplotě s otevřenými víčky, aby se odpařil zbytkový ethanol.
2. Extrakce proteinů a sonikace
   1. Do každé suché pelety přidejte 200 μl lyzačního pufru.
      Poznámka: Přestože sonikátor pojme až 1 ml, 200 μl je optimální pro následné zpracování.

   2. Míchejte vírováním nebo jemným pipetováním.
3. První termální inkubace
   1. Zkumavky se inkubují při 95 °C po dobu 30 minut, s mícháním při 400 otáčkách za minutu pomocí termomixéru nebo tepelného bloku.
   2. Nechte vzorky vychladnout při pokojové teplotě po dobu 5 minut.
4. První sonikace s VialTweeter
   1. Umístěte trubice do VialTweeteru.
   2. Nastavte VialTweeter UP200St na níže uvedené hodnoty a sonicate.
Nastavení Sonicator
• Nastavte amplitudu (A) na 100 %
• Nastavte režim pulzace (C) na 100 %
• Periodické hodiny: Zapnuto
• Včas: 60s
• Doba vypnutí: 30s
• Limitní hodnota: 15 min (odpovídá 10 cyklům)
(Poznámka k výpočtu: (60 s zapnuto + 30 s vypnuto) × 10 cyklů = 900 s = 15 min)
5. Druhá termální inkubace
   Vyjměte zkumavky a znovu inkubujte při 95 °C po dobu 15 minut, 400 otáček za minutu.
6. Druhá sonikace
   Opakujte sonikaci na VialTweeter pomocí stejného nastavení (jako výše) po dalších 10 cyklů (celkem 15 minut).
7. Čiření lyzátu
   1. Vzorky se odstřeďují při teplotě 13 000 × g po dobu 10 minut při 23 °C (pokojová teplota).
   2. Opatrně shromážděte supernatant do nové 2,0 ml zkumavky Eppendorf s bezpečnostním zámkem. Vyvarujte se rušení pelety.
8. Následné zpracování
   Lyzát je nyní připraven k vyčištění SP3 a enzymatickému trávení.

Poznámky a osvědčené postupy

1. Riziko přehřátí během sonikace je zmírněno naprogramovaným cyklováním ON / OFF.
2. Vyvarujte se víření po sonikaci, abyste zabránili agregaci proteinů.

Likvidace odpadu a bezpečnost

Níže uvedená tabulka vám poskytuje přibližnou kapacitu zpracování našich laboratorních ultrasonicators: