Quy trình phân tích proteomics: Sử dụng sóng siêu âm không tiếp xúc giúp cải thiện quá trình chuẩn bị mẫu peptit cho phân tích MS

Proteomics từ dưới lên đã trở thành nền tảng của việc phát hiện dấu ấn sinh học hiện đại, sinh học cấu trúc và chẩn đoán lâm sàng. Bằng cách phân giải protein thành các peptit trước khi tiến hành phân tích bằng phổ khối (MS), các nhà nghiên cứu có thể đạt được độ bao phủ trình tự sâu hơn và định lượng đáng tin cậy hơn. Tuy nhiên, việc chuẩn bị các mẫu sinh học có độ phức tạp cao cho phân tích MS vẫn là một thách thức kỹ thuật lớn. Những tiến bộ phương pháp gần đây đã làm nổi bật cách thức xử lý bằng sóng siêu âm có kiểm soát – cụ thể là với máy siêu âm VialTweeter Multi-Tube không tiếp xúc và máy siêu âm UIP400MTP dành cho microplate – có thể giúp tối ưu hóa đáng kể quy trình làm việc này, nâng cao tính tái hiện và ngăn ngừa các điểm nghẽn thường gặp trên thiết bị.
Tìm hiểu quy trình chuẩn bị mẫu chi tiết để thu được các peptit có kích thước phù hợp cho phân tích bằng phổ khối (MS).

Ai nên sử dụng phương pháp siêu âm không tiếp xúc để chuẩn bị mẫu peptit?

• Proteomics từ dưới lên & Discovery Labs: Các nhà nghiên cứu đang chuẩn bị các mẫu có độ phức tạp cao cho quy trình LC-MS hoặc MALDI và cần đảm bảo hiệu suất thu hồi peptit ổn định và cao trên nhiều loại ma trận sinh học khác nhau.
• S-Trap™ & Tình trạng bị khóa tài khoản: Các nhóm nghiên cứu sử dụng phương pháp làm sạch bằng cột vi mô và cần kiểm soát quá trình cắt DNA để ngăn ngừa tắc cột, đồng thời đảm bảo quá trình nạp mẫu và phân giải diễn ra suôn sẻ.
• lâm sàng & Các nhóm nghiên cứu ứng dụng: Các phòng thí nghiệm xử lý mô, tế bào, huyết tương, huyết thanh hoặc dịch não tủy, nơi tính lặp lại giữa các mẻ và tính toàn vẹn của mẫu là yếu tố then chốt.
• Định lượng & Các nhóm MS Teams được chỉ định: Các phòng thí nghiệm tiến hành các nghiên cứu so sánh nghiêm ngặt, trong đó việc sử dụng máy siêu âm có đầu dò tái sử dụng có thể gây ra nguy cơ ô nhiễm chéo, từ đó ảnh hưởng đến việc định lượng các peptit có nồng độ thấp.
• Các cơ sở hạ tầng cốt lõi & Các hoạt động có năng suất cao: Các nhóm nghiên cứu xử lý đồng thời nhiều mẫu sinh học lặp lại sẽ được hưởng lợi từ phương pháp siêu âm theo khối nhiều ống kín bằng thiết bị VialTweeter, giúp loại bỏ việc vệ sinh đầu dò, giảm thời gian thao tác trực tiếp và duy trì điều kiện vô trùng.
• Buổi họp phụ huynh - giáo viên & Các nhà nghiên cứu về protein cấu trúc: Các nhà nghiên cứu cần quy trình xử lý nhẹ nhàng, được kiểm soát nhiệt độ để bảo toàn các biến đổi dễ bị phân hủy và tối đa hóa độ bao phủ trình tự trong quá trình ly giải và đồng nhất hóa tế bào.

Tổng quan về quy trình: Từ mô và tế bào đến các peptit sẵn sàng cho phân tích bằng phổ khối (MS)

Quy trình phân tích proteomics từ dưới lên (bottom-up) được áp dụng rộng rãi do Wojtkiewicz và cộng sự đề xuất cung cấp một phương pháp vững chắc và có khả năng mở rộng để chuẩn bị mẫu peptit từ các ma trận sinh học đa dạng. Bắt đầu từ 50–100 mg mô đông lạnh nhanh hoặc 1–20 triệu tế bào, quy trình này tích hợp công nghệ giữ mẫu dạng huyền phù (S-Trap™) để loại bỏ hiệu quả các chất tẩy rửa, muối và tạp chất trước khi tiến hành phân giải enzym.
Sau khi phân giải tế bào, định lượng protein, khử và alkyl hóa, mẫu được axit hóa và nạp vào cột ly tâm S-Trap™, nơi diễn ra quá trình tiêu hóa bằng trypsin/lysC. Các peptit thu được được rửa ra, sấy khô và đưa vào phân tích LC-MS. Khi áp dụng cho 50 mg mô tim người, quy trình này luôn cho ra đủ lượng peptit cho 30–40 lần tiêm, xác định được hơn 4.000 protein riêng biệt trong mỗi lần chạy. Mặc dù các phản ứng hóa học và quá trình làm sạch dựa trên cột đã được xác định rõ ràng, thành công của quy trình này phụ thuộc rất nhiều vào các bước phá vỡ vật lý ban đầu và quản lý DNA.
Quy trình này khuyến nghị sử dụng thiết bị siêu âm VialTweeter Multi-Tube để thực hiện quá trình siêu âm nhằm phá vỡ tế bào và cắt nhỏ DNA – Cả hai bước này đều rất quan trọng đối với việc phân tích peptit.

Phương pháp phá vỡ tế bào và mô bằng sóng siêu âm để chiết xuất protein

Trong quy trình phân tích proteomics từ dưới lên, xử lý bằng sóng siêu âm là bước quan trọng trong quá trình phá vỡ tế bào để chiết xuất protein phục vụ cho phân tích phổ khối sau đó. Sau khi thêm dung dịch đệm phá vỡ tế bào SDS vào cặn tế bào, các mẫu được xử lý bằng sóng siêu âm thông qua thiết bị VialTweeter Multi-Tube Sonicator. Quy trình này sử dụng ống microfuge 1,5 mL và quy định vận hành máy siêu âm ở công suất 30%, với chu kỳ 10 giây bật và 10 giây tắt, lặp lại 3 lần. Sau khi chờ 1 phút, chu trình này được lặp lại thêm hai lần nữa. Các mẫu được làm lạnh liên tục bằng đá.
Quá trình này không chỉ góp phần phá vỡ tế bào mà còn đặc biệt cần thiết để cắt nhỏ DNA gen được giải phóng trong quá trình ly giải. Việc cắt nhỏ DNA hiệu quả là yếu tố then chốt để giảm độ nhớt của mẫu và ngăn ngừa tắc nghẽn cột S-Trap™, từ đó đảm bảo thu hồi protein tối ưu và quá trình tiêu hóa peptit ở các bước tiếp theo diễn ra đáng tin cậy.

Vai trò quan trọng của quá trình cắt DNA bằng sóng siêu âm

Một trong những sự cố thường gặp nhất trong quy trình làm việc dựa trên S-Trap™ là hiện tượng tắc cột, nguyên nhân gần như hoàn toàn là do DNA gen có trọng lượng phân tử cao được giải phóng trong quá trình đồng nhất hóa tế bào hoặc mô. DNA còn nguyên vẹn làm tăng đáng kể độ nhớt của mẫu, giữ lại các peptit và làm tắc nghẽn lớp chất hấp phụ S-Trap™ có lỗ xốp siêu nhỏ.
Quá trình xử lý bằng sóng siêu âm giải quyết vấn đề này bằng cách phân mảnh DNA thành các đoạn nhỏ, hòa tan trong nước. Bằng cách áp dụng năng lượng âm thanh được kiểm soát, thiết bị VialTweeter cắt nhỏ axit nucleic một cách hiệu quả mà không sinh ra nhiệt quá mức hay đưa các tạp chất ngoại lai vào mẫu. Việc giảm độ nhớt này đảm bảo quá trình nạp mẫu diễn ra trơn tru, tốc độ dòng chảy ổn định và quá trình phân giải diễn ra liên tục.

