FFPE priprema uzoraka velikog protoka: ekstrakcija proteina i smicanje nukleinskih kiselina
Uz visokoprotočni ultrazvučni uređaj UIP400MTP, Hielscher Ultrasonics odgovara na izazove pripreme tkiva fiksiranog formalinom i uloženog u parafin (FFPE). Saznajte kako ultrazvučna obrada obrađuje FFPE uzorke u velikom broju za FFPE deparafinizaciju, lizu tkiva, homogenizaciju, ekstrakciju proteina i smicanje DNK/RNK! Iskoristite prednosti ultrazvučne pripreme FFPE tkiva – obrada velikog broja uzoraka u pločama s više jažica! Dobijte uzorke visokog kvaliteta i velike brojeve uzoraka za pouzdane rezultate istraživanja! I na kraju, ali ne manje važno, uštedite vrijeme i novac!
Priprema FFPE uzoraka olakšana visokoprotočnom sonikacijom
Fiksacija formalinom i uklapanje u parafin (FFPE) najčešća je metoda za očuvanje i arhiviranje čvrstih tkiva. Ekstrakcija biomolekula iz FFPE uzoraka tkiva često predstavlja značajan izazov zbog kvaliteta pohranjenih uzoraka. Ovi uzorci, koji su neprocjenjivo vrijedni u molekularnoj biologiji i kliničkim istraživanjima, pružaju bogat izvor bioloških informacija za retrospektivne studije i validaciju dijagnostičkih biomarkera. Međutim, postupak fiksacije formalinom i uklapanja u parafin, iako čuva arhitekturu i morfologiju tkiva, otežava ekstrakciju nukleinskih kiselina i proteina visokog kvaliteta. Formalin uzrokuje umrežavanje nukleinskih kiselina i proteina, što dovodi do molekularne fragmentacije i kemijskih modifikacija. Saznajte kako visokoprotočni ultrazvučni uređaj UIP400MTP prevazilazi izazove pripreme FFPE uzoraka!
Ultrazvučni uređaj za efikasnu pripremu FFPE uzoraka
- Jednostavan tok rada: pojednostavljeni postupci prilagođeni korisniku.
- Deparafinizacija, ekstrakcija proteina, smicanje DNK / RNK
- Brza visokoprotočna obrada: efikasno rukovanje pločama s više jažica.
- Efikasna deparafinizacija: poboljšana solubilizacija proteina.
- Neotrovna otapala: izbjegava se upotreba štetnih organskih otapala kao što je ksilen.
UIP400MTP visokoprotočni sonikator za visokoprotočnu obradu FFPE uzoraka u pločama s više jažica
Napredak u tehnikama ekstrakcije proteina iz FFPE tkiva
Hielscher Ultrasonics odgovara na izazove visokoprotočne pripreme FFPE uzoraka. Sonikacija koristi ultrazvučne valove za stvaranje mehaničkih vibracija i fokusirane kavitacije, čime se efikasno razgrađuju ćelijske strukture i poboljšava solubilizacija biomolekula. Ova tehnika stekla je popularnost zbog sposobnosti da poveća efikasnost i prinos ekstrakcije nukleinskih kiselina i proteina iz FFPE tkiva, kao i smicanja DNK i RNK za pripremu biblioteka. Veoma je važno naglasiti da ultrazvučna obrada sonikatorom za ploče s više jažica UIP400MTP održava integritet ovih biomolekula za nizvodne primjene.
Smicanje nukleinskih kiselina visokoprotočnom ultrazvučnom obradom
Ultrazvučni uređaj za ploče s više jažica UIP400MTP za upotrebu u visokoprotočnim okruženjima podiže pripremu FFPE uzoraka na novi nivo. Ova metoda sonikacije u pločama s više jažica pruža efikasno i pouzdano rješenje za istovremenu obradu više uzoraka. Omogućava brzu i ponovljivu ekstrakciju DNK, RNK i proteina, koji su ključni za različite analitičke tehnike, uključujući sekvenciranje nove generacije (NGS), kvantitativni PCR i proteomske analize. Optimizacija parametara sonikacije, kao što su amplituda, trajanje i temperatura, dodatno poboljšava kvalitet i količinu ekstrahovanih biomolekula.
