Phương pháp phân tách tế bào bằng sóng siêu âm đối với các mẫu vi khuẩn

Các mẫu vi khuẩn hiếm khi tồn tại dưới dạng huyền phù tế bào đơn thực sự. Các chủng vi khuẩn phát triển thành chuỗi và cụm, các chủng phân lập từ môi trường hình thành các cụm kết tụ được liên kết bởi các chất polymer ngoại bào, và các cặn lắng sau khi ly tâm thường khó tái huyền phù dù đã được khuấy đều bằng máy vortex. Việc đếm số lượng vi khuẩn còn sống, đo độ đục quang học, phân tích tế bào dòng chảy và lập bản đồ hệ vi sinh vật đều giả định rằng một hạt tương đương với một tế bào. Phương pháp phân tách tế bào bằng sóng siêu âm giải quyết mâu thuẫn này: các đợt siêu âm ngắn và được kiểm soát sẽ tách các cụm tế bào thành các tế bào đơn lẻ mà không làm vỡ chúng.

Tại sao hiện tượng kết tụ tế bào lại làm sai lệch kết quả của bạn

Sự kết tụ là một đặc điểm sinh học, không phải là lỗi trong quá trình chuẩn bị mẫu. Các vi khuẩn thuộc chi Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces và nhiều loài vi sinh vật trong môi trường phát triển dưới dạng chuỗi, cụm hoặc mảnh màng sinh học; trong khi đó, DNA ngoại bào và polysaccharide làm dính các tế bào lại với nhau trong các cục lắng và dịch chiết từ tăm bông. Hậu quả về mặt phân tích là mang tính hệ thống:

• Số lượng khuẩn lạc thường bị đánh giá thấp, bởi vì một cụm sẽ tạo thành một khuẩn lạc bất kể nó chứa bao nhiêu tế bào.
• Độ đục quang học và máy đếm hạt báo cáo số lượng các cụm hạt thay vì số lượng tế bào, dẫn đến sai lệch trên các đường cong tăng trưởng.
• Phương pháp phân tích tế bào bằng lưu lượng kế và phân loại tế bào thường tính sai số lượng các sự kiện bị kết tụ và loại trừ chúng khỏi phân tích.
• Việc chiết xuất DNA và protein chỉ phản ánh các tế bào trên bề mặt khối kết tụ, dẫn đến sự sai lệch trong dữ liệu về hệ vi sinh vật và các dữ liệu omics.

Các phương pháp xử lý truyền thống thường chậm, không triệt để hoặc gây biến đổi hóa học. Việc hút-thổi mạnh và khuấy vortex vẫn để lại các cụm vi hạt. Phương pháp phân tán dựa trên enzym hoặc chất chelat có thể làm thay đổi bề mặt tế bào mà bạn dự định phân tích. Quá trình phân tán cơ học bằng hiện tượng cavitation có kiểm soát diễn ra chỉ trong vài giây và không cần sử dụng bất kỳ chất phụ gia nào.

Cách siêu âm làm tách rời các tế bào mà không làm vỡ chúng

Quá trình phân tán tế bào bằng sóng siêu âm tận dụng sự khác biệt về độ bền cơ học. Các cụm vi khuẩn được liên kết với nhau nhờ các liên kết giữa các tế bào tương đối yếu và một ma trận ngoại bào, trong khi vỏ tế bào nguyên vẹn có khả năng chịu được lực cắt cao hơn đáng kể. Khi sóng siêu âm được hiệu chỉnh đi vào huyền phù, hiện tượng xâm thực âm thanh tạo ra các dòng chảy vi mô, các xung áp suất và lực cắt tác động đầu tiên lên các bề mặt tiếp giáp của các cụm vi khuẩn. Các cụm, chuỗi và mảnh màng sinh học bị tách rời (phân tán) trước khi đạt đến mức năng lượng khiến màng tế bào vỡ ra (lysis).

Phương pháp phân tán các cụm tế bào vi khuẩn bằng sóng siêu âm

Phân tách hoặc phân giải – Tầm quan trọng của các thông số siêu âm

Hậu quả thực tế là quá trình phân tách và phá vỡ tế bào được thực hiện bằng cùng một thiết bị nhưng với các thông số khác nhau. Ở biên độ vừa phải, chu kỳ xung ngắn và nhiệt độ được kiểm soát, bạn sẽ thu được một hỗn hợp tế bào đơn lẻ còn sống. Khi tăng biên độ, thời gian tiếp xúc hoặc nhiệt độ mẫu, quá trình sẽ chuyển sang hướng phá vỡ hoàn toàn tế bào để tác động lên các mục tiêu nội bào. Các máy tạo sóng Hielscher cho phép bạn thiết lập chính xác biên độ, công suất, xung và lượng năng lượng đầu vào, đồng thời lưu lại phương pháp, nhờ đó bước tách tế bào có thể được lặp lại một cách nhất quán giữa các mẫu, người vận hành và các lần chạy.

