Vysokokapacitní příprava vzorků FFPE: extrakce proteinů a smykové štěpení nukleových kyselin

Často kladené otázky
Níže odpovídáme na často kladené otázky, které se týkají přípravy tkání FFPE a ultrazvukového zpracování vzorků FFPE.

Jak se připravuje tkáň FFPE?

Kroky přípravy tkáně FFPE: Pečlivé zacházení s čerstvou tkání a její zpracování jsou zásadní pro získání vysoce kvalitních vzorků FFPE. Zajištění zachování buněčné architektury, nukleových kyselin a proteinů je nezbytné pro přesnou navazující analýzu. Každý krok – od odběru po zalití – vyžaduje přesnost, aby byla zachována integrita vzorku pro různé analýzy, včetně histologického vyšetření, imunohistochemie a molekulárních studií. Při správném provedení zajišťuje tento proces fixace a zalití, že zachovaná tkáň přesně odráží stav in vivo, což umožňuje spolehlivé diagnostické a výzkumné výsledky.
Provedeme vás 6 hlavními kroky procesu zalévání vzorků tkání FFPE.

• Odběr tkáně
  Biopsie z živých savců i tkáňové kultury jsou vhodnými zdroji pro získání čerstvé tkáně pro přípravu vzorků FFPE.
  Je důležité používat aseptickou techniku: používejte sterilní nástroje a rukavice, abyste zabránili kontaminaci. Ideálně odebírejte tkáně ve sterilním prostředí, jako je operační sál nebo laminární box.
  Protože je vzorek velmi křehký, je nezbytné s ním zacházet šetrně: minimalizujte prodlevy ve zpracování a ihned po excizi zahajte následné zpracování tkáně. To je zásadní pro zabránění autolýze a degradaci. Uchovávejte tkáň při pokojové teplotě; vyhněte se zmrazení, protože může způsobit tvorbu ledových krystalů a poškození tkáně.
• Fixace tkáně
  Nejprve se tkáň ošetří fixačním roztokem: použijte 10% neutrální pufrovaný formalín (NBF), který odpovídá 4% formaldehydu ve vodě, pufrovanému na neutrální pH.
  Tkáň zcela ponořte do formalínu. Zajistěte objemový poměr fixačního činidla k tkáni alespoň 10:1. Doba fixace se obvykle pohybuje od 6 do 24 hodin v závislosti na typu a velikosti tkáně. Je důležité, aby fixační činidlo mohlo tkání důkladně proniknout. Nadměrná fixace však může vést k zesíťování, které komplikuje demaskování antigenů, zatímco nedostatečná fixace může vést ke špatnému zachování tkáně.
• Ořezání tkáně
  Za druhé ořízněte tkáň na tloušťku přibližně 3–5 mm, aby fixační činidlo mohlo dostatečně proniknout. Zajistěte správnou orientaci tkáně, aby byly zachyceny relevantní histologické struktury. To usnadňuje proces extrakce, když se tkáň později použije k analýze.
• Zpracování fixovaného vzorku
  Nyní je nutné fixovanou tkáň odvodnit: po fixaci je třeba tkáň odvodnit, aby bylo zajištěno důkladné prostoupení parafínovým voskem. Proveďte tkáň odstupňovanou řadou ethanolu (70%, 80%, 90% a 100%) k odstranění vody.
  Projasnění xylenem: parafínový vosk je nerozpustný ve vodě, ale rozpustný v xylenu. Proto musí být voda v tkáni nahrazena xylenem. Xylen sám je však nerozpustný ve vodě, ale rozpustný v alkoholu, což vyžaduje mezikrok, při kterém je voda nejprve nahrazena alkoholem. Ponořte tkáň do xylenu nebo náhrady xylenu, abyste odstranili ethanol a připravili tkáň na infiltraci parafínem.
  Infiltrace parafínem: vložte tkáň do roztaveného parafínového vosku a zajistěte úplnou infiltraci. Tento krok obvykle zahrnuje několik výměn parafínu pro zajištění důkladné impregnace.
• Zalití tkáně
  V tomto kroku se z tkáně vytvaruje tkáňový blok: umístěte tkáň do formy v požadované orientaci a zalijte ji roztaveným parafínem. Nechte parafín ztuhnout ochlazením při pokojové teplotě nebo na chladicí desce.
• Krájení a montáž řezů
  Mikrotomie: ke krájení zalité tkáně použijte mikrotom a z parafínového bloku nakrájejte tenké řezy (obvykle 4–5 mikrometrů). Poté se vzorek montuje umístěním řezů na podložní sklíčka pro následné barvení a mikroskopickou analýzu.
  Nakonec zkontrolujte kvalitu histologie: vyhodnoťte první řezy pod mikroskopem, abyste ověřili správnou fixaci a zpracování. Podle potřeby upravte protokoly na základě typu tkáně a pozorované kvality.

Tkáně FFPE lze použít k získání RNA, DNA a proteinů i k odhalení známek rakoviny nebo jiných onemocnění. Lze je skladovat po léta a jsou nezbytnou součástí toho, jak výzkumníci a lékaři využívají vzorky tkání pro diagnostiku a výzkum.

Jaké jsou běžné problémy a výzvy u tkání FFPE?

Vzorky tkání fixované formalínem a zalité do parafínu (FFPE) jsou široce využívány ve výzkumu a diagnostice, ale představují několik výzev a běžných problémů:

• Degradace biomolekul: Prodloužená fixace může vést k degradaci DNA, RNA a proteinů, což ztěžuje extrakci vysoce kvalitních nukleových kyselin nebo proteinů pro navazující aplikace. Správná fixace (bez nedostatečné a nadměrné fixace) je pro zachování tkáně nezbytná.

