Protokol MBEC testa koristeći sonicator za ploče sa 96 jažica UIP400MTP

MBEC test se koristi za određivanje koncentracije antimikrobnih agenasa potrebnih za eliminaciju biofilma formiranih na poklopcima. Da bi se procijenila održivost biofilma, biofilmovi se prvo moraju odvojiti od poklopca pločice s 96 jažica. Sonikacija je najpouzdanija i najefikasnija metoda za ovaj odred. Sonikator ploča sa više jažica UIP400MTP je posebno dizajniran za obradu ploča za analizu sa maksimalnom efikasnošću i praktičnošću, pojednostavljujući i ubrzavajući MBEC testove visokog protoka.

Sonication for Biofilm Detachment

Sonikacija je ključni korak u testovima minimalne koncentracije eradikacije biofilma (MBEC), omogućavajući efikasno uklanjanje ćelija biofilma sa njihovog površinskog pričvršćenja. Biofilmovi su inherentno strukturirane zajednice mikroorganizama umotanih u ekstracelularni matriks, što ih čini znatno otpornijim na antimikrobne agense u odnosu na planktonske ćelije. Tokom MBEC testova, sonikacija koristi ultrazvučne talase za generisanje kontrolisane kavitacije, narušavajući matriks biofilma i oslobađajući ugrađene ćelije u suspenziju. Ovaj korak osigurava da su ćelije biofilma ravnomjerno dispergirane u mediju za oporavak, olakšavajući preciznu procjenu održivosti putem presvlačenja, razrjeđivanja ili spektrofotometrijskih metoda. Bez odgovarajućeg odvajanja biofilma, rezidualne komponente matriksa mogle bi zaštititi ćelije, što dovodi do potcjenjivanja antimikrobne efikasnosti. Zbog toga je ultrazvuk neophodna za dobijanje pouzdanih i reproducibilnih MBEC vrijednosti, odražavajući istinski potencijal iskorenjivanja testiranih agenasa. Sonikator ploča sa više jažica UIP400MTP omogućava laku pripremu uzoraka visokog protoka u pločama za analizu.

Protokol za analizu minimalne koncentracije biofilma (MBEC).

Korak 1: Formiranje biofilma

1. Pripremite bakterijsku suspenziju:
   Uzgajajte bakterije u odgovarajućim podlogama do rasta u log fazi.
   Razrijedite bakterijsku kulturu do definirane optičke gustoće (npr. OD600 ~0,1).
2. Inokulirajte ploču sa 96 jažica:
   Dodajte bakterijsku suspenziju (npr. 150-200 µL) u svaku jažicu standardne mikrotitarske ploče sa 96 jažica.
3. Pričvrstite poklopac za klin:
   Postavite poklopac s klinom na inokuliranu ploču kako biste omogućili stvaranje biofilma na površinama klinova.
4. Inkubirajte ploču:
   Inkubirajte postavku na odgovarajućoj temperaturi (npr. 37°C) 24-48 sati bez mućkanja kako biste podstakli rast biofilma.

Korak 2: Tretman antimikrobnim agensima

• Pripremite antimikrobne otopine:
  Pripremite niz antimikrobnih koncentracija u svježim medijima.
  Izložite biofilmove antimikrobnim agensima:
  Uklonite poklopac s bakterijske kulture i isperite ga sterilnom fiziološkom otopinom ili PBS-om kako biste uklonili planktonske stanice.
  Postavite poklopac sa klinom u novu ploču sa 96 jažica koja sadrži antimikrobne rastvore.
• Inkubirajte ploču:
  Inkubirajte određeni period (npr. 24 sata) kako biste omogućili izlaganje antimikrobnim sredstvima.

