Hücre Lizisi için Sonikasyon: Hücre Bozulması ve Ekstraksiyonu
Ultrasonik hücre parçalama, modern biyoteknoloji laboratuvarlarında yaygın olarak uygulanan bir numune hazırlama tekniğidir. Birincil amacı proteinler, nükleik asitler veya organeller gibi hücre içi bileşenleri serbest bırakmak için hücresel membranları veya tüm hücreleri parçalamaktır. Günlük laboratuvar çalışmalarında bu, sonikasyonun kontrollü hücre bozulması ve biyomoleküllerin verimli bir şekilde ekstraksiyonu için standart bir yöntem olduğu anlamına gelir. Sonikatörlerin en önemli avantajı, ultrason yoğunluğu, titreşim ve sıcaklık kontrolü dahil olmak üzere kritik proses parametrelerini hassas bir şekilde modüle etme yeteneklerinde yatmaktadır. Bu kontrol, araştırmacıların hassas biyomoleküllere termal veya mekanik hasarı en aza indirirken güvenilir lizis elde etmelerine olanak tanıyarak nazik ancak oldukça verimli bir ekstraksiyon süreci sağlar.
Sonikatör Kullanarak Hücre Parçalama
Ultrasonik hücre lizisi, hücresel membranları bozmak ve hücre içi molekülleri serbest bırakmak için akustik kavitasyon kullanır. Hielscher Ultrasonics, klasik prob tipi sonikatörün yanı sıra steril işleme için çoklu numune sonikatörleri sunar: çoklu tüpler ve şişeler için VialTweeter ve standart mikroplakalar için 96-Well Plate Sonicator UIP400MTP.
Hielscher Ultrasonics, numune hazırlama ve klinik analiz için güçlü temassız sonikatörler sağlar. Çok kuyulu plaka sonikatörü UIP400MTP, VialTweeter (ŞişeTweeter), Kupa Boynuzu ve GDmini2 akış sonikatörü numuneleri steril koşullar altında işleyin.
Ultrasonik homojenizatörler UP100H (100 watt) ve UP400St (400 watt): Hücre lizisi ve ekstraksiyonu için sonikasyon.
Hücre Lizisi ve Ekstraksiyonu için Ultrasonik Homojenizatörler
| Ultrasonik Cihaz Tipi | Uygulama Odağı | Örnek Hacim | Tipik Kullanım Örneği | Avantaj -ları | Örnek Modeller |
|---|---|---|---|---|---|
| Prob Tipi Sonikatörler | Tek numuneli sonikasyon | 0.1 mL ila ~1000 mL | Hücre lizizi, protein ekstraksiyonu, DNA/RNA parçalanması | Hassas enerji kontrolü; çeşitli sonotrotlar; küçük ila orta boy numuneler için ideal | UP100H, UP200St, UP400St |
| VialTweeter / CupHorn | Çoklu mühürlü şişelerin paralel işlenmesi | 8-10 flakon (her biri ~1-20 mL) | Çoklu hücre süspansiyonlarının standartlaştırılmış lizizi | Düzgün sonikasyon; çapraz kontaminasyonu önler; tekrarlanabilir sonuçlar | VialTweeter, Kupa boynuzu |
| 96 kuyulu Plaka Sonikatörü | Çok kuyucuklu ve mikrotiter plakaların sonikasyonu | Mikroplaka formatı | Yüksek verimli tarama, proteomik, hücre deneyleri | Kuyularda eşzamanlı, eşit sonikasyon; çoklu örnek iş akışları için ideal | UIP400MTP |
| Akış hücresi reaktörleri | Daha yüksek hacimler için sürekli sonikasyon | >1 L, ölçeklenebilir | Endüstriyel ölçekte hücre parçalama, ekstrakt üretimi | Sürekli işleme; ölçeklenebilir; tam süreç kontrolü (genlik, basınç, sıcaklık) | UIP1000hdT, UIP2000hdT + akış hücresi |
| Steril / İndirekt Sonikasyon Sistemleri | Kontaminasyonsuz numune işleme | Flakon/tüp/mikroplakaya bağlı | Hassas numuneler, steril ortamlar, düzenleyici ortamlar | Prob teması yok; taşınmayı önler; minimum temizlik çabası | VialTweeter, Kupa boynuzu, UIP400MTP |
Hücre Lizisi için Sonikasyon Kullanmanın Avantajları
Diğer hücre lizisi ve ekstraksiyon yöntemleriyle karşılaştırıldığında, ultrasonik hücre lizizinin çeşitli avantajları vardır:
- Hız: Ultrasonik hücre lizisi ve ekstraksiyonu, açık hücreleri saniyeler içinde kırabilen hızlı bir yöntemdir. Bu, homojenizasyon, dondurarak çözdürme veya boncuk frezeleme gibi diğer yöntemlerden çok daha hızlıdır.