Sonikator UIP400MTP za ploče s više jažica nudi značajne prednosti za fragmentaciju i smicanje DNK i RNK iz FFPE tkiva. Jedna od istaknutih karakteristika ovog sistema jeste mogućnost postizanja uskog raspona veličina fragmenata DNK i RNK, uz preciznu podesivost intenziteta sonikacije kako bi se dobili kratki fragmenti od 150-200 parova baza (bp) ili duži fragmenti od 15-20 kilobaznih parova (kbp). Ova svestranost čini UIP400MTP nezamjenjivim i za primjene sekvenciranja kratkih čitanja i za primjene sekvenciranja dugih čitanja, osiguravajući rezultate visokog kvaliteta za sekvenciranje nove generacije (NGS) i sekvenciranje cijelog genoma (WGS). Njegova precizna kontrola veličine fragmenata ključna je za istraživače u svim oblastima genomike, jer omogućava pripremu uzoraka prema specifikacijama.
Kontaktirajte nas za napredna rješenja za FFPE tkivo
Otkrijte sonikator za ploče s više jažica UIP400MTP za efikasno dobijanje biomolekula iz FFPE uzoraka, uz očuvanje integriteta ekstrahovanih nukleinskih kiselina i proteina i osiguranje ponovljivosti rezultata. Ova tehnologija se besprijekorno integriše s drugim preparativnim i analitičkim tokovima rada, pojednostavljujući i unapređujući molekularna istraživanja koja koriste arhive FFPE tkiva.
Fiksativi i njihovi efekti
Fiksacija je ključni korak u pripremi uzoraka koji čuva ćelijske strukture, zaustavlja biohemijske reakcije i sprječava razgradnju. Zavisno od specifičnih eksperimentalnih zahtjeva koriste se različiti fiksativi. Dva najčešća fiksativa su formaldehid i paraformaldehid, koji umrežavaju proteine i nukleinske kiseline te čuvaju morfologiju i antigenost ćelija i tkiva. Drugi fiksativi, kao što su etanol, metanol i glutaraldehid, koriste se za specifične primjene.
Fiksativi formaldehid i paraformaldehid stvaraju metilenske mostove između amino grupa, što rezultira umrežavanjem proteina. Ovaj proces efikasno imobilizira ćelijske komponente i čuva njihov integritet tokom narednih koraka analize. Na efekte ovih fiksativa mogu uticati faktori kao što su koncentracija, pH i temperatura, a optimizacija ovih parametara ključna je za osiguranje optimalnog očuvanja ćelijskih struktura.
Prednosti ultrazvučne FFPE pripreme
Ultrazvučna obrada je moćna tehnika za razgradnju fiksiranih ćelija i tkiva koja nadmašuje konvencionalne tehnike. Nudi nekoliko značajnih prednosti u odnosu na tradicionalne metode lize:
- Brzina i efikasnost: Ultrazvučna liza omogućava brzu razgradnju ćelija i tkiva, značajno skraćujući vrijeme obrade u poređenju s mehaničkim ili kemijskim metodama lize. Zvučni valovi visoke frekvencije koje stvara ultrazvučna sonotroda stvaraju mehaničke smične sile, uzrokujući razgradnju fiksiranih ćelijskih struktura. Ova brza i efikasna razgradnja omogućava istraživačima da obrade velike volumene uzoraka u kratkom vremenskom roku.
- Blaga i podesiva: Ultrazvučna liza nudi blag mehanizam razgradnje koji svodi oštećenja osjetljivih biomolekula, kao što su proteini, nukleinske kiseline i enzimi, na najmanju mjeru. Za razliku od mehaničkih metoda koje stvaraju prekomjernu toplinu ili smične sile, ultrazvučna liza koristi kontroliranu kavitaciju za razgradnju ćelija uz očuvanje integriteta i funkcionalnosti intracelularnih komponenti.
