Deparafinizacija i ekstrakcija proteina iz FFPE

Olakšajte ekstrakciju proteina iz FFPE (formalinom fiksiranih, parafinom ukalupljenih) tkivnih rezova optimiziranom kombinacijom deparafinizacije, solubilizacije i ultrazvučne obrade (sonikacije) pomoću višeepruvetnog ultrazvučnog uređaja VialTweeter. Ovaj protokol podržava proteomiku zasnovanu na masenoj spektrometriji u narednim koracima i kompatibilan je s radnim tokovima SP3 pročišćavanja i enzimske digestije.

Ovaj SOP je namijenjen laboratorijskom osoblju koje se bavi proteomskom analizom FFPE uzoraka tkiva primjenom visokoučinkovite ultrazvučne obrade. Optimiziran je za do deset FFPE uzoraka koji se obrađuju paralelno pomoću višeepruvetnog sonikatora VialTweeter.

Protokol: ekstrakcija proteina iz FFPE uzoraka pomoću uređaja VialTweeter

Materijali i reagensi

Reagensi

• Ksilen (histološke čistoće)
• Etanol (apsolutni 96%)
• Pufer za lizu:

6 M gvanidin hidroklorid
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (tris(2-karboksietil)fosfin)
40 mM CAA (2-hloracetamid)

• Inhibitor proteaza (opcionalno; npr. cOmplete™ mini bez EDTA)

Oprema

• Višeepruvetni ultrazvučni uređaj VialTweeter
• Mikrocentrifugalne epruvete od 1,5 mL ili 2,0 mL s niskim vezanjem
• Grijaći blok ili inkubator (postavke 95°C i 80°C)
• Mikrocentrifuga
• Thermomixer (opcionalno, ali preporučeno)

Ulazni uzorak

• 1–2 reza FFPE tkiva debljine 10 µm po uzorku (tj. po epruveti)

ILI

• Ukupno ~100 µg tkiva po uzorku (tj. po epruveti)

Napomena: Za mikrotomiju koristite nove oštrice kako biste smanjili kontaminaciju česticama parafina.

Postupak

1. Deparafinizacija
   1. Prenesite FFPE rezove u mikrocentrifugalne epruvete s niskim vezanjem.
   2. Dodajte 1 mL ksilena, kratko promiješajte na vorteksu.
   3. Inkubirajte 10 minuta na sobnoj temperaturi.
   4. Centrifugirajte na 14.000 × g tokom 2 minute; odbacite supernatant.
   5. Operite ksilenom još jednom (koraci 2–4).
   6. Operite talog s 1 mL 96% etanola, promiješajte na vorteksu, zatim centrifugirajte na 14.000 × g tokom 2 minute. Odbacite supernatant.
   7. Ponovite pranje etanolom još jednom (ukupno 2 pranja etanolom).
   8. Sušite talog na zraku 10 minuta na sobnoj temperaturi s otvorenim poklopcima kako bi ispario zaostali etanol.
2. Ekstrakcija proteina i ultrazvučna obrada
   1. Dodajte 200 µL pufera za lizu u svaki suhi talog.

      Napomena: Iako sonikator može primiti do 1 mL, 200 µL je optimalno za naknadnu obradu.

   2. Promiješajte vorteksiranjem ili nježnim pipetiranjem.
3. Prva termalna inkubacija
   1. Inkubirajte epruvete na 95 °C tokom 30 min, uz miješanje na 400 rpm pomoću thermomixera ili grijaćeg bloka.
   2. Ostavite uzorke da se hlade na sobnoj temperaturi 5 min.
4. Prva ultrazvučna obrada pomoću uređaja VialTweeter
   1. Postavite epruvete u VialTweeter.
   2. Postavite VialTweeter UP200St na dolje navedene vrijednosti i provedite ultrazvučnu obradu.
Postavke sonikatora
• Podesite amplitudu (A) na 100%
• Podesite pulsni režim (C) na 100%
• Period Clock: On
• On Time: 60s
• Off Time: 30s
• Limit Value: 15 min (odgovara 10 ciklusa)
(Napomena o proračunu: (60 s On + 30 s Off) × 10 ciklusa = 900 s = 15 min)
5. Druga termalna inkubacija
   Izvadite epruvete i ponovo inkubirajte na 95 °C tokom 15 min, 400 rpm.
6. Druga ultrazvučna obrada
   Ponovite ultrazvučnu obradu na uređaju VialTweeter s istim postavkama (kao gore) za dodatnih 10 ciklusa (ukupno 15 min).
7. Bistrenje lizata
   1. Centrifugirajte uzorke na 13.000 × g tokom 10 min na 23°C (sobna temperatura).
   2. Pažljivo prenesite supernatant u novu Safe-lock Eppendorf epruvetu od 2,0 mL. Izbjegavajte diranje taloga.
8. Naknadna obrada
   Lizat je sada spreman za SP3 pročišćavanje i enzimsku digestiju.

Napomene i najbolje prakse

1. Rizik od pregrijavanja tokom ultrazvučne obrade ublažava se programiranim ON/OFF ciklusima.
2. Izbjegavajte vorteksiranje nakon ultrazvučne obrade kako biste spriječili agregaciju proteina.

Zbrinjavanje otpada i sigurnost

Tabela ispod daje okvirnu naznaku približnog kapaciteta obrade naših laboratorijskih ultrazvučnih uređaja: