Deparafinizacija i ekstrakcija proteina iz FFPE

Olakšajte ekstrakciju proteina iz odsječaka tkiva fiksiranih u parafin (FFPE) koristeći optimiziranu kombinaciju deparafinizacije, solubilizacije i ultrazvuka s VialTweeter ultrasonikatorom s više cijevi. Ovaj protokol podržava nizvodnu proteomiku zasnovanu na masovnoj spektrometriji i kompatibilan je sa SP3 čišćenjem i radnim tokovima enzimske digestije.

Ovaj SOP je namijenjen laboratorijskom osoblju uključenom u proteomsku analizu uzoraka FFPE tkiva koristeći ultrazvuk visokih performansi. Optimiziran je za do deset FFPE uzoraka obrađenih paralelno pomoću VialTweeter Multi-Tube Sonicatora.

Protokol: Ekstrakcija proteina iz FFPE uzoraka pomoću VialTweeter-a

Materijali i reagensi

reagensi

• ksilen (histološki stupanj)
• Etanol (apsolutno 96%)
• pufer za lizu:

6 M gvanidin hidrohlorid
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (tris(2-karboksietil)fosfin)
40 mM CAA (2-kloroacetamid)

• Inhibitor proteaze (opciono; npr. cOmplete™ mini bez EDTA)

Oprema

• VialTweeter Multi-Tube Ultrasonicator
• 1,5 mL ili 2,0 mL epruvete za mikrocentrifugu sa malim vezivanjem
• Toplotni blok ili inkubator (95°C i 80°C postavke)
• Mikrocentrifuga
• Termomikser (opciono, ali se preporučuje)

Sample Input

• 1-2 sekcije FFPE tkiva debljine 10 µm po uzorku (tj. po bočici)

ili

• Ukupno ~100 µg tkiva po uzorku (tj. po bočici)

Napomena: Koristite svježe oštrice za mikrotomiju kako biste minimizirali kontaminaciju parafinskim ostacima.

Procedura

1. deparafinizacija
   1. Prebacite FFPE sekcije u epruvete za mikrocentrifugu sa malim vezivanjem.
   2. Dodajte 1 mL ksilena, kratko promiješajte.
   3. Inkubirajte 10 minuta na sobnoj temperaturi.
   4. Centrifugirajte na 14.000 × g 2 minute; odbaciti supernatant.
   5. Ponovite pranje ksilenom još jednom (koraci 2-4).
   6. Isperite pelet sa 1 mL 96% etanola, promešajte, zatim centrifugirajte na 14.000 × g 2 minuta. Odbaciti supernatant.
   7. Ponovite pranje etanolom još jednom (ukupno 2 pranja etanolom).
   8. Pelet se suši na vazduhu 10 minuta na sobnoj temperaturi sa otvorenim poklopcima da bi se ispario zaostali etanol.
2. Ekstrakcija proteina i sonikacija
   1. Dodajte 200 µL pufera za lizu u svaku suhu peletu.
      Napomena: Iako sonikator prima do 1 mL, 200 µL je optimalno za daljnju obradu.

   2. Miješati vorteksiranjem ili blagim pipetiranjem.
3. Prva termalna inkubacija
   1. Inkubirajte epruvete na 95 °C 30 minuta, uz miješanje na 400 o/min koristeći termomikser ili toplinski blok.
   2. Ostavite uzorke da se ohlade na sobnoj temperaturi 5 minuta.
4. Prva sonikacija sa VialTweeterom
   1. Stavite epruvete u VialTweeter.
   2. Postavite VialTweeter UP200St na vrijednosti ispod i izvršite ultrazvučnu obradu.
Sonicator Settings
• Postavite amplitudu (A) na 100%
• Postavite režim pulsiranja (C) na 100%
• Period: Uključeno
• On Time: 60s
• Vrijeme isključenja: 30 s
• Granična vrijednost: 15 min (odgovara 10 ciklusa)
(Napomena o proračunu: (60 s uključeno + 30 s isključeno) × 10 ciklusa = 900 s = 15 min)
5. Druga termička inkubacija
   Uklonite epruvete i ponovo inkubirajte na 95 °C 15 minuta, 400 o/min.
6. Second Sonication
   Ponovite sonikaciju na VialTweeter-u koristeći iste postavke (kao gore) za dodatnih 10 ciklusa (ukupno 15 minuta).
7. Pojašnjenje lizata
   1. Centrifugirajte uzorke na 13.000 × g 10 minuta na 23°C (sobna temperatura).
   2. Pažljivo sakupite supernatant u novu Eppendorf epruvetu od 2,0 mL Safe-lock. Izbjegavajte ometanje peleta.
8. Downstream Processing
   Lizat je sada spreman za SP3 čišćenje i enzimsku digestiju.

Bilješke i najbolji primjeri iz prakse

1. Rizik od pregrijavanja tokom ultrazvuka je ublažen programiranim ON/OFF ciklusima.
2. Izbjegavajte vorteksiranje nakon sonikacije kako biste spriječili agregaciju proteina.

Odlaganje otpada i sigurnost

Tabela u nastavku daje vam indikaciju približnog kapaciteta obrade naših ultrazvučnih aparata veličine laboratorija: