Protokol testa minimalne inhibitorne koncentracije (MIC)

Test minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) zasnovan na biofilmu ključna je metoda za procjenu djelotvornosti antimikrobnih agenasa protiv mikroorganizama povezanih s biofilmom, koji zbog zaštitnog ekstracelularnog matriksa pokazuju pojačanu otpornost. Ključni korak u ovom testu je odvajanje struktura biofilma radi oslobađanja ugrađenih ćelija za tačnu procjenu vijabilnosti. Sonikator za višejažične ploče UIP400MTP olakšava ovaj postupak primjenom fokusiranog ultrazvuka za stvaranje kontrolirane kavitacije, koja efikasno odvaja ćelije biofilma i raspršuje ih u ujednačenu suspenziju. Ovo precizno i ponovljivo razgrađivanje biofilma povećava pouzdanost i propusnost MIC testova, zbog čega je UIP400MTP nezaobilazan alat u unapređenju istraživanja biofilma.

Zašto trebam koristiti ultrazvučnu obradu (sonikaciju) tokom MIC testova?

• Tačni i ponovljivi podaci: Dobijte ujednačene suspenzije ćelija koje uklanjaju zaštitu matriksa, čime se osigurava da broj kolonija i očitanja optičke gustoće zaista odražavaju antimikrobnu djelotvornost.
• Visoka propusnost: Obradite cijelu ploču sa 96 jažica istovremeno za samo 1–3 minute, čime se spora i nedosljedna ručna struganja zamjenjuju pojednostavljenim radnim tokom.
• Očuvana vijabilnost ćelija: Nježno odvojite ugrađene ćelije bez fizičkih oštećenja koja uzrokuje struganje, uz očuvanje većeg postotka preživljavanja za pouzdane proračune MIC/MBEC.
• Nula rizika od unakrsne kontaminacije: Iskoristite prednosti bezkontaktnog dizajna s posudastom sonotrodom (cup-horn) koji ravnomjerno obrađuje sve jažice, bez sondi koje dodiruju pojedinačne uzorke ili jažice.
• Usklađenost sa standardima: Uskladite svoju metodologiju s validiranim industrijskim protokolima poput ASTM E2799-22, čime vaši podaci dobijaju veću vjerodostojnost u regulatorne svrhe ili za objavljivanje.
• Pouzdan probir lijekova i tretmana: Pouzdajte se u rezultate osjetljivosti kako biste donosili pametnije odluke o antimikrobnoj djelotvornosti, profiliranju otpornosti ili razvoju terapija.

Ultrazvučna obrada za odvajanje biofilma

MIC test zasnovan na biofilmu obično mjeri vijabilnost bakterija ili inhibiciju rasta metodama kao što su zasijavanje na podlogu, brojanje kolonija ili mjerenje optičke gustoće. Ultrazvučna obrada je ključni korak u MIC testovima zasnovanim na biofilmu pri procjeni antimikrobne osjetljivosti mikroorganizama povezanih s biofilmom. Njena primarna funkcija je da odvoji ćelije ugrađene u matriks biofilma i rasprši ih u ujednačenu suspenziju radi tačne analize.
Biofilmovi su znatno otporniji na antimikrobne agense u poređenju s planktonskim ćelijama, pa je pravilno odvajanje ključno za tačnu analizu. Tokom ovog procesa ultrazvučni talasi stvaraju kontroliranu kavitaciju, razbijaju matriks biofilma i oslobađaju ugrađene ćelije u ujednačenu suspenziju unutar medija za oporavak. Ovaj korak omogućava preciznu procjenu vijabilnosti ćelija raspršenih iz biofilma metodama kao što su zasijavanje na podlogu, razrjeđivanje i brojanje kolonija. Pravilno razgrađivanje biofilma ultrazvučnom obradom sprječava da zaostale komponente matriksa štite ćelije, što bi inače moglo dovesti do podcjenjivanja antimikrobne aktivnosti. Sonikator za višejažične ploče UIP400MTP posebno je pogodan za ovu svrhu jer nudi precizne i ponovljive uslove ultrazvučne obrade, čime se osigurava pouzdana priprema test ploča velike propusnosti.

