Ultrazvučna disgregacija ćelija bakterijskih uzoraka
Bakterijske uzorke rijetko dolaze kao prave suspenzije jedne ćelije. Kulture rastu u lancima i flokulama, ekološki izolati formiraju agregate povezane ekstracelularnim polimernim supstancama, a centrifugirani pelleti često odolijevaju resuspenziji uprkos temeljitom vorteksiranju. Brojanje životnih ćelija, optička gustoća, protočna citometrija i profilisanje mikrobioma svi pretpostavljaju da jedan čestica znači jedna ćelija. Ultrazvučna disaggregacija ćelija rješava taj konflikt: kratki, kontrolisani ultrazvučni impuls razdvaja agregate u pojedinačne ćelije bez njihove lize.
Zašto agregacija ćelija kompromituje vaše rezultate
Agregacija je biološka karakteristika, a ne greška u pripremi. Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces i mnoge vrste iz okoline rastu u lancima, klasterima ili fragmentima biofilma, a ekstracelularna DNK i polisaharidi lijepe ćelije u peletima i brisovima eluatima. Analitičke posljedice su sistematske:
- Broj kolonija se potcjenjuje, jer jedna grupa proizvodi jednu koloniju bez obzira na broj ćelija.
- Optički brojači gustine i čestica prijavljuju agregate umjesto ćelija, pristranjujući krivulje rasta.
- Protočna citometrija i sortiranje ćelija pogrešno broje događaje u grupama i isključuje ih iz analize.
- Ekstrakcije DNK i proteina predstavljaju samo ćelije na površini agregata, što iskrivljuje podatke mikrobioma i omike.
Konvencionalni lijekovi su spori, nepotpuni ili kemijski modificiraju. Vigorozno pipetiranje i vortexiranje ostavljaju mikrouglove iza sebe. Enzimska ili na kelatore bazirana disperzija mijenja površinu ćelija koju namjeravate analizirati. Mehaničko razbijanje kontrolisanom kavitacijom djeluje u roku od nekoliko sekundi i ne zahtijeva dodatke.
Jedan agregat znači jednu koloniju – i jedan pogrešan rezultat. Pogledajte kako ultrazvučna disaggregacija proizvodi prave suspenzije pojedinačnih ćelija bez lize, aerosola ili rukovanja sondom. Zatražite više informacija!
Multi-Tube Sonicator VialTweeter za pripremu uzoraka bez kontakta: Razdvojite klastere ćelija u zatvorenim epruvetama
Kako sonikacija razdvaja ćelije bez njihove lize
Ultrazvučna disaggregacija ćelija koristi razliku u mehaničkoj čvrstoći. Bakterijski agregati su povezani relativno slabim međustaničnim vezama i vanćelijskim matriksom, dok netaknuta ćelijska omotnica izdrži znatno veća smicanja. Kada kalibrirani ultrazvuk uđe u suspenziju, akustična kavitacija stvara mikrostrujanja, pulsove pritiska i sile smicanja koje djeluju prvo na interfejsima agregata. Grupe, lance i fragmente biofilma razdvaja se (deaglomeracija) prije nego što se dostigne nivo energije pri kojem membrana pucaju (liza).
Ultrazvučna dezintegracija bakterijskih grudvica ćelija
Disaggregacija ili liza – Kako parametri sonikacije imaju značaj
Praktična posljedica je da su disaggregacija i liza isti instrument koji se koristi pri različitim parametrima. Pri umjerenoj amplitudi, kratkim pulsiranim ciklusima i kontrolisanoj temperaturi dobija se održiva suspenzija jedne ćelije. Povećanje amplitude, vremena izlaganja ili temperature uzorka pomjera proces ka potpunoj disrupciji ćelija za intracelularne ciljeve. Hielscher generatori omogućavaju precizno podešavanje amplitude, snage, pulsa i unosa energije te čuvanje metode, tako da je korak disaggregacije reproduktivno primjenjiv na različite uzorke, operatere i izvođenja.
Efektivna sonikacija bez kontakta
Sonikacija u kupatilu ne može odgovarati ovoj kontroli. Kade i rezervoari za ultrazvučno čišćenje daju samo nisku ultrazvučnu energiju, što rezultira nepotpunom pripremom, a kavitacija se javlja neravnomjerno, pa se svaka cijev tretira prema svom položaju u kadi. VialTweeter prenosi intenzivne, fokusirane ultrazvučne sile direktno kroz zid posude u do 10 zatvorenih uzoraka u isto vrijeme. Tretmani koji zahtijevaju dugu, promjenjivu ekspoziciju u kadi se završavaju u standardiziranom obrascu pulsa.