Các thông số siêu âm VialTweeter đã được tối ưu hóa

Quy trình này quy định một phác đồ siêu âm có độ tái hiện cao, được tối ưu hóa để đảm bảo tính toàn vẹn của mẫu sinh học và khả năng tương thích với các bước phân tích MS tiếp theo. Đối với mẫu được đựng trong ống ly tâm vi lượng 1,5 mL khi sử dụng máy siêu âm khối không tiếp xúc Hielscher VialTweeter, các thông số sau đây giúp đạt được hiệu quả phân giải tế bào và cắt DNA tối ưu đồng thời bảo toàn cấu trúc protein:

• Biên độ: 30% công suất
• Chế độ hoạt động theo chu kỳ: 10 giây BẬT / 10 giây TẮT
• Thời gian thực hiện: 3 chu kỳ (10 giây BẬT/10 giây TẮT) → nghỉ 1 phút trên đá → lặp lại thêm 2 lần nữa
• Kiểm soát nhiệt độ: Các mẫu được đặt trên đá trong quá trình xử lý để ngăn ngừa sự biến tính do nhiệt và hoạt động enzym sớm

Phương pháp siêu âm xung này giúp ngăn ngừa hiện tượng quá nhiệt cục bộ, giảm thiểu quá trình oxy hóa peptit và đảm bảo mức độ tiếp xúc với sóng âm đồng đều trên tất cả các lọ. Hệ thống ống kín cũng giúp loại bỏ việc phải vệ sinh đầu dò giữa các mẫu, từ đó giảm đáng kể thời gian thao tác và sự biến động do người vận hành gây ra.

Những ưu điểm chính của các quy trình làm việc trong lĩnh vực proteomics hiện đại

Việc tích hợp VialTweeter vào quy trình phân tích proteomics theo phương pháp từ dưới lên của bạn mang lại một số lợi ích về mặt vận hành và khoa học:

1. Sự phân mảnh DNA liên tục: Việc phân phối năng lượng âm thanh đồng đều trên tất cả các lọ đảm bảo khả năng giảm độ nhớt có thể lặp lại và ngăn ngừa sự biến động giữa các lô trong quá trình nạp S-Trap™.
2. Bảo tồn các biến đổi không bền vững: Quá trình xử lý ở nhiệt độ thấp trong bể nước đá giúp bảo vệ các biến đổi sau dịch mã (PTM) và ngăn chặn sự kết tụ protein do nhiệt gây ra trong quá trình phá vỡ tế bào.
3. Tối ưu hóa quy trình xử lý sau thu hoạch: Các dịch chiết đã qua xử lý bằng VialTweeter có thể được làm trong trực tiếp bằng cách ly tâm và định lượng mà không cần các bước làm sạch bổ sung, giúp đẩy nhanh quá trình tiến tới giai đoạn phân giải bằng S-Trap™.
4. Khả năng mở rộng & Linh hoạt: Các thông số siêu âm này áp dụng cho cả mẫu mô có độ phức tạp cao lẫn huyền phù tế bào, hỗ trợ các quy trình phân tích proteomics khám phá, định lượng có mục tiêu và glycoproteomics. Các thiết bị siêu âm microplate của Hielscher cho phép dễ dàng mở rộng quy mô để xử lý số lượng mẫu lớn trong các tấm microplate nhiều giếng.

Văn học / Tài liệu tham khảo