Protokol za analizu minimalne inhibitorne koncentracije (MIC).

Test minimalne inhibitorne koncentracije na bazi biofilma (MIC) je suštinska metoda za procjenu efikasnosti antimikrobnih agenasa protiv mikroorganizama povezanih s biofilmom, koji pokazuju povećanu otpornost zbog svog zaštitnog ekstracelularnog matriksa. Ključni korak u ovom testu je razbijanje struktura biofilma kako bi se oslobodile ugrađene ćelije za tačnu procjenu održivosti. UIP400MTP sonikator ploča sa više jažica olakšava ovaj proces upotrebom fokusiranog ultrazvuka za stvaranje kontrolirane kavitacije, efikasno odvajajući ćelije biofilma i raspršujući ih u jednoličnu suspenziju. Ovaj precizan i reproducibilan poremećaj biofilma povećava pouzdanost i propusnost MIC testova, čineći UIP400MTP osnovnim alatom u unapređenju istraživanja biofilma.

Sonication for Biofilm Detachment

MIC test baziran na biofilmu obično mjeri vitalnost bakterija ili inhibiciju rasta koristeći metode kao što su postavljanje ploča, brojanje kolonija ili mjerenje optičke gustoće. Sonikacija je kritičan korak u MIC testovima zasnovanim na biofilmu kada se procjenjuje antimikrobna osjetljivost mikroorganizama povezanih s biofilmom. Njegova primarna funkcija je da odvoji i rasprši ćelije ugrađene u matriks biofilma u jednoličnu suspenziju za preciznu analizu.
Biofilmovi su znatno otporniji na antimikrobne agense u odnosu na planktonske ćelije, što čini pravilno odvajanje kritičnim za preciznu analizu. Tokom ovog procesa, ultrazvučni talasi stvaraju kontrolisanu kavitaciju, razbijajući matriks biofilma i oslobađajući ugrađene ćelije u uniformnu suspenziju unutar medijuma za oporavak. Ovaj korak omogućava preciznu procjenu održivosti ćelija dispergiranih u biofilmu putem metoda kao što su postavljanje na pločice, razrjeđivanje i brojanje kolonija. Pravilno narušavanje biofilma ultrazvukom sprečava zaostale komponente matriksa da štite ćelije, što bi inače moglo dovesti do potcjenjivanja antimikrobne aktivnosti. Sonikator ploča sa više jažica UIP400MTP je posebno pogodan za ovu svrhu, nudeći precizne i ponovljive uslove sonikacije kako bi se osigurala pouzdana i visoko propusna priprema ploča za analizu.

Zašto je ultrazvuk neophodna u testovima minimalne inhibitorne koncentracije na biofilmu

Za mjerenje vitalnosti i brojanje ćelija potrebno je potpuno i pouzdano odvajanje i disperzija pojedinačnih ćelija. UIP400MTP promoviše jednolično, neoštećujuće odvajanje biofilma i disperziju ćelija za robusne rezultate testa.

• Složenost biofilma: Biofilmovi su strukturirane mikrobne zajednice zatvorene u matricu ekstracelularne polimerne supstance (EPS), koja štiti mikroorganizme i čini ih otpornijima na antimikrobne agense.
• Ujednačena disperzija: Da bi se precizno izmjerila održivost ćelija ugrađenih u biofilm ili njihova osjetljivost na antimikrobna sredstva, biofilm se prvo mora ukloniti i razbiti u homogenu suspenziju.

Protokol za analizu minimalne inhibitorne koncentracije zasnovan na biofilmu

Test minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) određuje najnižu koncentraciju antimikrobnog agensa potrebnu za inhibiciju vidljivog rasta mikroorganizama. Ovaj protokol je dizajniran za mikroorganizme povezane s biofilmom, koristeći UIP400MTP sonikator ploča sa više jažica za razbijanje biofilma.

Korak 1: Priprema bakterijskog inokuluma

1. Pripremite bakterijsku suspenziju:
   Uzgajati bakterije u odgovarajućim medijima do srednje logaritamske faze.
   Razblažite kulturu da postignete standardizovanu gustinu ćelija (npr. 0,5 McFarland standard ili OD600 ~0,1).
2. Pripremite antimikrobne otopine:
   Razrijedite antimikrobni agens u odgovarajućem mediju kako biste stvorili raspon koncentracija (npr. dvostruka serijska razrjeđenja).
3. Nanesite u ploču sa 96 jažica:
   Dodajte antimikrobne rastvore u jažice standardne ploče sa 96 jažica, sa konačnom zapreminom jažice od ~150–200 µL.
   Uključuje kontrole rasta (bez antimikrobnih) i kontrole steriliteta (bez bakterijskog inokuluma).

