Protokol koji koristi Hielscher multi-Sample Sonicators u biofilmskoj i proteomskoj analizi

Upotreba sonikatora sa više uzoraka, kao što su VialTweeter Multi-Tube Sonicator i UIP400MTP Microplate Sonicator, pojednostavljuje laboratorijske tokove rada za aplikacije visoke propusnosti. Oba uređaja omogućavaju preciznu i ujednačenu ultrazvučnu obradu na više uzoraka, minimizirajući varijabilnost i poboljšavajući reproduktivnost. Ovo je posebno korisno u eksperimentima koji zahtijevaju dosljednu lizu uzorka, odvajanje biofilma, ekstrakciju proteina ili proteolitičku digestiju, gdje su ručne metode ili metode jednog uzorka manje efikasne i sklone nedosljednosti.

Pojednostavite radni tok sa sonikatorima sa više uzoraka

UIP400MTP, na primjer, omogućava istovremenu ultrazvučnu obradu jažica mikroploče, osiguravajući ravnomjerno odvajanje biofilma ili ćelijskog materijala. U međuvremenu, VialTweeter nudi preciznu lizu i homogenizaciju više uzoraka epruveta bez unakrsne kontaminacije. Ovi sonikatori značajno smanjuju vrijeme obrade, poboljšavaju eksperimentalnu ponovljivost i održavaju visok integritet uzorka, što ih čini nezamjenjivim alatima u mikrobiologiji, proteomici i istraživanju molekularne biologije.
Ispod je detaljan protokol koji ilustruje upotrebu modela sonikatora sa više uzoraka Hielscher, VialTweeter Multi-Tube Sonicator i Microplate Sonicator UIP400MTP, u studiji koja uključuje formiranje biofilma E. coli i naknadnu proteomsku analizu.

Protokol: Formiranje, odvajanje i proteomska analiza biofilma korištenjem Hielscherovih sonikatora za više uzoraka

1. Priprema bakterijske kulture

• Kultura bakterije E. coli (soj W3110) na 30°C, temperatura pogodna za formiranje biofilma E. coli, u triptonskom bujonu (TB) mediju koji sadrži:
  – 10 g/L triptona
  – 5 g/L NaCl
• Dodatak antibioticima po potrebi kako bi se osiguralo zadržavanje plazmida.
• Za mikroskopiju i studije aktivnosti promotora, koristite soj W3110 E. coli sa genomski poboljšanim GFP (eGFP) reporterom pod kontrolom rplL promotora.
• Koristite GFP reporter plazmide za različite promotere (npr. csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) za mjerenje aktivnosti promotera.

2. Uzgoj i odvajanje biofilma

• Zasijejte 1,5 mL razrijeđene bakterijske kulture po jažici u ploču sa 12 jažica (CellStar ploče sa 12 jažica, Greiner Bio-One).
• Inkubirajte kako biste omogućili stvaranje biofilma.
• Pažljivo uklonite planktonsku (neprilijepljenu) kulturu.

– Isperite svaku jažicu sa 500 µL PBS.
– Odvojite priključene ćelije sonikacijom ploče sa 12 jažica u sonikatoru za mikroploče UIP400MTP. UIP400MTP osigurava uniformno odvajanje isporukom konzistentne ultrazvučne energije kroz sve bušotine.
– Postavke sonikacije: 60% amplituda, ciklusni režim: 60 sekundi UKLJUČENO / 30 sekundi ISKLJUČENO.

3. Sakupljanje ćelija i liza

• Centrifugirajte odvojene ćelije biofilma na 4500 g 5 minuta.
• Operite peletirane ćelije sa PBS.
• Resuspendirajte ćelije u 100 µL 2% natrijum lauroil sarkozinata (SLS) i inkubirajte na 95°C 15 minuta.
• Sonicate koristeći VialTweeter Multi-Tube Sonicator kako biste osigurali potpunu lizu ćelija.
  – Postavke sonikacije: 100% amplituda, 50 s UKLJUČENO / 10 s ISKLJUČENO za ukupno 10 minuta rada; držati uzorke na ledu.

4. Redukcija i alkilacija

• Dodajte 5 mM tris(2-karboksietil)fosfina (TCEP) da smanjite disulfidne veze i inkubirajte na 95°C 15 minuta.
• Alkilirajte proteine sa 10 mM jodoacetamida 30 minuta na 25°C.

5. Kvantifikacija proteina i probava

• Centrifugirajte lizate za čišćenje otpada.
• Kvantifikujte ukupni sadržaj proteina koristeći Pierce BCA Protein Assay Kit.
• Provarite 50 µg ukupnog proteina sa 1 µg tripsina u rastvoru koji sadrži 2% SLS i 100 mM amonijum bikarbonata.
• Inkubirajte reakciju varenja preko noći na 30°C.

6. Prečišćavanje peptida

• Precipitirajte SLS dodavanjem 1,5% trifluorosirćetne kiseline (TFA), a zatim centrifugirajte.
• Pročistite peptide koristeći C18 mikrospin kolone.
• Osušite prečišćene peptide i resuspendirajte u 0,1% TFA.

7. Tekuća hromatografija-masena spektrometrija (LC-MS/MS)

• Analizirajte peptide na Q-Exactive Plus masenom spektrometru u kombinaciji sa Ultimate 3000 RSLC nano sistemom.
• Odvojite peptide koristeći HPLC kolonu reverzne faze (75 µm × 42 cm) napunjenu C18 smolom (2,4 µm).
• Nanesite gradijent od 2% do 35% rastvarača B (acetonitril sa 0,15% mravlje kiseline) tokom 140 minuta.
• Pribavite podatke koristeći MS skeniranje visoke rezolucije praćeno tandemskim MS/MS skeniranjem 10 najintenzivnijih jona.

8. Analiza podataka

• Obraditi sirove LC-MS podatke koristeći softver Progenesis.
• Izvezite .mgf datoteke i analizirajte ih pomoću MASCOT.
• Izvršite kvantifikaciju peptida koristeći SafeQuant za kontrolu kvaliteta i podešavanje lažnog otkrića.
• Provedite sve eksperimente u duplikatu ili tri primjerka kako biste osigurali ponovljivost.

Sonikatori za više uzoraka za visokopropusnu pripremu uzoraka

Modeli sonikatora sa više uzoraka VialTweeter i UIP400MTP značajno poboljšavaju preciznost i efikasnost eksperimentalnih tokova rada, posebno u istraživanju biofilma i proteomici. Njihova sposobnost da obrađuju više uzoraka ujednačeno osigurava kapacitet visoke propusnosti bez ugrožavanja kvaliteta podataka. Ove prednosti, u kombinaciji s naprednim tijekovima rada koji su gore navedeni, čine Hielscher sonikatore sa više uzoraka bitnim alatima za moderna biološka istraživanja.

Dizajn, proizvodnja i konsalting – Kvaliteta Made in Germany

Hielscher ultrasonicatori su poznati po najvišoj kvaliteti i standardima dizajna. Robusnost i jednostavan rad omogućavaju nesmetanu integraciju naših ultrazvučnih aparata u industrijske objekte. Hielscher ultrasonikatori lako se nose sa teškim uslovima i zahtevnim okruženjima.

Hielscher Ultrasonics je ISO sertifikovana kompanija i stavlja poseban naglasak na ultrazvučne aparate visokih performansi koji se odlikuju najsavremenijom tehnologijom i lakoćom korišćenja. Naravno, Hielscher ultrasonikatori su usklađeni sa CE i ispunjavaju zahtjeve UL, CSA i RoH.