Phân tách cụm tế bào trong mẫu vi khuẩn bằng siêu âm

Mẫu vi khuẩn hiếm khi ở dạng huyền phù tế bào đơn thực sự khi được tiếp nhận. Vi khuẩn nuôi cấy phát triển thành chuỗi và bông, các chủng phân lập từ môi trường tạo thành các cụm được liên kết bởi các chất polyme ngoại bào, còn cặn tế bào sau ly tâm thường khó tái huyền phù dù đã trộn xoáy kỹ. Việc đếm tế bào sống, đo mật độ quang, đo tế bào dòng chảy và phân tích hệ vi sinh vật đều giả định rằng một hạt tương ứng với một tế bào. Phân tách cụm tế bào bằng siêu âm giải quyết mâu thuẫn đó: các đợt xử lý siêu âm ngắn, có kiểm soát tách các cụm thành tế bào đơn mà không làm ly giải chúng.

Vì sao sự kết cụm tế bào làm sai lệch kết quả của bạn

Sự kết cụm là một đặc điểm sinh học, không phải lỗi chuẩn bị mẫu. Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces và nhiều loài trong môi trường phát triển thành chuỗi, cụm hoặc mảnh màng sinh học, còn DNA ngoại bào và polysaccharide gắn các tế bào với nhau trong cặn tế bào và dịch rửa giải từ que lấy mẫu. Các hệ quả đối với phân tích mang tính hệ thống:

• Số lượng khuẩn lạc bị đánh giá thấp, vì một cụm tạo ra một khuẩn lạc bất kể cụm đó chứa bao nhiêu tế bào.
• Phép đo mật độ quang và thiết bị đếm hạt ghi nhận các cụm thay vì tế bào, làm sai lệch đường cong sinh trưởng.
• Phép đo tế bào dòng chảy và phân loại tế bào đếm sai các sự kiện tương ứng với cụm tế bào và loại chúng khỏi phân tích.
• DNA và protein được chiết xuất chỉ đại diện cho các tế bào trên bề mặt cụm, làm sai lệch dữ liệu hệ vi sinh vật và dữ liệu omics.

Các biện pháp khắc phục thông thường chậm, không triệt để hoặc gây biến đổi hóa học. Hút nhả bằng pipet và trộn xoáy mạnh vẫn để lại các vi cụm. Phân tán bằng enzyme hoặc chất tạo phức chelat làm biến đổi bề mặt tế bào mà bạn có thể đang muốn phân tích. Phân tách cụm bằng cơ học nhờ hiện tượng xâm thực có kiểm soát tác động trong vòng vài giây và không cần chất phụ gia.

Cách siêu âm phân tách cụm tế bào mà không làm ly giải chúng

Phân tách cụm tế bào bằng siêu âm khai thác sự khác biệt về độ bền cơ học. Các cụm vi khuẩn được giữ với nhau bởi các liên kết tương đối yếu giữa các tế bào và một chất nền ngoại bào, trong khi lớp bao tế bào nguyên vẹn chịu được lực cắt cao hơn đáng kể. Khi siêu âm đã được hiệu chuẩn truyền vào huyền phù, hiện tượng xâm thực âm tạo ra các dòng chảy vi mô, xung áp suất và lực cắt tác động trước tiên tại các bề mặt tiếp giáp của cụm. Các cụm, chuỗi và mảnh màng sinh học bị lực cắt tách rời (phân tách cụm) trước khi đạt đến mức năng lượng làm vỡ màng (ly giải).

Phân tách các cụm tế bào vi khuẩn bằng siêu âm

Phân tách cụm hay ly giải – Vai trò của các thông số siêu âm

Hệ quả thực tiễn là cùng một thiết bị thực hiện phân tách cụm và ly giải khi vận hành với các thông số khác nhau. Với biên độ vừa phải, chu kỳ xung ngắn và nhiệt độ được kiểm soát, bạn thu được huyền phù tế bào đơn còn sống. Tăng biên độ, thời gian tiếp xúc hoặc nhiệt độ mẫu sẽ chuyển quá trình theo hướng phá vỡ tế bào hoàn toàn để thu các thành phần đích nội bào. Bộ phát siêu âm Hielscher cho phép bạn thiết lập chính xác biên độ, công suất, xung và năng lượng đầu vào, đồng thời lưu phương pháp, nhờ đó bước phân tách cụm có thể tái lập giữa các mẫu, người vận hành và lần chạy.