- Svestranost: Ultrazvučna liza može se primijeniti na različite fiksative, što istraživačima omogućava rad sa širokim spektrom fiksiranih uzoraka. Bez obzira na to koriste li formaldehid, paraformaldehid ili alternativne fiksative, ultrazvučna liza dosljedno osigurava efikasnu razgradnju, čime se osigurava optimalno dobijanje ćelijskih komponenti.
- Visok prinos i kvalitet: Ultrazvučna liza omogućava visoke prinose netaknutih ćelijskih komponenti zahvaljujući sposobnosti ravnomjerne razgradnje fiksiranih ćelija i tkiva. To omogućava da nizvodne primjene, kao što su analiza proteina, ekstrakcija nukleinskih kiselina i enzimski testovi, daju pouzdane i ponovljive rezultate.
- Kompatibilnost s automatizacijom: Ultrazvučna liza može se lako integrirati u automatizirane sisteme, što omogućava visokoprotočnu obradu uzoraka. Ova kompatibilnost omogućava istraživačima da pojednostave svoj tok rada i povećaju produktivnost, posebno u studijama velikih razmjera.
Sonikator za ploče s 96 jažica UIP400MTP za sonikaciju mikrotitarskih ploča i ploča s više jažica
Ultrazvučna liza revolucionirala je razgradnju fiksiranih ćelija i tkiva, nudeći brojne prednosti u odnosu na tradicionalne metode lize. Njena brzina, efikasnost, selektivnost, svestranost, visok prinos i kompatibilnost s automatizacijom čine je nezamjenjivim alatom u istraživanjima iz molekularne biologije i biotehnologije. Nudeći bezkontaktne sonikatore kao i sonikatore sa sondom, Hielscher Ultrasonics nudi najprikladniji ultrazvučni homogenizator za vašu primjenu u znanostima o životu. Bez obzira na to želite li istovremeno obrađivati pojedinačne uzorke, više uzoraka ili vrlo velike brojeve uzoraka, ponudit ćemo vam najbolji sonikator koji odgovara vašim istraživačkim i dijagnostičkim zahtjevima.
Saznajte više o Hielscher bezkontaktnim sonikatorima za pripremu više uzoraka i visokoprotočnu pripremu uzoraka!
- jednokratna investicija
- koristite vlastiti potrošni materijal
- nema ponavljajućih troškova za vlasničku dodatnu opremu i potrošni materijal
- visokoprotočnost
- precizna kontrola
- najsavremenija tehnologija
- pouzdanost i robusnost
- podesiva, precizna kontrola procesa
- industrijska klasa: može raditi neprekidno 24/7
- jednostavan i siguran za rukovanje
- nisko održavanje
Saznajte više o primjenama sonikatora u znanostima o životu!
Sonikator za ploče UIP400MTP za sve ploče s 96 jažica, mikrotitarske ploče i ploče s više jažica.
Dizajn, proizvodnja i savjetovanje – kvalitet proizveden u Njemačkoj
Hielscher ultrazvučni uređaji poznati su po svom najvišem kvalitetu i standardima dizajna. Robusnost i jednostavno rukovanje omogućavaju nesmetanu integraciju naših ultrazvučnih uređaja u industrijska postrojenja. Hielscher ultrazvučni uređaji lako se nose s teškim uvjetima i zahtjevnim okruženjima.
Hielscher Ultrasonics je ISO certificirana kompanija i posebnu pažnju posvećuje visokoučinkovitim ultrazvučnim uređajima koji odlikuju najsavremenija tehnologija i jednostavnost korištenja. Naravno, Hielscher ultrazvučni uređaji u skladu su s CE oznakom i ispunjavaju zahtjeve UL, CSA i RoHs.
Kontaktirajte nas! / Pitajte nas!
Ultrazvučni uređaj UIP400MTP: visokoprotočna priprema FFPE uzoraka u ploči s više jažica
Često postavljana pitanja
U nastavku odgovaramo na često postavljana pitanja relevantna za pripremu FFPE tkiva i ultrazvučnu obradu FFPE uzoraka.
