Protokol za uzgoj i odvajanje biofilma bakterije Staphylococcus

Standardizirane metode ključne su za pouzdane rezultate istraživanja. Ovdje možete pronaći protokol za uzgoj i odvajanje stafilokoknih biofilmova. Protokol je usmjeren na pojednostavljenu pripremu uzoraka velikog protoka pomoću ultrazvučnog uređaja za višejamične ploče UIP400MTP, radi efikasnog odvajanja biofilma u pločama sa 96 jamica uz visoku propusnost. Protokol sadrži i ključne korake za uzgoj, ispiranje i vizualizaciju biofilma, s naglaskom na smanjenje varijabilnosti i osiguravanje ponovljivosti.

Istraživanje biofilma bakterije Staphylococcus i antibiotika

Biofilmovi bakterije Staphylococcus imaju presudnu ulogu u perzistentnim infekcijama zbog svoje otpornosti na antibiotike i imunološke odgovore. Stvaranje biofilma pruža bakterijama zaštitno okruženje, zbog čega se infekcije teško liječe. Istraživanja biofilmova često su usmjerena na razumijevanje njihovog nastanka, ponašanja i osjetljivosti na antimikrobna sredstva, uz naglasak na metode velike propusnosti kojima se pojednostavljuju eksperimentalni tokovi rada.
Ultrazvučni uređaj za višejamične ploče UIP400MTP pruža značajnu prednost u istraživanju biofilma jer omogućava brzo i efikasno odvajanje biofilmova iz ploča sa 96 jamica. Ovaj uređaj isporučuje ujednačenu ultrazvučnu energiju u sve jamice, čime osigurava dosljedne rezultate uz minimalnu varijabilnost.

Protokol za uzgoj i odvajanje biofilma bakterije Staphylococcus

U nastavku vas korak po korak vodimo kroz postupak uzgoja i odvajanja biofilma stafilokoka. Kao primjer analitičkog koraka pokazujemo kako se uzgojena biomasa kvantificira spektrofotometrijski bojenjem kristal-violetom.

Uzgoj biofilma bakterije Staphylococcus

Potreban materijal:

• Sterilne mikrotitarske ploče sa 96 jamica, ravnog dna, od polistirena, tretirane za uzgoj tkiva, s poklopcima
• Triptički sojin bujon (TSB) sa 0,25% glukoze
• Biosigurnosna kabina

Koraci:

1. Pripremite sterilno radno okruženje u biosigurnosnoj kabini kako biste smanjili kontaminaciju.
2. Dodajte TSB koji sadrži 0,25% glukoze u jamice mikrotitarske ploče. TSB bez glukoze općenito ne podržava stvaranje biofilma i treba ga koristiti samo kao kontrolu, ako je potrebno.
3. Inokulirajte jamice bakterijskim sojevima pripremljenim kako je opisano u nastavku:
4. Pripremite bakterijske suspenzije i pobrinite se da nema već postojećih skupina ćelija tako što ćete suspenzije homogenizirati ultrazvučnom obradom (sonikacijom) ili razbiti skupine iglom od 23 gauge i kratkim vorteksiranjem.
5. Zatvorite ploču poklopcem i inkubirajte u uvjetima optimalnim za stvaranje biofilma (npr. 37°C tokom 24 sata).
6. Eksperiment provedite u tri ponavljanja za svaki bakterijski soj (tri jamice po soju) kako biste osigurali pouzdanost.
7. Rezervirajte šest jamica po ploči za negativne kontrole. Na jednoj ploči sa 96 jamica može se testirati do 30 sojeva.

Vizualizacija i ispiranje biofilma

1. Nakon inkubacije pažljivo odbacite podlogu kako ne biste narušili biofilm.
2. Svaku jamicu isperite četiri puta fiziološkom otopinom kako biste uklonili planktonske bakterije.
3. Pregledajte dno jamica radi bijelih naslaga koje ukazuju na prisutnost biofilma.