- Randıman: Ultrasonik hücre lizisi ve ekstraksiyonu, küçük, büyük veya birden fazla numuneyi aynı anda tedavi etmek için kullanılabilir, bu da onu küçük numunelerin ayrı ayrı işlenmesini gerektiren diğer yöntemlerden daha verimli hale getirir.
- Kimyasal içermez: Ultrasonik hücre lizisi ve ekstraksiyonu, sert kimyasalların veya enzimlerin kullanılmasını gerektirmeyen, invaziv olmayan bir yöntemdir. Bu, hücre içeriğinin bütünlüğünün korunması gereken uygulamalar için idealdir. Numunelerin istenmeyen kontaminasyonu önlenebilir.
- Yüksek verim: Ultrasonik hücre lizisi ve ekstraksiyonu, DNA, RNA ve proteinler dahil olmak üzere yüksek miktarda hücresel içerik çıkarabilir. Bunun nedeni, yüksek frekanslı ses dalgalarının hücre duvarlarını kırması ve içeriği çevredeki çözeltiye bırakmasıdır.
- Sıcaklık kontrolü: Gelişmiş ultrasonciators, numunenin hassas sıcaklık kontrolüne izin verir. Hielscher dijital sonikatörler, takılabilir bir sıcaklık sensörü ve sıcaklık izleme yazılımı ile donatılmıştır.
- Tekrarlanabilir: Ultrasonik hücre lizisi için protokoller kolayca çoğaltılabilir ve hatta basit bir doğrusal ölçek büyütme ile farklı daha büyük veya daha küçük numune hacimleriyle eşleştirilebilir.
- Çok yönlü: Ultrasonik hücre lizisi ve ekstraksiyonu, bakteri, maya, mantar, bitki ve memeli hücreleri dahil olmak üzere çok çeşitli hücre tiplerini çıkarmak için kullanılabilir. Proteinler, DNA, RNA ve lipitler dahil olmak üzere farklı molekül türlerini çıkarmak için de kullanılabilir.
- Çok sayıda numunenin aynı anda hazırlanması: Hielscher Ultrasonics, aynı işlem koşulları altında çok sayıda numuneyi rahatça işlemek için çeşitli çözümler sunar. Bu, parçalama ve ekstraksiyonun numune hazırlama adımını son derece verimli ve zaman kazandıran hale getirir.
- Kullanımı kolay: Ultrasonik hücre lizisi ve ekstraksiyon ekipmanının kullanımı kolaydır ve minimum eğitim gerektirir. Ekipman aynı zamanda ekonomiktir, çünkü elden çıkarmaların yeniden satın alınmasına gerek kalmadan tek bir yatırımdır. Bu, onu çok çeşitli araştırmacılar ve laboratuvarlar için çekici kılar.
Genel olarak, ultrasonik hücre lizisi ve ekstraksiyonu, hücresel içerikleri çıkarmak için hızlı, verimli, hassas bir şekilde kontrol edilebilir ve çok yönlü bir yöntemdir. Alternatif yöntemlere göre avantajları, onu çok çeşitli araştırma ve endüstriyel uygulamalar için çekici bir seçim haline getirir.
