Příprava vzorku FFPE s vysokou propustností: extrakce proteinů a stříhání nukleových kyselin

FAQ
Níže odpovídáme na často kladené otázky, které jsou relevantní pro přípravu tkáně FFPE a ultrazvuku vzorků FFPE.

Jak se připravuje tkáň FFPE?

Kroky pro přípravu tkáně FFPE: Pečlivá manipulace a zpracování čerstvé tkáně jsou rozhodující pro vytváření vysoce kvalitních vzorků FFPE. Zajištění zachování buněčné architektury, nukleových kyselin a proteinů je nezbytné pro přesnou následnou analýzu. Každý krok – od odběru až po vložení – vyžaduje přesnost, aby byla zachována integrita vzorku pro různé analýzy, včetně histologického vyšetření, imunohistochemie a molekulárních studií. Pokud je tento proces fixace a zalití správně proveden, zajišťuje, že konzervovaná tkáň přesně odráží stav in vivo, což umožňuje spolehlivé diagnostické a výzkumné výsledky.
Provedeme vás 6 hlavními kroky procesu zalévání vzorků tkáně FFPE.

• Odběr tkání
  Biopsie z živých savců a tkáňové kultury jsou životaschopnými zdroji pro získání čerstvé tkáně pro přípravu vzorků FFPE.
  Je důležité používat aseptickou techniku: Používejte sterilní nástroje a rukavice, abyste zabránili kontaminaci. V ideálním případě sbírejte tkáně ve sterilním prostředí, jako je chirurgický sál nebo laminární kukla.
  Vzhledem k tomu, že vzorek je velmi křehký, je nezbytné s ním zacházet citlivě: Minimalizovat prodlevy při zpracování a okamžitě začít s následným zpracováním tkáně po excize. To je zásadní pro zabránění autolýze a degradace. Udržujte tkáň při pokojové teplotě; Vyhněte se zmrazení, protože může způsobit tvorbu ledových krystalů a poškození tkání.
• Fixace tkáně
  Nejprve se tkáň ošetří fixačním roztokem: Použijte 10% neutrální pufrovaný formalin (NBF), který odpovídá 4% formaldehydu ve vodě, pufrovaný na neutrální pH.
  Tkáň zcela ponořte do formalínu. Zajistěte objemový poměr fixačního prostředku k tkáni alespoň 10:1. Doba fixace se obvykle pohybuje od 6 do 24 hodin v závislosti na typu a velikosti tkáně. Je důležité, aby fixační prostředek mohl důkladně proniknout do tkáně. Nadměrná fixace však může vést ke zesíťování, které komplikuje získávání antigenu, zatímco nedostatečná fixace může mít za následek špatné zachování tkáně.
• Ořezávání tkání
  Za druhé, ořízněte tkáň na tloušťku asi 3-5 mm, aby byla umožněna dostatečná penetrace fixačního prostředku. Zajistěte správnou orientaci tkáně pro zachycení relevantních histologických struktur. To usnadňuje proces extrakce, když je tkáň později použita pro analýzu.
• Zpracování fixovaného vzorku
  Nyní musí být fixovaná tkáň dehydratována: Po fixaci je třeba tkáň dehydratovat, aby byl zajištěn důkladný průnik parafínového vosku. Nechte tkáň projít odstupňovanou řadou ethanolu (70 %, 80 %, 90 % a 100 %), abyste odstranili vodu.
  Čištění xylenem: Parafínový vosk je nerozpustný ve vodě, ale rozpustný v xylenu. Proto musí být voda v tkáni nahrazena xylenem. Samotný xylen je však nerozpustný ve vodě, ale rozpustný v alkoholu, což vyžaduje mezikrok, kdy je voda nejprve nahrazena alkoholem. Ponořte tkáň do xylenu nebo xylenové náhražky, abyste odstranili etanol a připravili tkáň na infiltraci parafínem.
  Infiltrace pomocí parafínu: Ponořte tkáň do roztaveného parafínového vosku, čímž zajistíte úplnou infiltraci. Tento krok obvykle zahrnuje několik výměn parafínu, aby byla zajištěna důkladná impregnace.
• Zapuštění tkáně
  V tomto kroku se tkáň vytvaruje do tkáňového bloku: Tkáň se umístí do formy s požadovanou orientací a zalije se roztaveným parafínem. Nechte parafín ztuhnout vychladnutím při pokojové teplotě nebo na studené desce.
• Dělení a montáž
  Mikrotomie: Chcete-li rozřezat vloženou tkáň, použijte mikrotom k vyříznutí tenkých řezů (obvykle 4-5 mikrometrů) z parafínového bloku. Poté se vzorek zamontuje a řezy se umístí na sklíčka pro následné barvení a mikroskopickou analýzu.
  Nakonec zkontrolujte kvalitu histologie: Vyhodnoťte první řezy pod mikroskopem, abyste zajistili správnou fixaci a zpracování. Upravte protokoly podle potřeby na základě typu tkáně a pozorované kvality.