Korak 2: Formiranje biofilma na poklopcu

• Pričvrstite poklopac za klin:
  Postavite specijalizirani poklopac za klinove na inokulirane jažice, osiguravajući da su klinovi potpuno uronjeni u bakterijsku suspenziju.
• Inkubirajte ploču:
  Inkubirajte na odgovarajućoj temperaturi (npr. 37°C) u određenom trajanju (npr. 24 sata) u statičkim uslovima kako bi se omogućilo stvaranje biofilma na klinovima.

Korak 3: Izlaganje antimikrobnim sredstvima

• Isperite klinove:
  Uklonite poklopac od bakterijske suspenzije i nježno isperite sterilnom fiziološkom otopinom ili PBS-om kako biste uklonili labavo pričvršćene planktonske stanice.
• Izlagati se antimikrobnim sredstvima:
  Prenesite poklopac s klinom u novu ploču sa 96 jažica koja sadrži prethodno pripremljena antimikrobna razrjeđenja.
  Inkubirajte određeni period (npr. 24 sata) u statičkim uslovima kako biste omogućili da antimikrobni agens djeluje na biofilmove.

Korak 4: Sonikacija sa Microplate Sonicatorom UIP400MTP

Korak obrade ultrazvukom je kritičan za odvajanje biofilma od poklopca klinova radi procjene održivosti. Slijedite ove korake za UIP400MTP sonikator:

1. Pripremite postavku:
   Napunite svježu ploču sa 96 jažica medijumom za oporavak (npr. neutralizirajući bujon ili sterilni medij za rast) u svaku jažicu.
2. Prenesite poklopac klina:
   Uklonite poklopac za klin sa ploče za antimikrobni tretman.
   Isperite poklopac u sterilnom fiziološkom rastvoru ili PBS-u da biste uklonili zaostale antimikrobne agense.
3. Postavite ploču u sonikator:
   Pričvrstite poklopac za klin na ploču za oporavak.
   Postavite ploču sa medijumom za oporavak u sonikator UIP400MTP, osiguravajući da ploča bude centrirana i stabilna kao u opisanom priručniku.
4. Podesite parametre sonikacije:
   Postavite parametre sonikacije na UIP400MTP (postavke se mogu prilagoditi biofilmu):
   Amplituda: 70–100%.
   Vrijeme obrade ultrazvukom: 1–3 minute (podesite na osnovu strukture biofilma) u režimu ciklusa.
5. Sonicate:
   Pokrenite proces sonikacije. Ultrazvučni talasi će poremetiti matriks biofilma i izbaciti ćelije u medijum za oporavak.
6. Pratite proces:
   Koristite temperaturni senzor koji se može priključiti da nadgledate temperaturu uzorka u bunarima. UIP400MTP se može povezati na laboratorijski rashladni uređaj za hlađenje.
7. Rukovanje nakon ultrazvuka:
   Odmah prenesite medij za oporavak koji sadrži odvojene biofilmove u svježu sterilnu ploču za naknadnu analizu.

(A) Ploča koja sadrži TSB sa 2% glukoze koja se koristi za formiranje biofilma, oporavak ćelija i određivanje MIC i MBEC; (B) Poklopac sa iglama za stvaranje stafilokoknih biofilma.
Ćelije biofilma formirane na iglicama su uklonjene ultrazvučnom obradom (Hielscher Ultrasound Technology) u trajanju od 5 minuta u pločama sa 96 jažica koje su sadržavale svježi medij za kulturu za oporavak ćelija.
(Slika i studija: ©de Oliveira et al., 2016.)

Korak 4: Procjena održivosti

Biofilmovi odvojeni od ploče i kulture:

1. Izvršite serijska razblaženja medijuma za oporavak i ploče na agar da biste nabrojali jedinice koje formiraju kolonije (CFU).
2. Procijenite MIC:
   Odredite MIC kao najnižu antimikrobnu koncentraciju koja potpuno inhibira vidljivi rast mikroba u mediju za oporavak.

Minimalna inhibicijska koncentracija MIC: Primjer mikrotitarske ploče i interpretacija rezultata mikrodilucije.
(Studija i slika: ©Jaskiewicz et al. 2019.)

Dizajn, proizvodnja i konsalting – Kvaliteta Made in Germany

Hielscher ultrasonicatori su poznati po najvišoj kvaliteti i standardima dizajna. Robusnost i jednostavno rukovanje omogućavaju nesmetanu integraciju naših ultrazvučnih aparata u industrijske objekte. Hielscher sonikatori lako se nose sa teškim uslovima i zahtevnim okruženjima.

Hielscher Ultrasonics je ISO sertifikovana kompanija i stavlja poseban naglasak na ultrazvučne aparate visokih performansi koji se odlikuju najsavremenijom tehnologijom i lakoćom korišćenja. Naravno, Hielscher ultrasonikatori su usklađeni sa CE i ispunjavaju zahtjeve UL, CSA i RoH.

Ovdje pročitajte kako se UIP400MTP koristi za odvajanje biofilma u ASTM E2799 protokolu – Testiranje efikasnosti dezinfekcionog sredstva protiv biofilma Pseudomonas aeruginosa pomoću MBEC testa.