Ultrazvučna dezagregacija ćelija bakterijskih uzoraka

Bakterijski uzorci rijetko stižu kao prave suspenzije pojedinačnih ćelija. Kulture rastu u lancima i flokulama, okolišni izolati stvaraju agregate povezane ekstracelularnim polimernim supstancama, a centrifugirani peleti se često teško resuspendiraju uprkos temeljitom vorteksiranju. Brojanje vijabilnih ćelija, optička gustoća, protočna citometrija i profiliranje mikrobioma pretpostavljaju da jedna čestica odgovara jednoj ćeliji. Ultrazvučna dezagregacija ćelija rješava taj sukob: kratki, kontrolirani impulsi ultrazvučne obrade razdvajaju agregate na pojedinačne ćelije bez njihove lize.

Zašto agregacija ćelija ugrožava vaše rezultate

Agregacija je biološka osobina, a ne greška u pripremi. Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces i mnoge okolišne vrste rastu u lancima, nakupinama ili fragmentima biofilma, a ekstracelularna DNK i polisaharidi lijepe ćelije u peletima i eluatima briseva. Analitičke posljedice su sistematske:

Brojevi kolonija su podcijenjeni jer jedna nakupina daje jednu koloniju, bez obzira na to koliko ćelija sadrži.
Optička gustoća i brojači čestica bilježe agregate umjesto ćelija, što iskrivljuje krivulje rasta.
Protočna citometrija i sortiranje ćelija pogrešno broje događaje nakupina i isključuju ih iz analize.
Ekstrakcije DNK i proteina predstavljaju samo ćelije na površini agregata, što iskrivljuje podatke o mikrobiomu i omici.

Uobičajena rješenja su spora, nepotpuna ili hemijski mijenjaju uzorak. Snažno pipetiranje i vorteksiranje ostavljaju mikroagregate. Enzimska disperzija ili disperzija zasnovana na helatorima mijenja površinu ćelije koju možda namjeravate analizirati. Mehanička dezagregacija kontroliranom kavitacijom djeluje u roku od nekoliko sekundi i ne zahtijeva aditive.

Iskrivljuju li nakupine ćelija vaša brojanja?
Jedan agregat jednak je jednoj koloniji – i jednom pogrešnom rezultatu. Pogledajte kako ultrazvučna dezagregacija daje prave suspenzije pojedinačnih ćelija bez lize, aerosola i rukovanja sondom. Zatražite više informacija!

Kompletna postavka VialTweeter: sonikator za više uzoraka VialTweeter omogućava ultrazvučnu obradu radi dezagregacije ćelija u više zatvorenih uzoraka u beskontaktnom procesu.

Sonikator za više epruveta VialTweeter za beskontaktnu pripremu uzoraka: dezagregirajte nakupine ćelija u zatvorenim epruvetama

Kako ultrazvučna obrada dezagregira ćelije bez njihove lize

Ultrazvučna dezagregacija ćelija koristi razliku u mehaničkoj čvrstoći. Bakterijske agregate drže na okupu relativno slabe međućelijske veze i ekstracelularni matriks, dok netaknuta ćelijska ovojnica podnosi znatno veće smicanje. Kada kalibrirani ultrazvuk uđe u suspenziju, akustična kavitacija stvara mikrostrujanje, tlačne impulse i smične sile koje djeluju prvo na granicama agregata. Nakupine, lanci i fragmenti biofilma razdvajaju se smicanjem (dezaglomeracija) prije nego što se dostigne nivo energije pri kojem membrane pucaju (liza).

Hielscher sonikatori koriste se za dispergiranje agregata ćelija.

Ultrazvučna dezagregacija bakterijskih nakupina ćelija

Dezagregacija ili liza – zašto su važni parametri ultrazvučne obrade

Praktična posljedica je da se dezagregacija i liza provode istim instrumentom pri različitim parametrima. Pri umjerenoj amplitudi, kratkim pulsnim ciklusima i kontroliranoj temperaturi dobijate vijabilnu suspenziju pojedinačnih ćelija. Povećanje amplitude, vremena izlaganja ili temperature uzorka pomjera proces prema potpunoj razgradnji ćelija radi dolaska do intracelularnih ciljeva. Hielscher generatori omogućavaju da precizno podesite amplitudu, snagu, puls i unos energije te da sačuvate metodu, tako da je korak dezagregacije ponovljiv među uzorcima, operaterima i serijama.