Xử lý siêu âm không tiếp xúc hiệu quả

Xử lý siêu âm bằng bể không thể đạt được mức kiểm soát này. Các bể và bồn làm sạch bằng siêu âm chỉ cung cấp năng lượng siêu âm thấp, dẫn đến chuẩn bị mẫu không hoàn toàn, và hiện tượng xâm thực xảy ra không đồng đều, nên mỗi ống được xử lý tùy theo vị trí của nó trong bể. VialTweeter truyền trực tiếp các lực siêu âm mạnh, tập trung xuyên qua thành vật chứa vào tối đa 10 mẫu được đậy kín cùng một lúc. Các quy trình xử lý đòi hỏi thời gian tiếp xúc dài và biến thiên trong bể được hoàn thành theo một chuỗi xung chuẩn hóa.
Các thiết bị siêu âm không tiếp xúc của Hielscher truyền siêu âm mạnh, tập trung xuyên qua thành các lọ kín. VialTweeter xử lý đồng thời tối đa 10 lọ ở cùng cường độ, không có đầu dò trong mẫu, không nhiễm chéo và không phát tán khí dung. Khi yêu cầu về năng suất xử lý mẫu đòi hỏi, các thiết bị siêu âm đĩa vi thể UIP400MTP và UIP550MTP mở rộng khả năng truyền năng lượng có kiểm soát này sang các đĩa nhiều giếng.

Ưu điểm của việc phân rã khối kết tụ tế bào bằng siêu âm không tiếp xúc

• Hoàn toàn không nhiễm chéo: Vì các lọ luôn được giữ kín và không có đầu dò nhúng trong mẫu, nhiễm chéo và thất thoát mẫu được tránh hoàn toàn. Không có bộ phận nào cần tiệt trùng giữa các mẫu, và một lần xử lý không thể ảnh hưởng đến lần tiếp theo.
• Bảo vệ khỏi khí dung: Xử lý siêu âm bằng đầu dò trong hệ hở tạo ra khí dung có khả năng lây nhiễm và làm nhiễm bẩn bề mặt thiết bị. Xử lý siêu âm trong lọ kín giữ mẫu bên trong chính ống chứa mẫu, điều này có ý nghĩa khi thao tác với các vi khuẩn gây bệnh như Mycobacterium tuberculosis và các tác nhân BSL-2 hoặc BSL-3 khác.
• Không mài mòn đầu dò: Các đầu dò titan có thể giải phóng một lượng nhỏ vi hạt vào mẫu trong quá trình vận hành. Những hạt này làm thay đổi mật độ quang và số lượng hạt ở các bước sau. Xử lý siêu âm gián tiếp xuyên qua thành vật chứa loại bỏ hoàn toàn nguồn chất rắn này.
• Năng suất xử lý đồng đều: VialTweeter cung cấp cùng một cường độ siêu âm cho từng lọ trong số tối đa 10 lọ, nhờ đó kết quả xử lý siêu âm đồng đều và có khả năng tái lập. Các ảnh hưởng do vị trí vốn gây khó khăn khi dùng bể và đầu dò xử lý từng mẫu riêng lẻ được loại bỏ, và các giá trị nền vẫn có thể so sánh giữa các mẫu lặp.
• Tính toàn vẹn của mẫu: Các ống luôn được giữ kín trong suốt quá trình xử lý, nên mẫu không thể bị nhiễm bẩn, hư hỏng hoặc bay hơi. Có thể xử lý các thể tích nhỏ mà không cần pha loãng, kể cả các phần cặn ly tâm lâm sàng quý giá không thể trải qua thêm một bước chuyển mẫu.
• Kiểm soát quy trình: Biên độ có thể điều chỉnh từ 20 đến 100%, chế độ xung từ 0 đến 100%, và các hệ thống hỗ trợ theo dõi nhiệt độ để các chủng và protein nhạy nhiệt luôn được giữ dưới các ngưỡng gây tổn hại.

Các ứng dụng điển hình

• Phân tích hệ vi sinh vật và chất chứa trong ruột: phân tán Lactobacillus, Bifidobacterium và các mẫu phân trước khi cấy đĩa hoặc giải trình tự, để số đếm không bị giảm do các khối kết tụ.
• Vi sinh học thực phẩm và nước: phân rã các bông kết tụ trong mẫu phết, dịch rửa và môi trường canh thang tăng sinh để xác định chính xác số khuẩn lạc và khả năng sống.
• Nghiên cứu màng sinh học: thu hồi tế bào từ các giá thể và bề mặt dưới dạng huyền phù đơn tế bào, không cần xử lý bằng enzyme vốn sẽ loại bỏ các protein bề mặt.
• Chẩn đoán lâm sàng: tái huyền phù đờm, mủ và dịch rửa giải từ que phết trong điều kiện ngăn chặn phát tán.
• Nuôi cấy tế bào: tách các khối kết tụ tế bào động vật có vú, côn trùng và CHO trước khi đếm và cấy chuyền.
• Chuẩn bị mẫu cho toàn bộ quy trình: cùng một thiết bị phân rã khối kết tụ ở biên độ thấp có thể phá vỡ hoàn toàn tế bào ở các mức cài đặt cao hơn, nên các bước ly giải, chiết xuất protein và phân mảnh DNA được thực hiện tiếp theo mà không cần chuyển mẫu sang ống khác.

Tài liệu / Tài liệu tham khảo

• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
• Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.