Hielscher sonikatori bez kontakta primjenjuju intenzivni, fokusirani ultrazvuk kroz zidove zatvorenih bočica. VialTweeter obrađuje do 10 bočica istovremeno sa identičnom intenzitetom, bez sonde u uzorku, bez unakrsne kontaminacije i bez oslobađanja aerosola. Kada je potreban veći protok, UIP400MTP i UIP550MTP sonikatori za mikroploče prenose istu kontrolisanu energiju na ploče sa više jama.
The VialTweeter Sonicates do 10 manjih bočica i do 5 većih epruveta istovremeno.
Prednosti ultrazvučne disagragacije bez kontakta
- Nulta unakrsna kontaminacija: Budući da bočice ostaju stalno zatvorene i nijedna sonda nije uronjena u uzorak, unakrsna kontaminacija i gubitak uzorka su potpuno izbjegnuti. Nema ničega što treba sterilizovati između uzoraka, i jedan eksperiment ne može utjecati na drugi.
- Zaštita od aerosola: Otvorena sonikacija sondom proizvodi infektivne aerosole i kontaminira površine instrumenata. Sonikacija u zatvorenoj epruveti zadržava uzorak unutar vlastite epruvete, što je važno pri rukovanju patogenim bakterijama poput Mycobacterium tuberculosis i drugih BSL-2 ili BSL-3 agenasa.
- Nema trošenja vrha: Titanijske sonde mogu osloboditi malu količinu mikro-čestica u uzorak tokom rada. Te čestice mijenjaju optičku gustinu i brojeve čestica nizvodno. Indirektna sonikacija kroz zid posude potpuno eliminiše ovaj izvor čvrstih materija.
- Jednoličan protok: VialTweeter isporučuje istu intenzitet ultrazvuka do svake od najviše 10 epruveta, tako da su rezultati sonikacije ujednačeni i reproducibilni. Efekti pozicioniranja koji muče kupke i ispitivanje pojedinačnih uzoraka nestaju, a vaše referentne vrijednosti ostaju usporedive između replikata.
- Integritet uzorka: Epruvete ostaju zatvorene tokom cijelog procesa, tako da uzorak ne može biti kontaminiran, pokvaren ili ispariti. Male zapremine rade bez razrjeđivanja, uključujući vrijedne kliničke pellet-e koje ne mogu priuštiti dodatni korak prijenosa.
- Kontrola procesa: Amplituda je podesiva od 20 do 100%, pulsni režim od 0 do 100%, a sistemi podržavaju praćenje temperature tako da termosenzitivne vrste i proteini ostanu ispod štetnih pragova.
Tipične primjene
- Analiza mikrobioma i sadržaja crijeva: raspršivanje Lactobacillusa, Bifidobacteriuma i fecalnih uzoraka prije kultivacije ili sekvenciranja, kako brojevi ne bi bili smanjeni zbog grudvi.
- Mikrobiologija hrane i vode: razdvajanje flokula u brisovima, ispiranjima i obogaćujućim bujonima za precizno određivanje kolonija i održivosti.
- Istraživanje biofilma: obnavljanje ćelija s nosača i površina kao suspenzija pojedinačnih ćelija, bez enzimske obrade koja bi uklonila površinske proteine.
- Klinička dijagnostika: ponovno suspenziranje sputuma, gnoja i eluata brisa pod kontroliranim uvjetima.
- Kultivacija ćelija: razdvajanje grudvastih agregata sisarskih, insektskih i CHO ćelija prije brojanja i pasiranja.
- Priprema cijelog procesa: isti instrument koji deaglomerira pri niskoj amplitudi vrši potpunu disrupciju ćelija pri višim postavkama, tako da liza, ekstrakcija proteina i fragmentacija DNK slijede bez prenosa između epruveta.
Sonikator sa više udubljenja UIP400MTP Za visokoprotočnu deaglomeraciju klastera ćelija
Ne samo za mikroploče, modeli mikrotalasnog sonikatora UIP400MTP i UIP550MTP obrađuju i stalke za epruvete.
Pronađite pravi sonikator za vaš workflow deaglomeracije
VialTweeter Multi-Tube Sonicator
Metoda izbora za sterilnu, zatvorenu bočicu dezagregaciju. Pokrenut UP200St procesorom od 200 W na 26 kHz s automatskim podešavanjem, VialTweeter prenosi ultrazvuk indirektno kroz zidove do 10 zatvorenih bočica istovremeno, do 10 W po cijevi, za ujednačene i ponovljive rezultate bez unakrsne kontaminacije i gubitka uzorka. Titanijumska sonotroda VialTweeter se može autoklavirati, a amplituda i puls su podesivi i sačuvani, što je kontrolni opseg potreban protokolu za deaglomeraciju. Standardna sonotroda sa 10 pozicija prihvata bočice za automatsko uzorkovanje, epruvete za mikrocentrifugu i Eppendorf ili Nunc epruvete od 1 do 5 mL. VialPress uređaj za stezanje rukuje do 5 većih posuda prečnika do 20 mm.
Namjenski VialTweeter modeli s jednom cijevi dostupni su za Falcon cijevi i za pojedinačne bočice prilagođene veličini posude. Rastavite blok sonotrodu i jedinica jezgre UP200St radi kao konvencionalni sonikator sonde za direktan tretman malih i srednjih uzoraka.
Microplate Sonicatori
Povećajte do pripreme uzoraka visokog protoka uz ultrazvučnu obradu ploča sa više jažica: Za radne tokove zasnovane na ploči, sonikatori za mikroploče UIP400MTP i UIP550MTP proširuju beskontaktnu, jednoliku obradu ultrazvukom sa deset epruveta na cijelu ploču.
UIP400MTP od 400 vata obrađuje standardne mikrotiterske i višekupljne ploče, uključujući formate od 96 dobro, sa preciznom kontrolom amplitude, snage i impulsa, zajedno sa tajmerom, sondom za temperaturu i hlađenjem u vodenoj kupki. Uklanjanje biofilma i obrada bakterijskih kultura su utvrđene primjene UIP400MTP mikrotiterskog sonikatora.
UIP550MTP od 550 vata je snažnija opcija – idealan za zahtjevnije primjene.
Oba sistema sonikacije bez kontakta pouzdano obrađuju ploče sa 6, 12, 24, 48, 96 i 384 jama, kao i stalke za epruvete i Petrijeve zdjelice. Hielscher mikrotitranje sonikatori funkcionišu sa bilo kojom standardnom pločom, izbjegavajući skupe proprietarne potrošne materijale. Sa programabilnim temperaturnim ograničenjima, sonikacija se automatski zaustavlja na maksimalnoj temperaturi uzorka i nastavlja nakon hlađenja, štiteći vitalnost u ponovljenim ciklusima. Pametna i pouzdana priprema uzoraka visokog kapaciteta za ponovljive rezultate.
Tabela ispod daje vam pregled približnog kapaciteta obrade naših laboratorijskih sonikatora za uzorke koji se koriste u životnim naukama, genomici, proteomici i dijagnostici:
| Preporučeni uređaji | Batch Volume | Flow Rate |
|---|---|---|
| VialTweeter Multi-Tube Sonicator | 0.5 do 1.5mL bočice | N / A |
| UIP400MTP sonikator za višewućne ploče (440 vati) | mikrotitarske ploče sa više jažica | N / A |
| UIP550MTP sonikator za višewućne ploče (550 vati) | mikrotitarske ploče sa više jažica | N / A |
| Ultrazvučni kuphorn | CupHorn za bočice ili čašu | N / A |
| UP100H sonikator sa sondom 100 vati | 1 do 500 ml | 10 do 200 ml/min |
| UP200Ht, UP200St modeli sonikatora sa sondom 200 vati | 10 do 1000 ml | 20 do 200 ml/min |
| UP400St sonikator sa sondom 400 vati | 10 do 2000 ml | 20 do 400 ml/min |
| GDmini2 | sterilni ultrazvučni mikroprotok reactor | N / A |
| Ultrazvučni sita Shaker | N / A | N / A |
Često postavljana pitanja o ultrazvučnoj disagregaciji ćelija
Koja je razlika između disagregacije ćelija i lize ćelija?
Disagregacija, također nazvana deaglomeracija, odvaja okupljene ćelije u suspenziju pojedinačnih ćelija dok ćelije ostaju netaknute i žive. Lizis rupture ćelijsku membranu i oslobađa intracelularni sadržaj. Oba procesa pokreće kovulsija uz učinak smicanja, a razlika je u uloženoj energiji. Uz optimizirane postavke amplitude, pulsa i temperature, sonikacija postiže disagregaciju ispod praga lize.
Zašto ultrazvučne kupke nisu pogodne za standardizovanu disagregaciju?
Kupke daju samo nisku ultrazvučnu energiju, što dovodi do nepotpune pripreme, a kavitacija se razvija vrlo neravnomjerno po rezervoaru, tako da svaki uzorak dobija različit tretman u zavisnosti od njegovog položaja. Microbiological counts and comparative studies depend on comparability. Beskontaktni sonikatori kao što je Multi-Tube Sonicator VialTweeter, kao i modeli ultrazvučnog uređaja za mikroploče UIP400MTP i UIP550MTP obrađuju sve posude pod prilagođenim ultrazvučnim uslovima, što poboljšava reproduktivnost u ponavljanjima.
Može li sonikacija oštetiti ćelije?
Da, ako parametri nisu kontrolisani. Pretjerana sonikacija ili nekontrolisano zagrijavanje mogu oštetiti ćelije, a oslobođena DNK čini uzorke viskoznim i pospješuje re-agragaciju. Zbog toga proces treba razvijati promišljeno: umjerena amplituda, pulsni ciklusi, hlađenje i instrumenti sa ograničenom temperaturom održavaju tretman na strani disaggregacije krive.
Svi Hielscher digitalni sonikatori nude precizno kontrolisane parametre, priključive temperaturne senzore, programabilna podešavanja i automatsko evidentiranje podataka za pouzdanu pripremu uzoraka.
Da li uzorak treba prenijeti u drugi spremnik?
Ne. Bočice i ploče se obrađuju u njihovim originalnim, zatvorenim kontejnerima. Indirektna sonikacija izbjegava kako gubitke tokom prenosa tako i prenos koji se povezuje sa rukovanjem sondom.
Koje formate bočica može obrađivati VialTweeter?
Standardna sonotroda sa 10 pozicija prihvata bočice za automatske uzorkivače, mikrocetrifuge epruvete te Eppendorf ili Nunc epruvete od 1 do 5 mL. Dodatak VialPress može primiti do 5 većih posuda prečnika do 20 mm. Dostupni su specijalizovani modeli VialTweeter za pojedinačne epruvete za Falcon epruvete i za prilagođene formate pojedinačnih bočica ili većih dimenzija.
Mogu li deaglomerirati i lizirati jednim uređajem?
Da. Isti uređaj koji deaglomerira pri umjerenoj amplitudi može izvršiti potpuno razbijanje ćelija pri većoj amplitudi i dužem izlaganju, tako da se suspenzija pojedinačnih ćelija i naknadna ekstrakcija mogu izvoditi uzastopno bez mijenjanja platforme.
Koristi li se sonikacija u MBEC testovima?
Sonikacija je uspostavljena i uglavnom standardna komponenta. U MBEC testu s peg-lid-om, nakon što se biofilmi uzgajaju na polistirenskim klinovima i izlažu antibiotiku, klinovi se prenose u svježi medij i podvrgavaju vrtložnici plus ultrazvuku kako bi se uklonile i deagregirale priljepljene ćelije biofilma u planktonsku suspenziju prije serijskog razrjeđivanja i najnižeg broja održivih MBEC se oporavlja kao što se očitava najniža koncentracija MBEC-a. ≥3 log10 u odnosu na netretirani biofilm). Sonikacija značajno poboljšava kvalitet disperzije: nepotpuno oslobađanje ugrađenih ćelija iz EPS matrice potcenjuje eradikaciju i naduvava vrednosti MBEC. Ciljana sonikacija bušotina sa držačima klinova preko ploča za analizu sa sonikatorom za mikroploče UIP400MTP prevazilazi tradicionalne slabosti sonikacije u kupatilu – naime, neujednačena raspodjela energije, zagrijavanje i rizik od aerosola/unakrsne kontaminacije.
Saznajte kako UIP400MTP bezkontaktni mikropločasti sonifikator olakšati MBEC testove!
Da li se sonikacija koristi u MIC testovima?
Sonikacija se primjenjuje u različitim radnim tokovima sličnim MIC-u radi poboljšanja efikasnosti i ponovljivosti:
- mikobakteriologija, gdje se ispljuvljak i drugi viskozni uzorci rutinski dekontaminiraju i homogenizuju, ponekad sonikalacijom, prije testiranja osjetljivosti, a mikobakterijske inokule koje formiraju grudve imaju koristi od kratke disperzije za tačne MIC-ove;
- organizmi skloni agregatima (npr. streptokoci, stafilokoki u peletima) gdje mikro-agregati iskrivljuju gustinu inokuluma; i
- kombinovana dijagnostika kao što je kultura tečnosti za sonifikaciju implantata, praćena testiranjem osjetljivosti na infekciju protetskog zgloba (primjena slična MBEC-u, a ne klasična MIC).
Literatura / Reference
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
- Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Odaberite svoju ploču! Mikroploča sonikator UIP550MTP disaggregira bakterijske uzorke u bilo kojoj standardnoj ploči s više jama.
Hielscher Multi-Sample Sonicator modeli UIP400MTP za mikroploče, VialTweeter i CupHorn: priprema uzoraka velike brzine i velike propusnosti