Protokol MBEC testa pomoću sonikatora za ploče s 96 jažica UIP400MTP

MBEC test se koristi za određivanje koncentracije antimikrobnih sredstava potrebne za eliminaciju biofilmova formiranih na poklopcima s klinovima. Da bi se procijenila vitalnost biofilma, biofilmovi se prvo moraju odvojiti s klinova poklopca ploče s 96 jažica. Ultrazvučna obrada (sonikacija) je najpouzdanija i najefikasnija metoda za to odvajanje. Sonikator za ploče s više jažica UIP400MTP posebno je osmišljen za obradu ploča za testove uz maksimalnu efikasnost i praktičnost, čime se pojednostavljuju i ubrzavaju visokoprotočni MBEC testovi.

Ultrazvučna obrada (sonikacija) za odvajanje biofilma

Ultrazvučna obrada (sonikacija) je ključan korak u testovima minimalne koncentracije za eradikaciju biofilma (MBEC) jer omogućava efikasno otpuštanje ćelija biofilma s površine na koju su prianjale. Biofilmovi su po svojoj prirodi strukturirane zajednice mikroorganizama obavijene vanćelijskim matriksom, zbog čega su znatno otporniji na antimikrobna sredstva u poređenju s planktonskim ćelijama. Tokom MBEC testova sonikacija pomoću ultrazvučnih talasa stvara kontrolisanu kavitaciju, razara matriks biofilma i oslobađa ugrađene ćelije u suspenziju. Ovaj korak osigurava da su ćelije biofilma ravnomjerno raspršene u mediju za oporavak, što olakšava tačnu procjenu vitalnosti putem zasijavanja na podlogu, razrjeđivanja ili spektrofotometrijskih metoda. Bez pravilnog odvajanja biofilma, preostale komponente matriksa mogle bi zaštititi ćelije, što bi dovelo do podcjenjivanja antimikrobne efikasnosti. Zbog toga je sonikacija nezaobilazna za dobivanje pouzdanih i ponovljivih MBEC vrijednosti koje odražavaju stvarni potencijal eradikacije ispitivanih sredstava. Sonikator za ploče s više jažica UIP400MTP omogućava jednostavnu visokoprotočnu pripremu uzoraka u pločama za testove.

Protokol testa minimalne koncentracije za eradikaciju biofilma (MBEC)

Korak 1: Formiranje biofilma

1. Pripremite bakterijsku suspenziju:
   Uzgajajte bakterije u odgovarajućim medijima do logaritamske faze rasta.
   Razrijedite bakterijsku kulturu do definisane optičke gustoće (npr. OD600 ~0,1).
2. Inokulirajte ploču s 96 jažica:
   Dodajte bakterijsku suspenziju (npr. 150–200 µL) u svaku jažicu standardne mikrotitarske ploče s 96 jažica.
3. Postavite poklopac s klinovima:
   Postavite poklopac s klinovima na inokuliranu ploču kako bi se omogućilo formiranje biofilma na površinama klinova.
4. Inkubirajte ploču:
   Inkubirajte sklop na odgovarajućoj temperaturi (npr. 37°C) tokom 24–48 sati bez mućkanja kako biste podstakli rast biofilma.

Korak 2: Tretman antimikrobnim sredstvima

• Pripremite antimikrobne otopine:
  Pripremite niz antimikrobnih koncentracija u svježim medijima.
  Izložite biofilmove antimikrobnim sredstvima:
  Uklonite poklopac s klinovima iz bakterijske kulture i isperite ga u sterilnom fiziološkom rastvoru ili PBS-u kako biste uklonili planktonske ćelije.
  Postavite poklopac s klinovima na novu ploču s 96 jažica koja sadrži antimikrobne otopine.
• Inkubirajte ploču:
  Inkubirajte tokom definisanog perioda (npr. 24 sata) kako bi se omogućila izloženost antimikrobnom sredstvu.