Zesíťování: Fixace formalínem způsobuje zesíťování proteinů a nukleových kyselin, což může bránit molekulární analýze a ovlivnit přesnost imunohistochemie a dalších testů.

• Maskování antigenů: Proces fixace může maskovat antigenní místa, a snižovat tak účinnost vazby protilátek v imunohistochemii a dalších imunologických testech. To často vyžaduje demaskování antigenu, tedy postup, při kterém se maskování epitopu zvrátí a obnoví se vazba epitop-protilátka. Plná antigenicita však nemusí být vždy obnovena.
• Proměnlivá kvalita fixace: Rozdíly v době a podmínkách fixace mohou vést k nekonzistentní kvalitě vzorků, což ovlivňuje reprodukovatelnost a srovnatelnost výsledků. Používejte spolehlivé fixační protokoly a vyhněte se nedostatečné i nadměrné fixaci.
• Poškození a fragmentace DNA: Fixace vzorků FFPE formalínem může způsobit různé typy poškození DNA, včetně deaminace cytosinu (mutace C na T), oxidačního poškození (např. 8-oxo-guanin vedoucí k mutacím G na T) a také fyzických narušení, jako jsou jednovláknové zlomy, mezery a abazická místa, která brání aktivitě DNA polymerázy. Proces fixace formalínem může způsobit fragmentaci DNA, což komplikuje genetické a genomické analýzy, jako je PCR a sekvenování.
• Kvalita RNA: RNA extrahovaná z tkání FFPE je často fragmentovaná a chemicky modifikovaná, což ztěžuje provádění vysoce kvalitních transkriptomických analýz.
• Modifikace proteinů: Formalín může vyvolat chemické modifikace proteinů, které ovlivňují jejich strukturu a funkci, což může interferovat s proteomickými analýzami.
• Artefakty při zpracování vzorků: Během zalévání a krájení může mechanické namáhání a teplo vnést artefakty a způsobit další poškození tkáně.
• Variabilita mezi šaržemi: Rozdíly v protokolech fixace a zalévání mezi různými šaržemi mohou vést k významné variabilitě výsledků, což komplikuje srovnání mezi studiemi.
• Problémy se skladováním: Dlouhodobé skladování bloků FFPE může v průběhu času vést k další degradaci a ztrátě integrity nukleových kyselin, což ovlivňuje použitelnost archivních vzorků pro retrospektivní studie.

Použití optimalizovaných protokolů, pečlivé zacházení se vzorky a využití pokročilých technik pomáhají zlepšit kvalitu a spolehlivost dat získaných z tkání FFPE.

Jaký je rozdíl mezi tkání FFPE a zmrazenou tkání?

Tkáň FFPE (fixovaná formalínem a zalitá do parafínu) se konzervuje fixací formalínem a následným zalitím do parafínového vosku, což umožňuje dlouhodobé skladování při pokojové teplotě při zachování morfologie tkáně. Naproti tomu zmrazená tkáň se rychle konzervuje zmrazením, které lépe zachovává integritu nukleových kyselin a proteinů, ale vyžaduje skladování při velmi nízkých teplotách.

Jaké chemikálie se používají k zalévání FFPE?

Chemikálie používané k zalévání FFPE obvykle zahrnují formalín pro fixaci a parafínový vosk pro zalití. Pro zalévání FFPE se tkáně obvykle fixují buď 10% (v/v) neutrálním pufrovaným formalínem (FA), nebo čerstvě připraveným 4% (w/v) roztokem formaldehydu (PFA) vyrobeným z práškového paraformaldehydu. Formalín, který je roztokem formaldehydu ve vodě, je pufrován na neutrální pH, aby se zachovala morfologie tkáně a zabránilo se nadměrnému zesíťování. Roztok na bázi paraformaldehydu rovněž zajišťuje účinnou fixaci zesíťováním proteinů, čímž stabilizuje strukturu tkáně pro následné zalití do parafínového vosku. Tyto chemikálie jsou nezbytné pro zachování integrity a morfologie tkáně během procesu fixace a zalévání.

Jak se odstraňuje parafín ze vzorků FFPE?

Pro odstranění parafínu ze vzorků FFPE se tkáňové řezy obvykle podrobují sérii promývání xylenem, po nichž následuje rehydratace odstupňovanou řadou alkoholů a nakonec vodou. Vzhledem k tomu, že xylen je vysoce toxický a představuje zdravotní rizika, jako jsou respirační potíže, podráždění kůže a možné dlouhodobé účinky při opakované expozici, objevuje se v mnoha laboratořích ultrazvukové odstraňování parafínu jako slibná alternativa. Tato metoda využívá intenzivní ultrazvukové vlny k účinnému a bezpečnému odstranění parafínu bez nutnosti použití toxických rozpouštědel, jako je xylen, čímž snižuje riziko pro laboratorní personál a vytváří bezpečnější pracovní prostředí.

Jak dlouho mám fixovat své tkáně pro dobrou kvalitu vzorků FFPE?

Obecná doporučení pro dobu fixace obvykle uvádějí fixaci vzorků tkání ve formalínu po dobu 24 až 48 hodin. Tato doba je obecně dostatečná k zachování morfologie tkáně a buněčných struktur při minimalizaci nadměrné fixace, která může vést k nadměrnému zesíťování a degradaci nukleových kyselin a proteinů. Optimální doba fixace se však může lišit v závislosti na velikosti a typu tkáně, přičemž menší nebo jemnější vzorky vyžadují kratší dobu fixace. Je zásadní najít rovnováhu mezi dostatečnou fixací, která zabrání autolýze a degradaci tkáně, a vyhnutím se prodloužené fixaci, která by mohla komplikovat navazující molekulární analýzy.