Kako se priprema FFPE tkivo?
Koraci pripreme FFPE tkiva: Pažljivo rukovanje svježim tkivom i njegova obrada ključni su za dobijanje FFPE uzoraka visokog kvaliteta. Očuvanje ćelijske arhitekture, nukleinskih kiselina i proteina neophodno je za tačnu nizvodnu analizu. Svaki korak – od prikupljanja do uklapanja – zahtijeva preciznost kako bi se očuvao integritet uzorka za različite analize, uključujući histološki pregled, imunohistohemiju i molekularne studije. Kada se pravilno provede, ovaj postupak fiksacije i uklapanja osigurava da sačuvano tkivo tačno odražava stanje in vivo, što omogućava pouzdane dijagnostičke i istraživačke ishode.
Provest ćemo vas kroz 6 glavnih koraka procesa uklapanja FFPE uzoraka tkiva.
- Prikupljanje tkiva
Biopsije živih sisara i tkivne kulture jednako su održivi izvori za dobijanje svježeg tkiva za pripremu FFPE uzoraka.
Važno je koristiti aseptičnu tehniku: koristite sterilne instrumente i rukavice kako biste izbjegli kontaminaciju. Idealno je prikupljati tkiva u sterilnom okruženju, kao što je operaciona sala ili laminarna komora.
Budući da je uzorak veoma krhak, neophodno je pažljivo rukovanje: svedite kašnjenja u obradi na najmanju mjeru i odmah nakon ekscizije započnite narednu obradu tkiva. To je ključno za sprječavanje autolize i razgradnje. Držite tkivo na sobnoj temperaturi; izbjegavajte zamrzavanje jer ono može uzrokovati stvaranje kristala leda i oštećenje tkiva. - Fiksacija tkiva
Prvo se tkivo tretira otopinom fiksativa: koristite 10% neutralni puferirani formalin (NBF), što je ekvivalentno 4% formaldehidu u vodi, puferiranom na neutralni pH.
Potpuno potopite tkivo u formalin. Osigurajte omjer zapremine fiksativa i tkiva od najmanje 10:1. Vrijeme fiksacije obično iznosi od 6 do 24 sata, zavisno od vrste i veličine tkiva. Važno je da fiksativ može temeljito prodrijeti u tkivo. Međutim, prekomjerna fiksacija može dovesti do umrežavanja koje otežava demaskiranje antigena, dok nedovoljna fiksacija može rezultirati lošim očuvanjem tkiva. - Rezanje tkiva
Drugo, skratite i oblikujte tkivo na debljinu od oko 3-5 mm kako bi se omogućilo odgovarajuće prodiranje fiksativa. Osigurajte pravilnu orijentaciju tkiva radi zahvatanja relevantnih histoloških struktura. To olakšava proces ekstrakcije kada se tkivo kasnije koristi za analizu. - Obrada fiksiranog uzorka
Sada fiksirano tkivo mora biti dehidrirano: nakon fiksacije tkivo treba dehidrirati kako bi se osiguralo temeljito prodiranje parafinskog voska. Provedite tkivo kroz stupnjevanu seriju etanola (70%, 80%, 90% i 100%) radi uklanjanja vode.
Bistrenje ksilenom: parafinski vosak je netopiv u vodi, ali topiv u ksilenu. Stoga se voda u tkivu mora zamijeniti ksilenom. Međutim, ksilen je sam po sebi netopiv u vodi, ali topiv u alkoholu, što zahtijeva međukorak u kojem se voda najprije zamjenjuje alkoholom. Uronite tkivo u ksilen ili zamjenu za ksilen kako biste uklonili etanol i pripremili tkivo za infiltraciju parafinom.