Efikasna beskontaktna ultrazvučna obrada

Sonikacija u kupelji ne može dostići ovu kontrolu. Ultrazvučne kupelji i tankovi za čišćenje daju samo nisku ultrazvučnu energiju, što dovodi do nepotpune pripreme, a kavitacija se javlja neravnomjerno, pa se svaka epruveta tretira prema svom položaju u kupelji. VialTweeter prenosi intenzivne, fokusirane ultrazvučne sile direktno kroz zid posude u do 10 zatvorenih uzoraka istovremeno. Tretmani koji u kupelji zahtijevaju dugo, promjenjivo izlaganje završavaju se u standardiziranom pulsnom obrascu.
Hielscher beskontaktni sonikatori primjenjuju intenzivan, fokusiran ultrazvuk kroz zidove zatvorenih bočica. VialTweeter obrađuje do 10 bočica istovremeno istim intenzitetom, bez sonde u uzorku, bez unakrsne kontaminacije i bez oslobađanja aerosola. Kada to zahtijeva protok uzoraka, mikroplatni sonikatori UIP400MTP i UIP550MTP proširuju isti kontrolirani prijenos energije na ploče s više jažica.

MultiSampleSonicator VialTweeter može primiti do 10 manjih bočica i do 5 većih epruveta – idealno za istovremenu pripremu uzoraka.

VialTweeter sonicira do 10 manjih bočica i do 5 većih epruveta istovremeno.

Prednosti beskontaktne ultrazvučne dezagregacije

Nulta unakrsna kontaminacija: Budući da bočice ostaju stalno zatvorene i nijedna sonda se ne uranja u uzorak, unakrsna kontaminacija i gubitak uzorka potpuno su izbjegnuti. Između uzoraka nema ničega što bi trebalo sterilizirati, a jedan ciklus ne može utjecati na sljedeći.
Zaštita od aerosola: Ultrazvučna obrada otvorenom sondom stvara infektivne aerosole i kontaminira površine instrumenta. Ultrazvučna obrada u zatvorenim bočicama zadržava uzorak unutar vlastite epruvete, što je važno pri rukovanju patogenim bakterijama poput Mycobacterium tuberculosis i drugim agensima BSL-2 ili BSL-3.
Bez erozije vrha: Titanske sonde mogu tokom rada otpustiti malu količinu mikročestica u uzorak. Te čestice naknadno pomjeraju optičku gustoću i brojanje čestica. Indirektna ultrazvučna obrada kroz zid posude u potpunosti uklanja taj izvor čvrstih tvari.
Ujednačena obrada uzoraka: VialTweeter isporučuje isti intenzitet ultrazvuka u svaku od do 10 bočica, pa su rezultati ultrazvučne obrade ujednačeni i ponovljivi. Efekti položaja koji muče kupelji i pojedinačnu obradu uzoraka sondom nestaju, a vaše bazne linije ostaju uporedive među replikatima.
Integritet uzorka: Epruvete ostaju zatvorene tokom cijele obrade, pa se uzorak ne može kontaminirati, pokvariti ili ispariti. Mali volumeni rade bez razrjeđivanja, uključujući dragocjene kliničke pelete koji ne mogu podnijeti dodatni korak prijenosa.
Kontrola procesa: Amplituda se može podešavati od 20 do 100 %, pulsni način od 0 do 100 %, a sistemi podržavaju praćenje temperature, tako da termosenzitivni sojevi i proteini ostaju ispod štetnih pragova.

VialTweeter je jedinstven ultrazvučni sistem za istovremenu sonikaciju do 10 bočica pod potpuno istim uslovima, bez unakrsne kontaminacije.

Tipične primjene

Analiza mikrobioma i sadržaja crijeva: disperzija Lactobacillus, Bifidobacterium i fekalnih uzoraka prije nasađivanja ili sekvenciranja, kako brojevi ne bi bili smanjeni zbog nakupina.
Mikrobiologija hrane i vode: dezagregacija flokula u brisevima, ispircima i obogaćenim bujonima radi tačnog određivanja kolonija i vijabilnosti.
Istraživanje biofilma: izdvajanje ćelija s nosača i površina kao suspenzija pojedinačnih ćelija, bez enzimskog tretmana koji bi uklonio površinske proteine.
Klinička dijagnostika: resuspendiranje sputuma, gnoja i eluata briseva u uvjetima zadržavanja.
Ćelijske kulture: razdvajanje nakupljenih agregata ćelija sisara, insekata i CHO ćelija prije brojanja i pasažiranja.
Priprema cijelog radnog toka: isti instrument koji dezagregira pri niskoj amplitudi provodi potpunu razgradnju ćelija pri višim postavkama, pa liza, ekstrakcija proteina i fragmentacija DNK slijede bez prijenosa između epruveta.

Mikroplatni sonikator UIP400MTP omogućava istovremenu ekstrakciju proteina iz uzoraka u pločama s više jažica – olakšava pripremu uzoraka velike propusnosti u proteomici

Sonikator za ploče s više jažica UIP400MTP za dezaglomeraciju nakupina ćelija velike propusnosti

Ne samo za ploče s više jažica, sonikator UIP550MTP može primiti i stalke za epruvete i Petrijeve zdjelice za efikasnu pripremu uzoraka

Mikroplatni sonikatori UIP400MTP i UIP550MTP nisu namijenjeni samo pločama s više jažica – obrađuju i stalke za epruvete.

Pronađite pravi sonikator za svoj radni tok dezagregacije

Sonikator za više epruveta VialTweeter

Metoda izbora za sterilnu dezagregaciju u zatvorenim bočicama. Pokretan procesorom UP200St od 200 watta pri 26 kHz s automatskim ugađanjem, VialTweeter prenosi ultrazvuk indirektno kroz zidove do 10 zatvorenih bočica istovremeno, sa do 10 W po epruveti, za ujednačene i ponovljive rezultate bez unakrsne kontaminacije i bez gubitka uzorka. Titanska sonotroda VialTweeter može se autoklavirati, a amplituda i puls se mogu podešavati i spremati, što je raspon kontrole koji zahtijeva protokol dezaglomeracije. Standardna sonotroda s 10 mjesta prima bočice za automatske uzorkivače, mikrocentrifugalne epruvete te Eppendorf ili Nunc epruvete od 1 do 5 mL. Stezni uređaj VialPress podržava do 5 većih posuda promjera do 20 mm.
Dostupni su namjenski modeli VialTweeter za jednu epruvetu za Falcon epruvete i za pojedinačne bočice prilagođene veličini posude. Rastavite blok sonotrodu i osnovna jedinica UP200St radi kao konvencionalni sondni sonikator za direktnu obradu malih do srednjih uzoraka.

Mikroplatni sonikatori

Prelazak na pripremu uzoraka velike propusnosti ultrazvučnom obradom ploča s više jažica: Za radne tokove zasnovane na pločama, mikroplatni sonikatori UIP400MTP i UIP550MTP proširuju beskontaktnu, ujednačenu ultrazvučnu obradu sa deset epruveta na cijelu ploču.
UIP400MTP od 400 watta obrađuje standardne mikrotitarske ploče i ploče s više jažica, uključujući formate sa 96 jažica, uz preciznu kontrolu amplitude, snage i pulsiranja te tajmer, temperaturnu sondu i hlađenje vodenom kupelji. Odvajanje biofilma i obrada bakterijskih kultura utvrđene su primjene mikroplatnog sonikatora UIP400MTP.
UIP550MTP od 550 watta je snažnija opcija – idealna za zahtjevnije primjene.
Oba beskontaktna sistema ultrazvučne obrade pouzdano obrađuju ploče sa 6, 12, 24, 48, 96 i 384 jažice, kao i stalke za epruvete i Petrijeve zdjelice. Hielscher mikroplatni sonikatori rade sa svakom standardnom pločom, čime se izbjegavaju skupi vlasnički potrošni materijali. Uz programabilna temperaturna ograničenja, ultrazvučna obrada se automatski pauzira pri maksimalnoj temperaturi uzorka i nastavlja nakon hlađenja, čime se štiti vijabilnost u ponovljenim ciklusima. Pametna i pouzdana priprema uzoraka velike propusnosti za ponovljive rezultate.