Zašto je ultrazvučna obrada neophodna u testovima minimalne inhibitorne koncentracije zasnovanim na biofilmu

Za mjerenje vijabilnosti i brojanje ćelija potrebno je potpuno i pouzdano odvajanje i raspršivanje pojedinačnih ćelija. UIP400MTP omogućava ujednačeno odvajanje biofilma i raspršivanje ćelija bez oštećenja, za pouzdane rezultate testa.

• Složenost biofilma: Biofilmovi su strukturirane mikrobne zajednice obavijene matriksom ekstracelularne polimerne supstance (EPS), koji štiti mikroorganizme i čini ih otpornijima na antimikrobne agense.
• Ujednačeno raspršivanje: Da bi se tačno izmjerila vijabilnost ćelija ugrađenih u biofilm ili njihova osjetljivost na antimikrobne agense, biofilm se prvo mora odvojiti i razgraditi u homogenu suspenziju.

Protokol testa minimalne inhibitorne koncentracije zasnovanog na biofilmu

Test minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) određuje najnižu koncentraciju antimikrobnog agensa potrebnu za inhibiciju vidljivog rasta mikroorganizama. Ovaj protokol je namijenjen mikroorganizmima povezanim s biofilmom i koristi sonikator za višejažične ploče UIP400MTP za razgrađivanje biofilma.

Korak 1: Priprema bakterijskog inokuluma

1. Pripremite bakterijsku suspenziju:
   Uzgajajte bakterije u odgovarajućim podlogama do sredine logaritamske faze.
   Razrijedite kulturu kako biste postigli standardiziranu gustoću ćelija (npr. 0,5 McFarlandov standard ili OD600 ~0,1).
2. Pripremite antimikrobne otopine:
   Razrijedite antimikrobni agens u odgovarajućem mediju kako biste dobili niz koncentracija (npr. dvostruka serijska razrjeđenja).
3. Rasporedite u ploču sa 96 jažica:
   Dodajte antimikrobne otopine u jažice standardne ploče sa 96 jažica, uz konačni volumen jažice od ~150–200 µL.
   Uključite kontrole rasta (bez antimikrobnog agensa) i kontrole sterilnosti (bez bakterijskog inokuluma).

Korak 2: Stvaranje biofilma na poklopcu s klinovima

• Postavite poklopac s klinovima:
  Postavite specijalni poklopac s klinovima na inokulirane jažice i pazite da klinovi budu potpuno uronjeni u bakterijsku suspenziju.
• Inkubirajte ploču:
  Inkubirajte na odgovarajućoj temperaturi (npr. 37°C) tokom određenog vremena (npr. 24 sata) u statičkim uslovima kako bi se omogućilo stvaranje biofilma na klinovima.

Korak 3: Izlaganje antimikrobnom agensu

• Isperite klinove:
  Uklonite poklopac s klinovima iz bakterijske suspenzije i nježno ga isperite u sterilnom fiziološkom rastvoru ili PBS-u kako biste uklonili slabo vezane planktonske ćelije.
• Izložite antimikrobnim agensima:
  Prenesite poklopac s klinovima na novu ploču sa 96 jažica koja sadrži ranije pripremljena antimikrobna razrjeđenja.
  Inkubirajte tokom definiranog perioda (npr. 24 sata) u statičkim uslovima kako bi antimikrobni agens mogao djelovati na biofilmove.

Korak 4: Ultrazvučna obrada sonikatorom za mikroploče UIP400MTP

Korak ultrazvučne obrade je ključan za odvajanje biofilmova s poklopaca s klinovima radi procjene vijabilnosti. Slijedite ove korake za sonikator UIP400MTP:

1. Pripremite postavku:
   Napunite svaku jažicu nove ploče sa 96 jažica medijem za oporavak (npr. neutralizirajućim bujonom ili sterilnim medijem za rast).
2. Prenesite poklopac s klinovima:
   Uklonite poklopac s klinovima s ploče za antimikrobni tretman.
   Isperite poklopac s klinovima u sterilnom fiziološkom rastvoru ili PBS-u kako biste uklonili zaostale antimikrobne agense.
3. Postavite ploču u sonikator:
   Pričvrstite poklopac s klinovima na ploču s medijem za oporavak.
   Stavite ploču s medijem za oporavak u sonikator UIP400MTP i pazite da ploča stoji centrirano i stabilno, kako je opisano u priručniku.
4. Podesite parametre ultrazvučne obrade:
   Postavite parametre ultrazvučne obrade na UIP400MTP (postavke se mogu prilagoditi biofilmu):
   Amplituda: 70–100%.
   Vrijeme ultrazvučne obrade: 1–3 minute (prilagodite prema strukturi biofilma) u cikličkom načinu rada.
5. Provedite ultrazvučnu obradu:
   Pokrenite proces ultrazvučne obrade. Ultrazvučni talasi će razgraditi matriks biofilma i odvojiti ćelije u medij za oporavak.
6. Nadzirite proces:
   Koristite priključni temperaturni senzor za praćenje temperature uzorka u jažicama. UIP400MTP se može povezati s laboratorijskim hladnjakom radi hlađenja.
7. Postupanje nakon ultrazvučne obrade:
   Odmah prenesite medij za oporavak koji sadrži odvojene biofilmove na novu sterilnu ploču za naknadnu analizu.

(A) Ploča koja sadrži TSB s 2% glukoze, korištena za stvaranje biofilma, oporavak ćelija i određivanje MIC-a i MBEC-a; (B) Poklopac s klinovima za stvaranje stafilokoknih biofilmova.
Ćelije biofilma stvorene na klinovima odvojene su ultrazvučnom obradom (Hielscher Ultrasound Technology) tokom 5 min u pločama sa 96 jažica koje sadrže svjež hranjivi medij za oporavak ćelija.
(Slika i studija: ©de Oliveira et al., 2016)

Korak 4: Procjena vijabilnosti

Zasijte i uzgajajte odvojene biofilmove:

1. Napravite serijska razrjeđenja medija za oporavak i zasijte ih na agar radi brojanja jedinica koje formiraju kolonije (CFU).
2. Procijenite MIC:
   Odredite MIC kao najnižu antimikrobnu koncentraciju koja potpuno inhibira vidljivi rast mikroorganizama u mediju za oporavak.

MIC minimalna inhibitorna koncentracija: primjer mikrotitarske ploče i tumačenje rezultata mikrorazrjeđenja.
(Studija i slika: ©Jaskiewicz et al. 2019)

Ko ima koristi od ultrazvučne obrade tokom MIC testova?

• Proizvođači medicinskih sredstava: Za ispitivanje djelotvornosti površinskih premaza i validaciju protokola čišćenja za sredstva sklona stvaranju biofilma.
• Klinički mikrobiolozi: Za tačnu dijagnostiku infekcija povezanih s implantatima (kao što je PJI) izdvajanjem bakterija iz medicinskih komponenti.
• Razvojni inženjeri u farmaciji: Za procjenu djelotvornosti novih antimikrobnih agenasa protiv otpornih patogena ugrađenih u biofilm.
• Akademski istraživači: Za provođenje ponovljivih studija velike propusnosti o biologiji biofilma i mehanizmima antimikrobne otpornosti.
• Timovi za industrijsku kontrolu kvaliteta: Za procjenu biološkog obraštanja i djelotvornosti dezinficijensa u industrijskim okruženjima (npr. primjenom standarda ASTM E2799-22).

Dizajn, proizvodnja i savjetovanje – kvalitet proizveden u Njemačkoj

Hielscher ultrazvučni uređaji poznati su po svom najvišem kvalitetu i standardima dizajna. Robusnost i jednostavno rukovanje omogućavaju nesmetanu integraciju naših ultrazvučnih uređaja u industrijska postrojenja. Hielscher sonikatori lako se nose s teškim uslovima i zahtjevnim okruženjima.

Hielscher Ultrasonics je ISO certificirana kompanija i posebnu pažnju posvećuje visokoučinkovitim ultrazvučnim uređajima koji imaju najsavremeniju tehnologiju i jednostavni su za korištenje. Naravno, Hielscher ultrazvučni uređaji u skladu su s CE oznakom i ispunjavaju zahtjeve UL, CSA i RoHs.

Pročitajte ovdje kako se UIP400MTP koristi za odvajanje biofilma u ASTM E2799 protokolu – ispitivanje djelotvornosti dezinficijensa protiv biofilma Pseudomonas aeruginosa pomoću MBEC testa.