Infiltracija parafinom: uklopite tkivo u rastopljeni parafinski vosak, osiguravajući potpunu infiltraciju. Ovaj korak obično uključuje nekoliko izmjena parafina kako bi se osiguralo temeljito impregniranje. - Uklapanje tkiva
U ovom koraku tkivo se oblikuje u tkivni blok: postavite tkivo u kalup u željenoj orijentaciji i prelijte ga rastopljenim parafinom. Ostavite parafin da se stvrdne hlađenjem na sobnoj temperaturi ili na hladnoj ploči. - Rezanje na presjeke i montiranje
Mikrotomija: za rezanje uklopljenog tkiva koristite mikrotom kako biste od parafinskog bloka izrezali tanke presjeke (obično 4-5 mikrometara). Zatim se uzorak montira tako što se presjeci postavljaju na stakalca za naknadno bojenje i mikroskopsku analizu.
Na kraju provjerite kvalitet histologije: pregledajte prve presjeke pod mikroskopom kako biste osigurali pravilnu fiksaciju i obradu. Prilagodite protokole prema potrebi, zavisno od vrste tkiva i uočenog kvaliteta.
FFPE tkiva mogu se koristiti za dobijanje RNK, DNK i proteina, kao i za otkrivanje znakova raka ili drugih bolesti. Mogu se čuvati godinama i bitan su dio načina na koji istraživači i ljekari koriste uzorke tkiva za dijagnostiku i istraživanje.
Koji su uobičajeni problemi i izazovi s FFPE tkivom?
Uzorci tkiva fiksiranog formalinom i uloženog u parafin (FFPE) naširoko se koriste u istraživanju i dijagnostici, ali predstavljaju nekoliko izazova i uobičajenih problema:
- Razgradnja biomolekula: Produljena fiksacija može dovesti do razgradnje DNK, RNK i proteina, što otežava ekstrakciju nukleinskih kiselina ili proteina visokog kvaliteta za nizvodne primjene. Ispravna fiksacija (izbjegavanje nedovoljne i prekomjerne fiksacije) neophodna je za očuvanje tkiva.
- Maskiranje antigena: Proces fiksacije može maskirati antigenska mjesta, čime se smanjuje efikasnost vezivanja antitijela u imunohistohemiji i drugim imunološkim testovima. To često zahtijeva demaskiranje antigena, postupak kojim se maskiranje epitopa poništava i vezivanje epitopa i antitijela ponovo uspostavlja. Međutim, puna antigenost ne mora uvijek biti ponovo uspostavljena.
- Promjenjiv kvalitet fiksacije: Razlike u vremenima i uvjetima fiksacije mogu dovesti do nedosljednog kvaliteta uzoraka, što utječe na ponovljivost i uporedivost rezultata. Koristite pouzdane protokole fiksacije i izbjegavajte nedovoljnu i prekomjernu fiksaciju.
- Oštećenje i fragmentacija DNK: Fiksacija FFPE uzoraka formalinom može uzrokovati različite vrste oštećenja DNK, uključujući deaminaciju citozina (mutacije C u T), oksidativna oštećenja (npr. 8-okso-guanin koji dovodi do mutacija G u T), kao i fizička oštećenja kao što su prekidi lanca, praznine i abazna mjesta koja ometaju aktivnost DNK polimeraze. Proces fiksacije formalinom može uzrokovati fragmentaciju DNK, što otežava genetske i genomske analize kao što su PCR i sekvenciranje.
- Kvalitet RNK: RNK ekstrahovana iz FFPE tkiva često je fragmentirana i kemijski modificirana, što otežava provođenje transkriptomskih analiza visokog kvaliteta.
- Modifikacije proteina: Formalin može izazvati kemijske modifikacije proteina, utječući na njihovu strukturu i funkciju, što može ometati proteomske analize.
- Artefakti obrade uzoraka: Tokom postupka uklapanja i rezanja na presjeke, mehaničko naprezanje i toplina mogu uvesti artefakte i uzrokovati dodatno oštećenje tkiva.
- Varijabilnost između serija: Varijacije u protokolima fiksacije i uklapanja između različitih serija mogu dovesti do značajne varijabilnosti rezultata, što otežava poređenje između studija.