 
Tkáně FFPE lze použít k obnově RNA, DNA a proteinů, stejně jako k odhalení příznaků rakoviny nebo jiného onemocnění. Mohou být skladovány po mnoho let a jsou nezbytnou součástí toho, jak výzkumníci a lékaři využívají vzorky tkání pro diagnostiku a výzkum.

Jaké jsou běžné problémy a výzvy s tkání FFPE?

Vzorky tkáně fixované formalínem a zalité parafínem (FFPE) jsou široce používány ve výzkumu a diagnostice, ale představují několik výzev a běžných problémů:

• Degradace biomolekul: Dlouhodobá fixace může vést k degradaci DNA, RNA a proteinů, což ztěžuje extrakci vysoce kvalitních nukleových kyselin nebo proteinů pro následné aplikace. Správná fixace (vyvarování se nedostatečné a nadměrné fixace) je nezbytná pro zachování tkáně.

Zesíťování: Fixace formalínu způsobuje zesíťování proteinů a nukleových kyselin, což může bránit molekulární analýze a ovlivnit přesnost imunohistochemie a dalších testů.

• Maskování antigenu: Proces fixace může maskovat antigenní místa, což snižuje účinnost vazby protilátek v imunohistochemii a dalších imunologických testech. To často vyžaduje odběr antigenu, což je postup, díky kterému je maskování epitopu obráceno a vazba epitop-protilátka je obnovena. Ne vždy však může být obnovena plná antigenicita.
• Variabilní kvalita fixace: Rozdíly v dobách a podmínkách fixace mohou vést k nekonzistentní kvalitě vzorku, což ovlivňuje reprodukovatelnost a srovnatelnost výsledků. Používejte spolehlivé fixační protokoly a vyhněte se nedostatečné a nadměrné fixaci.
• Poškození a fragmentace DNA: Fixace vzorků FFPE formalínem může způsobit různé typy poškození DNA, včetně deaminace cytosinu (mutace C na T), oxidačního poškození (např. 8-oxo-guanin vedoucí k mutacím G na T), stejně jako fyzické poruchy, jako jsou zářezy, mezery a abazická místa, která brání aktivitě DNA polymerázy. Proces fixace formalínu může způsobit fragmentaci DNA, což komplikuje genetické a genomické analýzy, jako je PCR a sekvenování.
• Kvalita RNA: RNA extrahovaná z tkání FFPE je často fragmentována a chemicky modifikována, což ztěžuje provádění vysoce kvalitních transkriptomických analýz.
• Modifikace proteinů: Formalin může indukovat chemické modifikace v proteinech, které ovlivňují jejich strukturu a funkci, což může interferovat s proteomickými analýzami.
• Artefakty zpracování vzorků: Během procesu zalévání a dělení může mechanické namáhání a teplo vnést artefakty a způsobit další poškození tkáně.
• Variabilita mezi šaržemi: Rozdíly v protokolech fixace a vkládání mezi různými šaržemi mohou vést k významné variabilitě výsledků, což komplikuje srovnání mezi studiemi.
• Problémy s úložištěm: Dlouhodobé skladování bloků FFPE může časem vést k další degradaci a ztrátě integrity nukleových kyselin, což má dopad na životaschopnost archivních vzorků pro retrospektivní studie.

Použití optimalizovaných protokolů, pečlivé manipulace se vzorky a použití pokročilých technik pomáhá zlepšit kvalitu a spolehlivost dat získaných z tkání FFPE.

Jaký je rozdíl mezi FFPE a zmraženou tkání?

Tkáň FFPE (fixovaná formalínem, zalitá parafínem) je konzervována pomocí formalínu k fixaci tkáně a poté zalita do parafínového vosku, což umožňuje dlouhodobé skladování při pokojové teplotě při zachování morfologie tkáně. Naproti tomu zmrzlá tkáň se rychle konzervuje zmrazením, které lépe udržuje integritu nukleových kyselin a proteinů, ale vyžaduje skladování při velmi nízkých teplotách.

Jaké chemikálie se používají pro zalévání FFPE?

Chemikálie používané pro zalévání FFPE obvykle zahrnují formalin pro fixaci a parafínový vosk pro zalití. Pro zalití FFPE se tkáně obvykle fixují buď pomocí 10% (v/v) neutrálního pufrovaného formalinu (FA) nebo čerstvě připraveného 4% (w/v) roztoku formaldehydu (PFA) vyrobeného z paraformaldehydového prášku. Formalín, což je roztok formaldehydu ve vodě, je pufrován na neutrální pH, aby se zachovala morfologie tkání a zabránilo se nadměrnému zesíťování. Roztok na bázi paraformaldehydu také poskytuje účinnou fixaci zesíťováním proteinů, čímž stabilizuje tkáňovou strukturu pro následné zalití do parafínového vosku. Tyto chemikálie jsou nezbytné pro udržení integrity a morfologie tkáně během procesu fixace a zalévání.

Jak se odstraňuje parafín ze vzorků FFPE?

Aby se odstranil parafín ze vzorků FFPE, jsou tkáňové řezy obvykle podrobeny sérii xylenových výplachů, po nichž následuje rehydratace prostřednictvím odstupňované série alkoholů a nakonec vody. Vzhledem k tomu, že xylen je vysoce toxický a představuje zdravotní rizika, jako jsou dýchací problémy, podráždění kůže a potenciální dlouhodobé účinky při opakované expozici, ultrazvukové odstranění parafínu se v mnoha laboratořích jeví jako slibná alternativa. Tato metoda využívá intenzivní ultrazvukové vlny k účinnému a bezpečnému odstranění parafínu bez potřeby toxických rozpouštědel, jako je xylen, čímž se snižuje riziko pro laboratorní personál a vytváří bezpečnější pracovní prostředí.

Jak dlouho bych měl fixovat své tkáně, aby byla zajištěna dobrá kvalita vzorku FFPE?

Obecná doporučení pro dobu fixace obvykle doporučují fixaci vzorků tkáně ve formalínu po dobu 24 až 48 hodin. Tato doba je obecně dostatečná pro zachování morfologie tkání a buněčných struktur a zároveň minimalizuje nadměrnou fixaci, která může vést k nadměrnému zesíťování a degradaci nukleových kyselin a proteinů. Optimální doba fixace se však může lišit v závislosti na velikosti a typu tkáně, přičemž menší nebo choulostivější vzorky vyžadují kratší dobu fixace. Je velmi důležité vyvážit adekvátní fixaci, aby se zabránilo autolýze a degradaci tkáně a zároveň se zabránilo dlouhodobé fixaci, která by mohla komplikovat následné molekulární analýzy.