Korak 3: Obrada ultrazvukom sa sonikatorom za ploče sa 96 jažica UIP400MTP

Korak obrade ultrazvukom je kritičan za odvajanje biofilma od poklopca klinova radi procjene održivosti. Slijedite ove korake za UIP400MTP sonikator:

1. Pripremite postavku:
   Napunite svježu ploču sa 96 jažica medijumom za oporavak (npr. neutralizirajući bujon ili svježi medij za rast) u svaku jažicu.
2. Prenesite poklopac klina:
   Uklonite poklopac za klin sa ploče za antimikrobni tretman.
   Isperite poklopac u sterilnom fiziološkom rastvoru ili PBS-u da biste uklonili zaostale antimikrobne agense.
3. Postavite ploču i sonikator:
   Pričvrstite poklopac za klin na ploču za oporavak.
   Postavite ploču sa medijumom za oporavak na platformu sonikatora UIP400MTP, osiguravajući da je ploča centrirana i stabilna.
4. Podesite parametre sonikacije:
   Postavite parametre sonikacije na UIP400MTP (Postavke se mogu prilagoditi biofilmu):
   Amplituda: 70–100%.
   Vrijeme obrade ultrazvukom: 1–3 minute (podesite na osnovu robusnosti biofilma) u režimu ciklusa.
5. Sonicate:
   Pokrenite proces sonikacije. Ultrazvučna vibracija će pomeriti biofilmove sa površina klinova u medijum za oporavak.
6. Pratite proces:
   Koristite temperaturni senzor koji se može priključiti da nadgledate temperaturu uzorka u bunarima. UIP400MTP se može povezati na laboratorijski rashladni uređaj za hlađenje.
7. Rukovanje nakon ultrazvuka:
   Odmah prenesite medij za oporavak (koji sada sadrži odvojene biofilmove) u svježu sterilnu ploču za analizu nizvodno.

(A) Ploča koja sadrži TSB sa 2% glukoze koja se koristi za formiranje biofilma, oporavak ćelija i
određivanje MIC i MBCB; (B) Poklopac sa iglama za stvaranje stafilokoknih biofilma. određivanje MIC i MBCB; (B) Poklopac sa iglama za stvaranje stafilokoknih biofilma.
Ćelije biofilma formirane na iglicama su uklonjene ultrazvučnom obradom (Hielscher Ultrasound Technology) u trajanju od 5 minuta u pločama sa 96 jažica koje su sadržavale svježi medij za kulturu za oporavak ćelija.
(Slika i studija: ©de Oliveira et al., 2016.)

Korak 4: Procjena održivosti

Biofilmovi odvojeni od ploče i kulture:

1. Izvršite serijska razblaženja medijuma za oporavak i ploče na agar da biste nabrojali jedinice koje formiraju kolonije (CFU).
   Alternativno, koristite kolorimetrijski ili fluorescentni test održivosti.
2. Snimi rezultate:
   Odredite MBEC kao najnižu koncentraciju antimikrobnog sredstva koja je iskorijenila održivost biofilma koji se može otkriti.

Dizajn, proizvodnja i konsalting – Kvaliteta Made in Germany

Hielscher ultrasonicatori su poznati po najvišoj kvaliteti i standardima dizajna. Robusnost i jednostavno rukovanje omogućavaju nesmetanu integraciju naših ultrazvučnih aparata u industrijske objekte. Hielscher sonikatori lako se nose sa teškim uslovima i zahtevnim okruženjima.

Hielscher Ultrasonics je ISO sertifikovana kompanija i stavlja poseban naglasak na ultrazvučne aparate visokih performansi koji se odlikuju najsavremenijom tehnologijom i lakoćom korišćenja. Naravno, Hielscher ultrasonikatori su usklađeni sa CE i ispunjavaju zahtjeve UL, CSA i RoH.

Ovdje pročitajte kako se UIP400MTP koristi za odvajanje biofilma kao korak pripreme uzorka tokom ASTM E2799 protokola za testiranje djelotvornosti dezinficijensa protiv biofilma Pseudomonas aeruginosa pomoću MBEC testa.