Quá trình siêu âm không tiếp xúc hiệu quả

Phương pháp siêu âm trong bể ngâm không thể sánh được với mức độ kiểm soát này. Các bể và thùng làm sạch bằng siêu âm chỉ cung cấp năng lượng siêu âm ở mức thấp, dẫn đến quá trình xử lý không triệt để; đồng thời hiện tượng cavitation xảy ra không đồng đều, do đó mỗi ống được xử lý tùy theo vị trí của nó trong bể. VialTweeter truyền các lực siêu âm mạnh mẽ và tập trung trực tiếp qua thành bình vào tối đa 10 mẫu đóng kín cùng một lúc. Các quy trình xử lý yêu cầu thời gian tiếp xúc dài và thay đổi trong bể được hoàn thành theo một mẫu xung tiêu chuẩn.
Các thiết bị siêu âm không tiếp xúc của Hielscher truyền sóng siêu âm cường độ cao, tập trung xuyên qua thành các lọ kín. Thiết bị VialTweeter có thể xử lý đồng thời tối đa 10 lọ với cường độ như nhau, không cần đặt đầu dò vào mẫu, không gây ô nhiễm chéo và không giải phóng aerosol. Khi nhu cầu về năng suất cao, các máy siêu âm microplate UIP400MTP và UIP550MTP mở rộng khả năng truyền năng lượng được kiểm soát này sang các tấm giếng đa giếng.

Ưu điểm của phương pháp phân tán siêu âm không tiếp xúc

• Hoàn toàn không có hiện tượng lây nhiễm chéo: Do các lọ mẫu luôn được đóng kín vĩnh viễn và không có đầu dò nào được nhúng vào mẫu, nên tình trạng nhiễm chéo và thất thoát mẫu được loại trừ hoàn toàn. Không cần phải tiệt trùng bất kỳ bộ phận nào giữa các lần lấy mẫu, và kết quả của một lần chạy không ảnh hưởng đến lần chạy tiếp theo.
• Bảo vệ khỏi các hạt aerosol: Quá trình siêu âm bằng đầu dò hở tạo ra các hạt khí dung có khả năng lây nhiễm và gây ô nhiễm bề mặt dụng cụ. Trong khi đó, quá trình siêu âm trong ống kín giúp giữ mẫu bên trong chính ống đó, điều này rất quan trọng khi xử lý các vi khuẩn gây bệnh như Mycobacterium tuberculosis và các tác nhân khác thuộc cấp độ an toàn sinh học BSL-2 hoặc BSL-3.
• Không bị hao hụt tiền boa: Trong quá trình hoạt động, các đầu dò titan có thể giải phóng một lượng nhỏ các hạt siêu nhỏ vào mẫu. Những hạt này làm thay đổi độ đục quang học và số lượng hạt ở các giai đoạn xử lý tiếp theo. Việc sử dụng sóng siêu âm gián tiếp qua thành bình sẽ loại bỏ hoàn toàn nguồn chất rắn này.
• Tốc độ truyền dữ liệu đồng đều: VialTweeter cung cấp cường độ siêu âm đồng đều cho từng lọ trong số tối đa 10 lọ, nhờ đó kết quả siêu âm trở nên đồng đều và có thể lặp lại. Các yếu tố ảnh hưởng do vị trí — vốn là vấn đề thường gặp khi sử dụng bể siêu âm hoặc phương pháp thăm dò từng mẫu riêng lẻ — sẽ không còn nữa, và các giá trị đường cơ sở của bạn sẽ luôn tương đồng giữa các lần lặp lại.
• Tính toàn vẹn của mẫu: Các ống được giữ kín trong suốt quá trình xử lý, do đó mẫu không thể bị nhiễm bẩn, hư hỏng hoặc bay hơi. Có thể xử lý các thể tích nhỏ mà không cần pha loãng, bao gồm cả các mẫu cặn lâm sàng quý hiếm không thể thực hiện thêm bước chuyển mẫu.
• Kiểm soát quy trình: Biên độ có thể điều chỉnh trong khoảng từ 20 đến 100%, chế độ xung từ 0 đến 100%, và hệ thống hỗ trợ giám sát nhiệt độ để các chủng vi sinh vật và protein nhạy cảm với nhiệt luôn được duy trì ở mức dưới ngưỡng gây hại.

Các ứng dụng điển hình

• Phân tích hệ vi sinh vật và nội dung đường ruột: làm tản ra các vi khuẩn Lactobacillus, Bifidobacterium và mẫu phân trước khi cấy lên đĩa hoặc giải trình tự, để số lượng vi khuẩn không bị giảm do hiện tượng vón cục.
• Vi sinh học thực phẩm và nước: Tách các cụm vi sinh vật trong mẫu tăm bông, nước rửa và môi trường nuôi cấy tăng cường để xác định chính xác số lượng khuẩn lạc và khả năng sống sót.
• Nghiên cứu màng sinh học: thu hồi tế bào từ các chất mang và bề mặt dưới dạng huyền phù tế bào đơn lẻ, mà không cần xử lý bằng enzym có thể làm mất các protein trên bề mặt.
• Chẩn đoán lâm sàng: khuấy đều đờm, mủ và dịch chiết từ tăm bông trong điều kiện cách ly.
• Nuôi cấy tế bào: tách các cụm tế bào động vật có vú, côn trùng và CHO trước khi đếm và chuyển thế hệ.
• Chuẩn bị toàn bộ quy trình: cùng một thiết bị có thể thực hiện quá trình phân tách ở biên độ thấp và phá vỡ tế bào hoàn toàn ở các cài đặt cao hơn, do đó các bước ly giải, chiết xuất protein và phân mảnh DNA được tiến hành liền mạch mà không cần chuyển mẫu sang ống khác.

Văn học / Tài liệu tham khảo