Ultrasonik Hücre Lizisinin Çalışma Prensibi
Ultrasonik hücre lizisi ve ekstraksiyonu, hücreleri bozmak ve içeriklerini çıkarmak için yüksek frekanslı ses dalgaları kullanır. Ses dalgaları, çevredeki sıvıda basınç değişiklikleri yaratarak, kavitasyon olarak bilinen bir süreçte küçük kabarcıkların oluşmasına ve çökmesine neden olur. Bu kabarcıklar, açık hücreleri kırabilen ve içeriklerini çevreleyen çözeltiye bırakabilen lokalize oldukça yoğun mekanik kuvvetler üretir.
Bir ultrasonicator kullanarak hücre lizisi genellikle aşağıdaki adımları içerir:
- Numune, sıvı tamponlu bir tüp veya kaba yerleştirilir.
- Numuneye ultrasonik bir prob yerleştirilir ve yaklaşık 20-30 kHz'lik yüksek frekanslı ses dalgaları uygulanır.
- Ultrason dalgaları, çevredeki sıvıda salınıma ve kavitasyona neden olarak, açık hücreleri kıran ve içeriklerini serbest bırakan lokalize kuvvetler üretir.
- Numune, herhangi bir hücresel kalıntıyı gidermek için santrifüjlenir veya filtrelenir ve ekstrakte edilen içerikler, sonraki analiz için toplanır.
Yaygın Lizis Yöntemlerinin Dezavantajları
Laboratuvarlardaki çalışmalarınız sırasında, geleneksel mekanik veya kimyasal lizis protokollerini kullanarak hücre lizizinin zorluğunu zaten yaşamış olabilirsiniz.
- Mekanik lizis: Harç ve havaneli ile öğütme veya fransız presi, boncuk değirmeni veya rotor-stator sistemi kullanılarak homojenleştirme gibi mekanik parçalama yöntemleri genellikle hassas kontrol ve ayar seçeneklerinden yoksundur. Bu, frezeleme ve öğütme kullanımının, numuneye zarar verebilecek ve proteinleri denatüre edebilecek hızlı bir şekilde ısı ve kesme kuvvetleri üretebileceği anlamına gelir. Ayrıca zaman alıcı olabilirler ve büyük miktarda başlangıç malzemesi gerektirebilirler.
- Kimyasal lizis: Deterjan bazlı lizis gibi kimyasal lizis yöntemleri, lipid çift tabakasını bozarak ve proteinleri denatüre ederek numuneye zarar verebilir. Ayrıca birden fazla adım gerektirebilirler ve aşağı akış uygulamalarına müdahale eden artık kirleticiler bırakabilirler. Optimum deterjan dozajını bulmak ek bir zorluktur.
- Donma-çözülme döngüleri: Donma-çözülme döngüleri hücre zarlarının yırtılmasına neden olabilir, ancak tekrarlanan döngüler de protein denatürasyonuna ve bozulmasına neden olabilir. Bu yöntem aynı zamanda birden fazla döngü gerektirebilir, bu da zaman alıcı olabilir ve genellikle daha düşük verimle sonuçlanır.
- Enzimatik liziz: Enzimatik lizis yöntemleri, belirli hücre tiplerine özgü olabilir ve birden fazla adım gerektirir, bu da onları zaman alıcı hale getirir. Ayrıca atık üretirler ve numunenin bozulmasını önlemek için dikkatli bir optimizasyon gerektirirler. Enzimatik lizis kitleri genellikle pahalıdır. Mevcut enzimatik lizis prosedürünüz yetersiz sonuç verirse, hücre bozulmasını yoğunlaştırmak için sinerjik yöntem olarak sonikasyon uygulanabilir.