Odvajanje biofilma pomoću ultrazvučnog uređaja za višejamične ploče UIP400MTP

Postavke uređaja i parametri:

• Ultrazvučni uređaj za višejamične ploče UIP400MTP
• Radne postavke: amplituda 60%, ciklični način rada sa 60 sekundi UKLJUČENO / 30 sekundi ISKLJUČENO

Koraci:

1. Postavite isprану mikrotitarsku ploču na platformu uređaja UIP400MTP.
2. Uzorke podvrgnite ultrazvučnoj obradi (sonikaciji) pri preporučenim postavkama (amplituda 60%, 60 sekundi UKLJUČENO, 30 sekundi ISKLJUČENO). Postavke prilagodite bakterijskom soju.
3. Pokrenite ultrazvučnu obradu kako biste odvojili biofilm. Ultrazvučni valovi razgrađuju matriks biofilma i oslobađaju adherentne bakterije.
4. UIP400MTP osigurava ujednačenu izloženost u svim jamicama za dosljedne rezultate odvajanja.

Analitički korak: kvantifikacija biomase odvojenog biofilma bakterije Staphylococcus pomoću kristal-violeta (CV)

Potreban materijal:

• 0,1% otopina kristal-violeta (CV)
• 95% etanol ili 30% octena kiselina (za solubilizaciju)
• Čitač mikroploča sposoban za očitavanje na 570 nm
• Sterilne mikrotitarske ploče za bojenje

Koraci:

1. Priprema ploče za bojenje: Prenesite 100 µL suspenzije odvojenog biofilma iz svake jamice ploče izložene ultrazvučnoj obradi u odgovarajuće jamice čiste, sterilne mikrotitarske ploče sa 96 jamica. Time se osigurava čisto i ujednačeno okruženje za bojenje.
2. Bojenje odvojenog biofilma: Dodajte 150 µL 0,1% otopine kristal-violeta u svaku jamicu koja sadrži suspenziju odvojenog biofilma. Pažljivo pipetirajte kako biste osigurali ravnomjerno miješanje suspenzije biofilma i kristal-violeta.
3. Inkubacija: Ostavite ploču da se inkubira na sobnoj temperaturi 15 minuta kako bi kristal-violet efikasno obojio biomasu.
4. Ispiranje: Nakon inkubacije pažljivo odbacite otopinu kristal-violeta iz jamica bez narušavanja biomase. Svaku jamicu isperite tri puta sterilnom fiziološkom otopinom kako biste uklonili nevezanu boju.
5. Sušenje: Ostavite ploču da se osuši na zraku na sobnoj temperaturi ili ispod sterilne komore s protokom zraka. Izbjegavajte zagrijavanje jer može izmijeniti rezultate.
6. Solubilizacija: Dodajte 200 µL 95% etanola (ili 30% octene kiseline, ovisno o standardnoj laboratorijskoj praksi) u svaku jamicu kako biste otopili vezani kristal-violet. Lagano miješajte pipetiranjem ili protresanjem ploče 10 minuta na sobnoj temperaturi.
7. Mjerenje: Izmjerite optičku gustoću (OD) otopljene otopine kristal-violeta na 570 nm pomoću čitača mikroploča.
8. Analiza podataka: Oduzmite srednju vrijednost OD570 negativnih kontrola (jamice s TSB-om, ali bez bakterijskog inokuluma) od vrijednosti eksperimentalnih jamica kako biste uzeli u obzir pozadinsko bojenje. Zabilježite i analizirajte podatke.

Napomena: Eksperiment provedite u tri ponavljanja za svaki uvjet kako biste osigurali ponovljivost. Osigurajte pravilno rukovanje kristal-violetom i etanolom te se pridržavajte protokola o sigurnosti i zbrinjavanju.

Ključne prednosti uređaja UIP400MTP ukratko:

• Obrada velike propusnosti: Namijenjen posebno višejamičnim pločama, što omogućava istovremenu obradu više uzoraka.
• Ujednačena raspodjela ultrazvuka: Osigurava jednak intenzitet ultrazvuka u svim jamicama i time dosljedne rezultate za sve uzorke.
• Upotreba bilo koje standardne ploče: UIP400MTP može raditi sa svim standardnim višejamičnim pločama, Petrijevim posudama i stalcima za epruvete. Nisu potrebne skupe vlasničke ploče!
• Jednostavno korisničko sučelje: Jednostavno se postavlja i kontrolira, zbog čega je odličan alat za povećanje produktivnosti laboratorija. Programabilne postavke i automatizacija olakšavaju standardizaciju procesa!