Protokol za korištenje Hielscher višeuzorkovnih sonikatora u analizi biofilma i proteomici

Korištenje višeuzorkovnih sonikatora, kao što su VialTweeter Multi-Tube Sonicator i UIP400MTP Microplate Sonicator, pojednostavljuje laboratorijske radne tokove za primjene visokog protoka uzoraka. Oba uređaja omogućavaju preciznu i ujednačenu ultrazvučnu obradu većeg broja uzoraka, čime se smanjuje varijabilnost i poboljšava ponovljivost. To je posebno korisno u eksperimentima koji zahtijevaju dosljednu lizu uzoraka, odvajanje biofilma, ekstrakciju proteina ili proteolitičku digestiju, gdje su ručne metode ili metode za pojedinačne uzorke manje efikasne i sklone nedosljednosti.

Pojednostavite radne tokove pomoću višeuzorkovnih sonikatora

UIP400MTP, na primjer, omogućava istovremenu ultrazvučnu obradu jažica mikroploče, čime se osigurava ujednačeno odvajanje biofilmova ili staničnog materijala. S druge strane, VialTweeter nudi preciznu lizu i homogenizaciju većeg broja uzoraka u epruvetama bez unakrsne kontaminacije. Ovi sonikatori znatno skraćuju vrijeme obrade, poboljšavaju ponovljivost eksperimenata i održavaju visok integritet uzoraka, zbog čega su nezamjenjivi alati u istraživanjima iz mikrobiologije, proteomike i molekularne biologije.
U nastavku je detaljan protokol koji prikazuje korištenje Hielscher modela višeuzorkovnih sonikatora, VialTweeter Multi-Tube Sonicator i Microplate Sonicator UIP400MTP, u studiji koja obuhvata formiranje biofilma bakterije E. coli i naknadnu proteomsku analizu.

Protokol: formiranje biofilma, odvajanje i proteomska analiza pomoću Hielscher višeuzorkovnih sonikatora

1. Priprema bakterijske kulture

• Uzgajajte bakterije E. coli (soj W3110) na 30°C, temperaturi pogodnoj za formiranje biofilma bakterije E. coli, u podlozi triptonske čorbe (TB) koja sadrži:
  – 10 g/L triptona
  – 5 g/L NaCl
• Prema potrebi dodajte antibiotike kako biste osigurali zadržavanje plazmida.
• Za mikroskopiju i studije aktivnosti promotora koristite soj E. coli W3110 s genomskim reporterom pojačanog GFP-a (eGFP) pod kontrolom promotora rplL.
• Koristite GFP reporterske plazmide za različite promotore (npr. csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) radi mjerenja aktivnosti promotora.

2. Uzgoj i odvajanje biofilma

• Zasijte 1,5 mL razrijeđene bakterijske kulture po jažici u ploču s 12 jažica (CellStar ploče s 12 jažica, Greiner Bio-One).
• Inkubirajte kako bi se omogućilo formiranje biofilma.
• Pažljivo uklonite planktonsku (neadherentnu) kulturu.

– Svaku jažicu isperite sa 500 µL PBS-a.
– Pričvršćene stanice odvojite sonikacijom ploče s 12 jažica u mikropločastom sonikatoru UIP400MTP. UIP400MTP osigurava ujednačeno odvajanje dovodeći dosljednu ultrazvučnu energiju u sve jažice.
– Postavke sonikacije: amplituda 60%, ciklični način rada: 60 s UKLJ. / 30 s ISKLJ.

3. Prikupljanje i liza stanica

• Odvojene stanice biofilma centrifugirajte na 4.500 g tokom 5 minuta.
• Istaložene stanice isperite PBS-om.
• Resuspendirajte stanice u 100 µL 2% natrijevog lauroil sarkozinata (SLS) i inkubirajte na 95°C tokom 15 minuta.
• Sonikirajte pomoću VialTweeter Multi-Tube Sonicatora kako biste osigurali potpunu lizu stanica.
  – Postavke sonikacije: amplituda 100%, 50 s UKLJ. / 10 s ISKLJ. uz ukupno trajanje rada od 10 min; uzorke držite na ledu.

4. Redukcija i alkilacija

• Dodajte 5 mM tris(2-karboksietil)fosfina (TCEP) radi redukcije disulfidnih veza i inkubirajte na 95°C tokom 15 minuta.
• Alkilirajte proteine s 10 mM jodoacetamida tokom 30 minuta na 25°C.

5. Kvantifikacija proteina i digestija

• Centrifugirajte lizate kako biste uklonili ostatke.
• Kvantificirajte ukupni sadržaj proteina pomoću Pierce BCA Protein Assay Kita.
• Digestirajte 50 µg ukupnih proteina s 1 µg tripsina u otopini koja sadrži 2% SLS-a i 100 mM amonijevog bikarbonata.
• Reakciju digestije inkubirajte preko noći na 30°C.

6. Pročišćavanje peptida

• Istaložite SLS dodavanjem 1,5% trifluorosirćetne kiseline (TFA), zatim centrifugirajte.
• Pročistite peptide pomoću C18 mikrospin kolona.
• Osušite pročišćene peptide i resuspendirajte ih u 0,1% TFA.

7. Tečna hromatografija–masena spektrometrija (LC-MS/MS)

• Analizirajte peptide na masenom spektrometru Q-Exactive Plus spojenom sa sistemom Ultimate 3000 RSLC nano.
• Razdvojite peptide pomoću HPLC kolone s obrnutom fazom (75 µm × 42 cm) punjene C18 smolom (2,4 µm).
• Primijenite gradijent od 2% do 35% otapala B (acetonitril s 0,15% mravlje kiseline) tokom 140 minuta.
• Podatke prikupljajte pomoću MS skenova visoke rezolucije, nakon kojih slijede tandemski MS/MS skenovi 10 najintenzivnijih iona.

8. Analiza podataka

• Obradite neobrađene LC-MS podatke pomoću softvera Progenesis.
• Izvezite .mgf datoteke i analizirajte ih pomoću MASCOT-a.
• Kvantifikaciju peptida provedite pomoću SafeQuanta radi kontrole kvaliteta i korekcije lažnih otkrića.
• Sve eksperimente provedite u duplikatu ili triplikatu kako biste osigurali ponovljivost.

Višeuzorkovni sonikatori za pripremu uzoraka visokog protoka

Modeli višeuzorkovnih sonikatora VialTweeter i UIP400MTP znatno povećavaju preciznost i efikasnost eksperimentalnih radnih tokova, posebno u istraživanju biofilma i proteomici. Njihova sposobnost ujednačene obrade većeg broja uzoraka osigurava kapacitet visokog protoka uzoraka bez ugrožavanja kvaliteta podataka. Ove prednosti, zajedno s pojednostavljenim radnim tokovima opisanim iznad, čine Hielscher višeuzorkovne sonikatore ključnim alatima za savremena biološka istraživanja.

Dizajn, proizvodnja i savjetovanje – kvalitet proizvedeni u Njemačkoj

Hielscher ultrazvučni uređaji poznati su po najvišem kvalitetu i standardima dizajna. Robusnost i jednostavno rukovanje omogućavaju besprijekornu integraciju naših ultrazvučnih uređaja u industrijske pogone. Hielscher ultrazvučni uređaji lako podnose teške uslove i zahtjevna okruženja.

Hielscher Ultrasonics je ISO certificirana kompanija i posebnu pažnju posvećuje visokoučinkovitim ultrazvučnim uređajima s najsavremenijom tehnologijom i jednostavnošću korištenja. Naravno, Hielscher ultrazvučni uređaji su u skladu s CE oznakom i ispunjavaju zahtjeve UL, CSA i RoHs.