Protokol uzgoja i odvajanja biofilma stafilokoka

Standardizirane metode su neophodne za pouzdane rezultate istraživanja. Ovdje možete pronaći protokol uzgoja i odvajanja za stafilokokne biofilmove. Ovaj protokol se fokusira na pojednostavljenu pripremu uzoraka visokog protoka pomoću UIP400MTP sonikator ploča sa više jažica za efikasno odvajanje biofilma visokog protoka u pločama sa 96 jažica. Protokol također sadrži ključne korake za uzgoj biofilma, pranje i vizualizaciju, s fokusom na minimiziranje varijabilnosti i osiguravanje reproduktivnosti.

Biofilm stafilokoka i istraživanje antibiotika

Biofilmi stafilokoka igraju ključnu ulogu u perzistentnim infekcijama zbog svoje otpornosti na antibiotike i imunološkog odgovora. Formiranje biofilma pruža zaštitno okruženje za bakterije, što otežava liječenje infekcija. Istraživanje biofilma često se fokusira na razumijevanje njihovog formiranja, ponašanja i osjetljivosti na antimikrobne tvari, s naglaskom na metode visoke propusnosti za pojednostavljenje eksperimentalnih tokova.
UIP400MTP sonikator ploča sa više jažica nudi značajnu prednost u istraživanju biofilma omogućavajući brzo i efikasno odvajanje biofilma od ploča sa 96 jažica. Ovaj uređaj pruža ujednačenu ultrazvučnu energiju svim bušotinama, osiguravajući konzistentne rezultate uz minimiziranje varijabilnosti.

Protokol za uzgoj i odvajanje biofilma stafilokoka

U nastavku vas vodimo korak po korak kroz proces kultivacije i odvajanja biofilma stafilokoka. Kao ogledni analitički korak, pokazujemo vam kako spektrofotometrijski kvantificirati uzgojenu biomasu bojenjem kristalno ljubičastom.

Uzgoj biofilma stafilokoka

Potrebni materijali:

• Sterilne mikrotitarske ploče sa 96 jažica s ravnim dnom tretirane kulturom tkiva polistirenom s poklopcima
• Triptična sojina čorba (TSB) sa 0,25% glukoze
• Biološki sigurnosni kabinet

Koraci:

1. Pripremite sterilno radno okruženje u biološkom sigurnosnom kabinetu kako biste sveli kontaminaciju na minimum.
2. Dodajte TSB koji sadrži 0,25% glukoze u jažice mikrotitarske ploče. TSB bez glukoze općenito ne podržava stvaranje biofilma i treba se koristiti kao kontrola samo ako je potrebno.
3. Inokulirajte jažice sojevima bakterija pripremljenim kako je opisano u nastavku:
4. Pripremite bakterijske suspenzije, osiguravajući da nema već postojećih klastera ćelija homogenizacijom suspenzija pomoću sonikacije ili razbijanjem klastera iglom od 23 kalibra i kratkim vrtložnim mešanjem.
5. Zatvorite ploču poklopcem i inkubirajte u uslovima optimalnim za formiranje biofilma (npr. 37°C tokom 24 sata).
6. Izvedite eksperiment u tri primjerka za svaki bakterijski soj (tri jažice po soju) kako biste osigurali pouzdanost.
7. Odredite šest jažica po ploči za negativne kontrole. Može se testirati do 30 sojeva po ploči sa 96 jažica.

Vizualizacija i pranje biofilma

1. Nakon inkubacije, pažljivo odbacite podlogu kako biste izbjegli ometanje biofilma.
2. Isperite svaku jažicu četiri puta fiziološkom otopinom kako biste uklonili planktonske bakterije.
3. Pregledajte dno jažica da li postoje bijele mrlje koje ukazuju na prisustvo biofilma.