Tabela u nastavku daje pregled približnog kapaciteta obrade naših laboratorijskih sonikatora za uzorke koji se koriste u biološkim znanostima, genomici, proteomici i dijagnostici:

Preporučeni uređaji	Volumen šarže	Protok
Sonikator za više epruveta VialTweeter	bočice od 0,5 do 1,5mL	n.a.
Sonikator za ploče s više jažica UIP400MTP (440 watta)	ploče s više jažica / mikrotitarske ploče	n.a.
Sonikator za ploče s više jažica UIP550MTP (550 watta)	ploče s više jažica / mikrotitarske ploče	n.a.
Ultrazvučni CupHorn	CupHorn za bočice ili čaše	n.a.
UP100H sonikator sondnog tipa od 100 watta	1 do 500mL	10 do 200mL/min
UP200Ht, UP200St modeli sonikatora sondnog tipa od 200 watta	10 do 1000mL	20 do 200mL/min
UP400St sonikator sondnog tipa od 400 watta	10 do 2000mL	20 do 400mL/min
GDmini2	sterilni ultrazvučni mikroreaktor s protokom	n.a.
Ultrazvučna tresilica za sita	n.a.	n.a.

Ovaj vodič objašnjava koja vrsta sonikatora najbolje odgovara Vašim zadacima pripreme uzoraka, kao što su liza, razaranje ćelija, izolacija proteina te fragmentacija DNA i RNA u laboratorijima, analitici i istraživanju. Odaberite idealnu vrstu sonikatora za svoju primjenu, zapreminu uzorka, broj uzoraka i kapacitet obrade. Hielscher Ultrasonics ima idealan ultrazvučni homogenizator za Vas!

Povezane teme

Često postavljana pitanja o ultrazvučnoj dezagregaciji ćelija

Koja je razlika između dezagregacije ćelija i lize ćelija?

Dezagregacija, koja se naziva i dezaglomeracija, razdvaja nakupljene ćelije u suspenziju pojedinačnih ćelija dok ćelije ostaju netaknute i vijabilne. Liza razara ćelijsku ovojnicu i oslobađa intracelularni sadržaj. Oboje pokreće smicanje uzrokovano kavitacijom, a razlika je u unosu energije. Uz optimizirane postavke amplitude, pulsa i temperature, ultrazvučna obrada postiže dezagregaciju ispod praga lize.

Zašto ultrazvučne kupelji nisu pogodne za standardiziranu dezagregaciju?

Kupelji daju samo nisku ultrazvučnu energiju, što dovodi do nepotpune pripreme, a kavitacija se razvija vrlo neravnomjerno u tanku, pa svaki uzorak prima drugačiji tretman ovisno o svom položaju. Mikrobiološka brojanja i uporedne studije zavise od uporedivosti. Beskontaktni sonikatori poput sonikatora za više epruveta VialTweeter, kao i modeli mikroplatnih sonikatora UIP400MTP i UIP550MTP, obrađuju sve posude pod usklađenim ultrazvučnim uvjetima, što poboljšava ponovljivost među replikatima.

Može li ultrazvučna obrada oštetiti ćelije?

Da, ako parametri nisu kontrolirani. Prekomjerna ultrazvučna obrada ili nekontrolirano zagrijavanje mogu oštetiti ćelije, a oslobođena DNK čini uzorke viskoznim i potiče ponovnu agregaciju. Zato proces treba razvijati promišljeno: umjerena amplituda, pulsni ciklusi, hlađenje i instrumenti s ograničenjem temperature drže tretman na strani dezagregacije krivulje.
Svi Hielscher digitalni sonikatori nude precizno kontrolirane parametre, priključive temperaturne senzore, programabilne postavke i automatsko bilježenje podataka za pouzdanu pripremu uzoraka.

Treba li uzorak prenijeti u drugu posudu?

Ne. Bočice i ploče obrađuju se u svojim originalnim, zatvorenim posudama. Indirektna ultrazvučna obrada izbjegava i gubitke pri prijenosu i prenošenje ostataka povezano s rukovanjem sondom.

Koje formate bočica VialTweeter može obraditi?

Standardna sonotroda s 10 mjesta prima bočice za automatske uzorkivače, mikrocentrifugalne epruvete te Eppendorf ili Nunc epruvete od 1 do 5 mL. Pribor VialPress prima do 5 većih posuda promjera do 20 mm. Dostupni su namjenski modeli VialTweeter za jednu epruvetu za Falcon epruvete te za prilagođene pojedinačne bočice ili veće formate.

Mogu li jednim instrumentom dezagregirati i lizirati?

Da. Isti sistem koji dezagregira pri umjerenoj amplitudi provodi potpunu razgradnju ćelija pri višoj amplitudi i duljem izlaganju, pa se priprema suspenzije pojedinačnih ćelija i naknadna ekstrakcija mogu provesti uzastopno bez promjene platforme.

Koristi li se ultrazvučna obrada u MBEC testovima?

Ultrazvučna obrada je utvrđena i uglavnom standardna komponenta. U MBEC testu s poklopcem s klinovima, nakon što se biofilmovi uzgoje na polistirenskim klinovima i izlože antibiotiku, klinovi se prenose u svježi medij i podvrgavaju vorteksiranju uz ultrazvučnu obradu kako bi se prianjajuće ćelije biofilma odvojile i dezagregirale u planktonsku suspenziju prije serijskog razrjeđivanja i brojanja vijabilnih ćelija (MBEC se očitava kao najniža koncentracija koja smanjuje izdvojene brojeve za ≥3 log10 u odnosu na netretirani biofilm). Ultrazvučna obrada značajno poboljšava kvalitetu disperzije: nepotpuno oslobađanje ćelija ugrađenih u EPS matriks podcjenjuje eradikaciju i povećava vrijednosti MBEC. Ciljana ultrazvučna obrada jažica držača klinova na pločama za test mikroplatnim sonikatorom UIP400MTP prevladava tradicionalne slabosti ultrazvučne obrade u kupelji – naime neravnomjernu raspodjelu energije, zagrijavanje i rizik od aerosola/unakrsne kontaminacije.
Saznajte kako beskontaktni mikroplatni sonikator UIP400MTP olakšava MBEC testove!

Koristi li se ultrazvučna obrada u MIC testovima?

Ultrazvučna obrada primjenjuje se u različitim radnim tokovima srodnim MIC-u radi poboljšanja efikasnosti i ponovljivosti:

mikobakteriologija, gdje se sputum i drugi viskozni uzorci rutinski dekontaminiraju i homogeniziraju, ponekad ultrazvučnom obradom, prije testiranja osjetljivosti, a inokulumi mikobakterija koji stvaraju nakupine imaju koristi od kratke disperzije radi tačnih MIC-ova;
organizmi skloni agregaciji (npr. streptokoki, stafilokoki u peletima) kod kojih mikroagregati iskrivljuju gustoću inokuluma; i
kombinirana dijagnostika, poput kulture tečnosti dobivene ultrazvučnom obradom implantata nakon koje slijedi testiranje osjetljivosti kod infekcije proteze zgloba (primjena slična MBEC-u, a ne klasičnom MIC-u).

Otkrijte primjenu ultrazvučne obrade za MIC testove!

Literatura / reference

FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.

Mikroplatni sonikator UIP5500MTP omogućava dezagregaciju i lizu ćelija u svim standardnim mikropločama / pločama s više jažica i ne zahtijeva skupe vlasničke ploče. Promijenite parametre ultrazvučne obrade da biste razlikovali dezagregaciju ćelija od lize ćelija.

Odaberite vlastitu ploču! Mikroplatni sonikator UIP550MTP dezagregira bakterijske uzorke u svakoj standardnoj ploči s više jažica.

Hielscher modeli sonikatora za više uzoraka CupHorn, VialTweeter i sonikator za ploče s više jažica UIP400MTP omogućavaju brzu proteolitičku digestiju velike propusnosti

Hielscher modeli sonikatora za više uzoraka UIP400MTP za mikroploče, VialTweeter i CupHorn: brza priprema uzoraka velike propusnosti