Quy trình proteomics: Siêu âm không tiếp xúc cải thiện việc chuẩn bị mẫu peptide cho MS

Proteomics theo hướng từ dưới lên đã trở thành nền tảng của hoạt động khám phá dấu ấn sinh học, sinh học cấu trúc và chẩn đoán lâm sàng hiện đại. Bằng cách phân giải protein thành peptide trước khi phân tích bằng khối phổ (MS), các nhà nghiên cứu có thể đạt độ bao phủ trình tự cao hơn và định lượng đáng tin cậy hơn. Tuy nhiên, việc chuẩn bị các mẫu sinh học có độ phức tạp cao cho MS vẫn đòi hỏi kỹ thuật cao. Những tiến bộ gần đây về phương pháp cho thấy xử lý siêu âm có kiểm soát – cụ thể là bằng máy siêu âm nhiều ống không tiếp xúc VialTweeter và máy siêu âm đĩa vi giếng UIP400MTP – có thể đơn giản hóa đáng kể quy trình này, cải thiện khả năng tái lập và ngăn ngừa các điểm nghẽn thường gặp ở thiết bị.
Tìm hiểu quy trình chuẩn bị mẫu chi tiết để thu được peptide có kích thước phù hợp cho phân tích bằng MS.

Ai nên sử dụng siêu âm không tiếp xúc để chuẩn bị mẫu peptide?

• Các phòng thí nghiệm proteomics theo hướng từ dưới lên và nghiên cứu khám phá: Các nhà nghiên cứu chuẩn bị mẫu có độ phức tạp cao cho quy trình LC-MS hoặc MALDI, cần thu hồi peptide ổn định với hiệu suất cao từ nhiều nền mẫu sinh học khác nhau.
• Người sử dụng S-Trap™ và công nghệ bẫy huyền phù: Các nhóm sử dụng phương pháp làm sạch bằng vi cột, cần cắt DNA có kiểm soát để ngăn tắc cột và bảo đảm việc nạp mẫu và phân giải diễn ra suôn sẻ.
• Các nhóm nghiên cứu lâm sàng và nghiên cứu chuyển giao: Các phòng thí nghiệm xử lý mô, tế bào, huyết tương, huyết thanh hoặc dịch não tủy, nơi khả năng tái lập giữa các lô và tính toàn vẹn của mẫu có vai trò thiết yếu.
• Các nhóm phân tích MS định lượng và có mục tiêu: Các phòng thí nghiệm thực hiện nghiên cứu so sánh nghiêm ngặt, trong đó máy siêu âm đầu dò gây ra nguy cơ nhiễm chéo có thể ảnh hưởng đến việc định lượng peptide có hàm lượng thấp.
• Các cơ sở nghiên cứu dùng chung và đơn vị xử lý mẫu với thông lượng cao: Các nhóm xử lý đồng thời nhiều mẫu lặp sinh học, được hưởng lợi từ việc siêu âm bằng khối nhiều ống kín với VialTweeter, giúp loại bỏ việc vệ sinh đầu dò, giảm thời gian thao tác trực tiếp và duy trì điều kiện vô trùng.
• Các nhà nghiên cứu PTM và cấu trúc protein: Các nhà nghiên cứu cần xử lý nhẹ nhàng, có kiểm soát nhiệt độ để bảo toàn các biến đổi kém bền và tối đa hóa độ bao phủ trình tự trong quá trình ly giải và đồng nhất hóa tế bào.

Tổng quan quy trình: Từ mô và tế bào đến peptide sẵn sàng cho MS

Quy trình proteomics theo hướng từ dưới lên được Wojtkiewicz và cộng sự trình bày và được áp dụng rộng rãi cung cấp một phương pháp vững chắc, có khả năng mở rộng để chuẩn bị mẫu peptide từ nhiều nền mẫu sinh học khác nhau. Bắt đầu với 50–100 mg mô được đông lạnh nhanh hoặc 1–20 triệu tế bào, quy trình tích hợp công nghệ bẫy huyền phù (S-Trap™) để loại bỏ hiệu quả chất tẩy rửa, muối và tạp chất trước khi phân giải bằng enzyme.
Sau khi ly giải, định lượng protein, khử và alkyl hóa, mẫu được axit hóa và nạp lên cột ly tâm S-Trap™, nơi diễn ra quá trình phân giải bằng trypsin/lysC. Các peptide thu được được rửa giải, làm khô và đưa vào phân tích LC-MS. Khi áp dụng cho 50 mg mô tim người, quy trình này luôn thu được lượng peptide đủ cho 30–40 lần tiêm mẫu, xác định hơn 4.000 protein riêng biệt trong mỗi lần chạy. Mặc dù các bước xử lý hóa học và làm sạch bằng cột đã được xác định rõ, thành công của toàn bộ quy trình phụ thuộc rất lớn vào các bước phá vỡ vật lý và xử lý DNA ban đầu.
Quy trình khuyến nghị sử dụng máy siêu âm nhiều ống VialTweeter để ly giải tế bào và cắt DNA bằng siêu âm – cả hai bước đều có vai trò thiết yếu đối với phân tích peptide.