Odvajanje biofilma pomoću sonikatora sa više jažica UIP400MTP

Podešavanje uređaja i parametri:

• UIP400MTP sonikator ploča sa više jažica
• Radna podešavanja: 60% amplituda, ciklusni režim sa 60 sekundi uključenim / 30 sekundi isključenim

Koraci:

1. Postavite ispranu mikrotitarsku ploču na platformu UIP400MTP.
2. Sonicirajte uzorke na preporučenim postavkama (60% amplituda, 60 sekundi UKLJUČENO, 30 sekundi ISKLJUČENO). Prilagodite postavke soju bakterija.
3. Pokrenite proces sonikacije da biste odvojili biofilm. Ultrazvučni valovi ometaju matriks biofilma, oslobađajući prianjajuće bakterije.
4. UIP400MTP osigurava ujednačenu ekspoziciju u svim bunarima za konzistentne rezultate odvajanja.

Analitički korak: kvantifikacija biomase odvojenog stafilokoka biomase pomoću kristalne ljubičice (CV)

Potrebni materijali:

• 0.1% rastvor kristalno ljubičaste (CV).
• 95% etanol ili 30% octena kiselina (za solubilizaciju)
• Čitač mikroploča sposoban za čitanje na 570 nm
• Sterilne mikrotitarske ploče za bojenje

Koraci:

1. Priprema ploče za bojenje: Prenesite 100 µL odvojene suspenzije biofilma iz svake jažice sonikirane ploče u odgovarajuće jažice čiste, sterilne mikrotitarske ploče sa 96 jažica. Ovo osigurava jasno i ujednačeno okruženje za bojenje.
2. Bojenje odvojenog biofilma: Dodajte 150 µL 0,1% kristalnoljubičastog rastvora u svaku jažicu koja sadrži suspenziju odvojenog biofilma. Nežno pipetirajte kako biste osigurali ravnomjerno miješanje suspenzije biofilma i kristalno ljubičaste boje.
3. Inkubacija: Ostavite ploču da se inkubira na sobnoj temperaturi 15 minuta kako bi kristalno ljubičasto omogućilo da efikasno oboji biomasu.
4. Pranje: Nakon inkubacije, pažljivo bacite kristalno ljubičasti rastvor iz jažica bez ometanja biomase. Operite svaku jažicu tri puta sterilnom fiziološkom otopinom kako biste uklonili nevezanu mrlju.
5. Sušenje: Pustite da se ploča osuši na sobnoj temperaturi ili ispod sterilne haube. Izbjegavajte zagrijavanje, jer to može promijeniti rezultate.
6. Solubilizacija: Dodajte 200 µL 95% etanola (ili 30% sirćetne kiseline, u zavisnosti od standardne laboratorijske prakse) u svaku jažicu da se rastvori vezani kristal ljubičasti. Lagano miješajte pipetiranjem ili mućkanjem ploče 10 minuta na sobnoj temperaturi.
7. Mjerenje: Izmjerite optičku gustinu (OD) rastvorenog kristalnoljubičastog rastvora na 570 nm koristeći čitač mikroploče.
8. Analiza podataka: Oduzmite srednju vrijednost OD570 negativnih kontrola (jažice sa TSB-om, ali bez bakterijskog inokuluma) iz eksperimentalnih jažica da biste uzeli u obzir pozadinsko bojenje. Zabilježite i analizirajte podatke.

Napomena: Izvedite eksperiment u tri primjerka za svaki uvjet kako biste osigurali ponovljivost. Osigurajte pravilno rukovanje kristalno ljubičastim i etanolom, pridržavajući se sigurnosnih protokola i protokola za odlaganje.
 

Ključne prednosti UIP400MTP na prvi pogled:

• Visoka propusna obrada: Dizajniran posebno za ploče sa više jažica, omogućavajući vam da obrađujete više uzoraka istovremeno.
• Uniformna ultrazvučna distribucija: Osigurava jednak ultrazvučni intenzitet u svim bunarima, pružajući konzistentne rezultate za sve uzorke.
• Koristite bilo koju standardnu ploču: UIP400MTP može raditi sa svim standardnim pločama s više jažica, Petrijevim zdjelicama i stalcima za epruvete. Nisu potrebne skupe vlasničke ploče!
• Korisničko sučelje prilagođeno korisniku: Jednostavan za postavljanje i kontrolu, što ga čini odličnim alatom za povećanje produktivnosti laboratorije. Programabilna podešavanja i automatizacija olakšavaju standardizaciju procesa!