- Problemi s pohranom: Dugotrajna pohrana FFPE blokova može s vremenom dovesti do dodatne razgradnje i gubitka integriteta nukleinskih kiselina, što utječe na upotrebljivost arhivskih uzoraka za retrospektivne studije.
Umrežavanje: Fiksacija formalinom uzrokuje umrežavanje proteina i nukleinskih kiselina, što može otežati molekularnu analizu i utjecati na tačnost imunohistohemije i drugih testova.
Upotreba optimiziranih protokola, pažljivo rukovanje uzorcima i primjena naprednih tehnika pomažu u poboljšanju kvaliteta i pouzdanosti podataka dobijenih iz FFPE tkiva.
Koja je razlika između FFPE i zamrznutog tkiva?
FFPE tkivo (fiksirano formalinom i uloženo u parafin) čuva se tako što se tkivo fiksira formalinom, a zatim uklopi u parafinski vosak, što omogućava dugotrajnu pohranu na sobnoj temperaturi uz očuvanje morfologije tkiva. Nasuprot tome, zamrznuto tkivo se brzo čuva zamrzavanjem, čime se bolje održava integritet nukleinskih kiselina i proteina, ali zahtijeva pohranu na veoma niskim temperaturama.
Koje se kemikalije koriste za FFPE uklapanje?
Kemikalije koje se koriste za FFPE uklapanje obično uključuju formalin za fiksaciju i parafinski vosak za uklapanje. Za FFPE uklapanje tkiva se obično fiksiraju ili 10% (v/v) neutralnim puferiranim formalinom (FA) ili svježe pripremljenom 4% (w/v) otopinom formaldehida (PFA) napravljenom od praha paraformaldehida. Formalin, koji je otopina formaldehida u vodi, pufer je doveden na neutralni pH kako bi se očuvala morfologija tkiva i spriječilo prekomjerno umrežavanje. Otopina na bazi paraformaldehida također pruža efikasnu fiksaciju umrežavanjem proteina, čime se stabilizira struktura tkiva za naknadno uklapanje u parafinski vosak. Ove kemikalije su neophodne za održavanje integriteta i morfologije tkiva tokom postupka fiksacije i uklapanja.
Kako se parafin uklanja iz FFPE uzoraka?
Za uklanjanje parafina iz FFPE uzoraka, presjeci tkiva se obično podvrgavaju nizu ispiranja ksilenom, nakon čega slijedi rehidracija kroz stupnjevanu seriju alkohola i naposljetku vodu. Budući da je ksilen veoma otrovan i predstavlja zdravstvene rizike kao što su problemi s disanjem, iritacija kože i potencijalni dugoročni efekti pri ponovljenoj izloženosti, ultrazvučno uklanjanje parafina pojavljuje se kao obećavajuća alternativa u mnogim laboratorijama. Ova metoda koristi intenzivne ultrazvučne valove za efikasno i sigurno uklanjanje parafina bez potrebe za otrovnim otapalima poput ksilena, čime se smanjuje rizik za laboratorijsko osoblje i stvara sigurnije radno okruženje.
Koliko dugo trebam fiksirati tkiva za dobar kvalitet FFPE uzoraka?
Opće preporuke za trajanje fiksacije obično predlažu fiksiranje uzoraka tkiva u formalinu 24 do 48 sati. Ovo trajanje je općenito dovoljno za očuvanje morfologije tkiva i ćelijskih struktura uz svođenje prekomjerne fiksacije na najmanju mjeru, koja može dovesti do prekomjernog umrežavanja i razgradnje nukleinskih kiselina i proteina. Međutim, optimalno vrijeme fiksacije može varirati zavisno od veličine i vrste tkiva, pri čemu manji ili osjetljiviji uzorci zahtijevaju kraća vremena fiksacije. Ključno je uravnotežiti odgovarajuću fiksaciju radi sprječavanja autolize i razgradnje tkiva uz izbjegavanje produljene fiksacije koja bi mogla otežati nizvodne molekularne analize.