Konvansiyonel mekanik ve kimyasal hücre lizis yöntemlerinin aksine, sonikasyon, sonikasyon parametreleri üzerinde tam bir kontrol sağlayan hücre parçalanması için çok verimli ve güvenilir bir araçtır. Bu, malzeme salınımı ve ürün saflığı konusunda yüksek bir seçicilik sağlar. [cf. Balasundaram ve diğerleri, 2009]
Tüm hücre tiplerine uygundur ve küçük ve büyük ölçekte kolayca uygulanabilir – her zaman kontrollü koşullar altında. Ultrasonikatörlerin temizlenmesi kolaydır. Ultrasonik homojenizatör her zaman yerinde temizlik (CIP) ve yerinde sterilizasyon (SIP) işlevine sahiptir. Sonotrot, su veya çözücü (çalışma ortamına bağlı olarak) içinde silinebilen veya yıkanabilen büyük bir titanyum kornadan oluşur. Ultrasonicators'ın bakımı, sağlamlıklarından dolayı neredeyse ihmal edilebilir.
Ultrasonik Lizis ve Hücre Bozulması
Genel olarak, numunelerin laboratuvarda parçalanması 15 saniye ile 2 dakika arasında sürecektir. Sonikasyonun yoğunluğunun, bir sonikasyon süresinin yanı sıra doğru ekipmanı seçerek genlik ayarlayarak ayarlanması çok kolay olduğundan, hücre yapısına ve lizis amacına bağlı olarak hücre zarlarını çok nazikçe veya çok ani bir şekilde bozmak mümkündür (örneğin, DNA ekstraksiyonu daha yumuşak sonikasyon gerektirir, bakterilerin tam protein ekstraksiyonu daha yoğun bir ultrason tedavisi gerektirir). İşlem sırasındaki sıcaklık, entegre bir sıcaklık sensörü tarafından izlenebilir ve soğutma (buz banyosu veya soğutma ceketli akış hücreleri) veya darbeli modda sonikasyon ile kolayca kontrol edilebilir. Darbe modu sonikasyonu sırasında, 1-15 saniye süreli kısa sonikasyon patlama döngüleri, daha uzun aralıklı dönemlerde ısı dağılımına ve soğumaya izin verir.
Ultrason güdümlü tüm süreçler tamamen tekrarlanabilir ve doğrusal olarak ölçeklenebilir.
VialTweeter (ŞişeTweeter) çok sayıda numunenin eşzamanlı, homojen ve hızlı steril hazırlanması için ultrasonik bir homojenizatördür.
- Hücre süspansiyonunun hazırlanması: Hücre peletleri, homojenize edilerek bir tampon çözelti içinde tamamen süspanse edilmelidir (aşağıdaki analizle uyumlu tampon çözeltinizi seçin, örneğin spesifik kromatografi yöntemi). Gerekirse lizozimler ve / veya diğer katkı maddeleri ekleyin (bunlar ayrıca ayırma / saflaştırma araçlarıyla da uyumlu olmalıdır). Tam süspansiyon elde edilene kadar çözeltiyi hafif sonikasyon altında nazikçe karıştırın / homojenize edin.
Sonikasyon ile birleştirilmiş lizozimlerin sinerjileri hakkında daha fazlasını okuyun! - Ultrasonik lizis: Numuneyi bir buz banyosuna yerleştirin. Hücre bozulması için, süspansiyonu 60-90 saniyelik patlamalarla sonikleştirin (sonikatörünüzün darbe modunu kullanarak).
- Ayırma: Lizatı santrifüjleyin (örn. 10.000 x g'da 10 dakika; 4°C'de). Süpernatanı hücre peletinden dikkatlice ayırın. Süpernatant, toplam hücre lizatıdır. Süpernatantın filtrelenmesinden sonra, çözünür hücre proteininin arıtılmış bir sıvısını elde edersiniz.
Biyoloji ve biyoteknolojide ultrasonicators için en yaygın uygulamalar şunlardır:
- Hücre ekstraktı hazırlama
- Maya, bakteri, bitki hücreleri, yumuşak veya sert hücre dokusu, nükleik materyalin bozulması
- Protein Ekstraksiyonu
- Enzimlerin hazırlanması ve izolasyonu
- Antijen üretimi
- DNA ekstraksiyonu ve/veya hedeflenen parçalanma
- lipozom hazırlama
Prob tipi ultrasonicator ile hücre bozulması etkili bir numune hazırlama yöntemidir.
Ultrasonun çeşitli uygulamaları biyoteknoloji, biyomühendislik, mikrobiyoloji, moleküler biyoloji, biyokimya, immünoloji, bakteriyoloji, viroloji, proteomik, genetik, fizyoloji, hücresel biyoloji, hematoloji ve botanik sektörlerinde dallanmaktadır.
Lizis: Hücre Yapılarının Kırılması
Hücreler, bir fosfo-lipid çift tabakasından (ayrıca protein-lipid çift tabakası; hidrofobik lipitler ve gömülü protein molekülleri ile hidrofilik fosfor molekülleri tarafından oluşturulan) oluşan ve hücre içleri (sitoplazma) ile hücre dışı ortam arasında bir bariyer oluşturan yarı geçirgen bir plazma zarı ile korunur. Bitki hücreleri ve prokaryotik hücreler bir hücre duvarı ile çevrilidir. Selülozun çok katmanlı kalın hücre duvarı nedeniyle, bitki hücrelerinin parçalanması hayvan hücrelerine göre daha zordur. Organeller, çekirdek, mitokondri gibi hücre içi, hücre iskeleti tarafından stabilize edilir.
Hücreleri parçalayarak, organellerin, proteinlerin, DNA'nın, mRNA'nın veya diğer biyomoleküllerin ekstrakte edilmesi ve ayrılması amaçlanır.
Konvansiyonel Hücre Lizisi Yöntemleri ve Dezavantajları
Hücreleri parçalamak için, deterjan veya çözücü kullanımı, yüksek basınç uygulaması veya bir boncuk değirmeni veya bir fransız presi kullanımını içeren mekanik ve kimyasal yöntemlere ayrılabilen birkaç yöntem vardır. Bu yöntemlerin en sorunlu dezavantajı, proses parametrelerinin zor kontrolü ve ayarlanması ve dolayısıyla etkisidir.
Aşağıdaki tablo, yaygın lizis yöntemlerinin ana dezavantajlarını göstermektedir:
Tablo: Konvansiyonel hücre lizisi yöntemlerinin önemli dezavantajları vardır
Lizis Prosedürü
Lizis hassas bir süreçtir. Parçalama sırasında hücre zarının korunması tahrip olur, ancak ekstrakte edilen proteinlerin fizyolojik olmayan bir ortam tarafından inaktivasyonu, denatürasyonu ve bozunması (pH değerinden sapma) önlenmelidir. Bu nedenle, genel olarak lizis bir tampon çözelti içinde gerçekleştirilir. Zorlukların çoğu, tüm hücre içi materyalin hedeflenmemiş bir şekilde salınmasına ve/veya hedef ürünün denatürasyonuna neden olan kontrolsüz hücre bozulmasından kaynaklanır.
Sonikasyon ve Hücre Lizisi Hakkında Sıkça Sorulan Sorular
- Sonikasyon ile hücreleri parçalayabilir misiniz? Evet, sonikasyon, kavitasyonu indükleyen yüksek frekanslı ultrasonik dalgalar kullanarak, küçük buhar kabarcıklarının hücre süspansiyonu içinde şiddetli bir şekilde oluştuğu ve çöktüğü bir fenomen kullanarak hücreleri etkili bir şekilde parçalar. Ortaya çıkan mekanik kuvvetler hücre zarlarını bozar ve hücre içi bileşenlerin sıvıya salınmasını kolaylaştırır.