Korak 3: Ultrazvučna obrada (sonikacija) sonikatorom za ploče s 96 jažica UIP400MTP

Korak sonikacije je presudan za odvajanje biofilmova s poklopaca s klinovima radi procjene vitalnosti. Slijedite ove korake za sonikator UIP400MTP:

1. Pripremite postavku:
   Napunite novu ploču s 96 jažica medijem za oporavak (npr. neutralizirajućom bujonskom podlogom ili svježim podlogom za rast) u svakoj jažici.
2. Prenesite poklopac s klinovima:
   Uklonite poklopac s klinovima s ploče za antimikrobni tretman.
   Isperite poklopac s klinovima u sterilnom fiziološkom rastvoru ili PBS-u kako biste uklonili zaostala antimikrobna sredstva.
3. Postavite ploču i sonikator:
   Pričvrstite poklopac s klinovima na ploču s medijem za oporavak.
   Postavite ploču s medijem za oporavak na platformu sonikatora UIP400MTP, pazeći da ploča bude centrirana i stabilna.
4. Podesite parametre sonikacije:
   Postavite parametre sonikacije na UIP400MTP (postavke se mogu prilagoditi biofilmu):
   Amplituda: 70–100%.
   Vrijeme sonikacije: 1–3 minute (prilagodite prema otpornosti biofilma) u ciklusnom načinu rada.
5. Sonicirajte:
   Pokrenite proces sonikacije. Ultrazvučne vibracije će odvojiti biofilmove s površina klinova u medij za oporavak.
6. Pratite proces:
   Koristite priključni temperaturni senzor za praćenje temperature uzorka u jažicama. UIP400MTP se može povezati s laboratorijskim hladnjakom (chillerom) radi hlađenja.
7. Postupanje nakon sonikacije:
   Odmah prenesite medij za oporavak (koji sada sadrži odvojene biofilmove) u novu sterilnu ploču za daljnju analizu.

(A) Ploča koja sadrži TSB s 2% glukoze, korištena za formiranje biofilma, oporavak ćelija i
određivanje MIC-a i MBCB-a; (B) Poklopac s klinovima za formiranje stafilokoknih biofilmova. određivanje MIC-a i MBCB-a; (B) Poklopac s klinovima za formiranje stafilokoknih biofilmova.
Ćelije biofilma formirane na klinovima odvojene su sonikacijom (Hielscher Ultrasound Technology) tokom 5 min u pločama s 96 jažica koje sadrže svjež podlogu za kultivaciju radi oporavka ćelija.
(Slika i studija: ©de Oliveira et al., 2016)

Korak 4: Procjena vitalnosti

Zasijajte i kultivirajte odvojene biofilmove:

1. Napravite serijska razrjeđenja medija za oporavak i zasijajte ih na agar radi brojanja jedinica koje formiraju kolonije (CFU).
   Alternativno, koristite kolorimetrijski test vitalnosti ili test vitalnosti zasnovan na fluorescenciji.
2. Zabilježite rezultate:
   Odredite MBEC kao najnižu koncentraciju antimikrobnog sredstva koja je eradicirala detektabilnu vitalnost biofilma.

Dizajn, proizvodnja i savjetovanje – kvalitet proizveden u Njemačkoj

Hielscher ultrazvučni uređaji (ultrasonikatori) poznati su po najvišem kvalitetu i standardima dizajna. Robusnost i jednostavno rukovanje omogućavaju neometano integrisanje naših ultrazvučnih uređaja u industrijske pogone. Hielscher sonikatori lako se nose s teškim uslovima i zahtjevnim okruženjima.

Hielscher Ultrasonics je ISO certificirana kompanija i posebnu pažnju posvećuje visokoučinkovitim ultrazvučnim uređajima koji uključuju najsavremeniju tehnologiju i jednostavnost korištenja. Naravno, Hielscher ultrazvučni uređaji su usklađeni sa CE oznakom i ispunjavaju zahtjeve UL, CSA i RoHs.

Pročitajte ovdje kako se UIP400MTP koristi za odvajanje biofilma kao korak pripreme uzoraka tokom protokola ASTM E2799 za ispitivanje efikasnosti dezinficijensa protiv biofilma Pseudomonas aeruginosa pomoću MBEC testa.