Ly giải tế bào và mô bằng siêu âm để chiết xuất protein

Trong quy trình phân tích hệ protein từ dưới lên, xử lý siêu âm là một bước quan trọng trong quá trình ly giải mẫu tế bào để chiết xuất protein cho phân tích khối phổ tiếp theo. Sau khi bổ sung dung dịch đệm ly giải tế bào SDS vào cặn tế bào, các mẫu được xử lý siêu âm bằng thiết bị siêu âm đa ống VialTweeter. Quy trình sử dụng các ống vi ly tâm 1,5 mL và quy định vận hành thiết bị siêu âm ở công suất 30% với 10 giây bật và 10 giây tắt, lặp lại trong 3 chu kỳ. Sau khi chờ 1 phút, chu kỳ được lặp lại thêm hai lần. Các mẫu được làm mát liên tục bằng nước đá.
Quá trình này không chỉ hỗ trợ phá vỡ tế bào mà còn đặc biệt cần thiết để cắt DNA hệ gen được giải phóng trong quá trình ly giải. Cắt DNA hiệu quả có vai trò thiết yếu trong việc giảm độ nhớt của mẫu và ngăn tắc nghẽn các cột S-Trap™, qua đó bảo đảm thu hồi protein tối ưu và phân cắt peptide đáng tin cậy ở các bước tiếp theo.

Vai trò then chốt của việc cắt DNA bằng siêu âm

Một trong những sự cố thường gặp nhất trong các quy trình dựa trên S-Trap™ là tắc nghẽn cột, mà nguyên nhân gần như hoàn toàn là do DNA hệ gen có khối lượng phân tử cao được giải phóng trong quá trình đồng nhất hóa tế bào hoặc mô. DNA nguyên vẹn làm tăng mạnh độ nhớt của mẫu, giữ lại peptide và làm tắc lớp vật liệu hấp phụ vi xốp của S-Trap™.
Xử lý siêu âm giải quyết vấn đề này bằng cách phân mảnh DNA theo cơ chế cơ học thành các đoạn nhỏ, hòa tan được. Bằng cách áp dụng năng lượng âm được kiểm soát, VialTweeter cắt axit nucleic hiệu quả mà không sinh nhiệt quá mức hoặc đưa các chất nhiễm bẩn từ bên ngoài vào mẫu. Việc giảm độ nhớt này bảo đảm nạp mẫu thuận lợi, lưu lượng qua cột ổn định và động học phân cắt không bị gián đoạn.

Các thông số xử lý siêu âm VialTweeter được tối ưu hóa

Quy trình quy định một chế độ xử lý siêu âm có độ tái lập cao, được tối ưu hóa để bảo toàn tính toàn vẹn của mẫu sinh học và bảo đảm khả năng tương thích với phân tích MS ở các bước tiếp theo. Đối với mẫu trong các ống vi ly tâm 1,5mL sử dụng thiết bị siêu âm dạng khối không tiếp xúc Hielscher VialTweeter, các thông số sau giúp ly giải và cắt DNA tối ưu đồng thời bảo toàn cấu trúc protein:

• Biên độ: công suất 30%
• Chế độ chu kỳ: BẬT 10 giây / TẮT 10 giây
• Thời gian: 3 chu kỳ (BẬT 10 giây/TẮT 10 giây) → nghỉ 1 phút trên nước đá → lặp lại thêm 2 lần
• Quản lý nhiệt độ: Các mẫu được đặt trên nước đá trong quá trình xử lý để ngăn biến tính do nhiệt và hoạt động của enzyme xảy ra sớm

Phương pháp xử lý siêu âm theo xung này ngăn quá nhiệt cục bộ, giảm thiểu quá trình oxy hóa peptide và bảo đảm tất cả các lọ đều được tiếp xúc đồng đều với năng lượng âm. Cấu hình ống kín cũng loại bỏ nhu cầu làm sạch đầu dò giữa các mẫu, giảm đáng kể thời gian thao tác trực tiếp và sự biến thiên do người vận hành.

Các ưu điểm chính đối với quy trình phân tích hệ protein hiện đại

Việc tích hợp VialTweeter vào quy trình phân tích hệ protein từ dưới lên mang lại nhiều lợi ích về vận hành và khoa học:

1. Phân mảnh DNA nhất quán: Việc truyền năng lượng âm đồng đều đến tất cả các lọ bảo đảm khả năng giảm độ nhớt có tính tái lập và ngăn sự biến thiên giữa các lô khi nạp mẫu vào S-Trap™.
2. Bảo toàn các biến đổi kém bền: Xử lý ở nhiệt độ thấp trong bể nước đá bảo vệ các biến đổi sau dịch mã (PTM) và ngăn protein kết tụ do nhiệt trong quá trình ly giải tế bào.
3. Tinh giản các bước xử lý tiếp theo: Dịch ly giải được xử lý bằng VialTweeter có thể được làm trong trực tiếp bằng ly tâm và định lượng mà không cần thêm các bước làm sạch, giúp tiến nhanh hơn đến bước phân cắt trên S-Trap™.
4. Khả năng mở rộng quy mô và tính linh hoạt: Các thiết lập siêu âm giống nhau áp dụng cho cả mẫu mô có độ phức tạp cao và huyền phù tế bào, hỗ trợ các quy trình nghiên cứu khám phá hệ protein, định lượng có mục tiêu và phân tích hệ glycoprotein. Các thiết bị siêu âm đĩa vi giếng Hielscher cho phép dễ dàng mở rộng quy mô để xử lý số lượng mẫu lớn trong các đĩa nhiều giếng.

Tài liệu / Tài liệu tham khảo

• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
• Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
• Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.