- Hücre lizisi için bir sonikatör nasıl kullanılır? Hücre lizisi için bir sonikatör kullanmak, sonikatör probunun bir hücre süspansiyonuna daldırılmasını ve genlik ve darbe süresi gibi parametrelerin ayarlanmasını içerir. Protein denatürasyonunu ve enzim inaktivasyonunu en aza indirirken hücre bozulmasını optimize etmek için süreç yakından izlenmelidir.
- Hücre lizisi için sonikasyon prensibi nedir? Sonikasyon, akustik kavitasyon prensibi ile çalışır. Ultrasonik enerji sıvı ortama iletilir ve mikro kabarcıkların oluşumuna ve patlamasına yol açan hızlı basınç dalgalanmalarına neden olur. Bu patlamalar, yoğun kesme kuvvetleri ve lokalize yüksek sıcaklıklar üreterek hücresel yapıları bozar ve lizat homojenliğini arttırır.
- Hücre lizis sonikasyonu ne kadar sürer? Hücre lizisi için sonikasyon süresi, hücre tipi, hücre yoğunluğu, sonikatör gücü ve kullanılan spesifik protokol gibi faktörlere bağlı olarak önemli ölçüde değişebilir. Tipik prosedürler birkaç saniye ile birkaç dakika arasında değişebilir, genellikle ısı üretimini yönetmek ve düzgün hücre bozulmasını sağlamak için döngüler halinde gerçekleştirilir.
- Protein ekstraksiyonunda sonikasyonun amacı nedir? Protein ekstraksiyonunda, sonikasyon, hücre zarlarını verimli bir şekilde yırtmaya ve proteinleri çözündürmeye hizmet eder. Bu yöntem, proteinleri hücresel bölmelerden serbest bırakmak için özellikle yararlıdır, bu da proteinlerin saflaştırılacağı veya analiz edileceği lizatların hazırlanması için gerekli hale getirir.
- Sonikasyon neden ekstraksiyon için kullanılır? Sonikasyon, hızlı etkisi ve hedeflenen enerjiyi uygulama kabiliyeti, sert kimyasal işlemler kullanılmadan biyoaktif molekülleri serbest bırakmak için hücresel yapıları parçalaması, böylece ekstrakte edilen bileşiklerin fonksiyonel bütünlüğünü koruması nedeniyle ekstraksiyon için tercih edilir.
- Sonikasyon protein-protein etkileşimlerini bozar mı? Sonikasyon hücre zarlarını etkili bir şekilde bozabilirken, protein-protein etkileşimlerini de bozabilir. Bozulma seviyesi, sonikasyon yoğunluğuna ve maruz kalma süresine bağlıdır, bu da potansiyel olarak sonraki analitik veya fonksiyonel çalışmaları etkileyebilecek protein komplekslerinin denatürasyonuna veya ayrışmasına yol açar.
- Sonikasyon E. coli'yi parçalamak için kullanılabilir mi? Hielscher sonikatörleri, sağlam hücre duvarlarına sahip olan E. coli gibi bakteri hücrelerini parçalamak için özellikle etkilidir. Teknik, hücre duvarını ve zarını kesmek için fiziksel bir yöntem sağlar ve bu da onu moleküler biyoloji ve biyokimya laboratuvarlarında bakteri lizatlarının hazırlanması için tercih edilen bir yöntem haline getirir.
- Sonikasyon adımını takip eden işlemler nelerdir?
Ultrasonik lizizden sonraki adımlar tipik olarak lizatın fraksiyonlanmasını, organellerin hedefli izolasyonunu ve daha fazla protein ekstraksiyonu veya saflaştırmasını içerir.
İşlenen lizat daha sonra ayrılır ve yüksek çözünürlüklü proteomik, transkriptomik veya reseptör bağlama çalışmaları gibi analitik veya fonksiyonel uygulamalar için hazırlanır.
Literatür/Referanslar
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.