Maymun Çiçeği Virüsünde Ultrasonik Uygulamalar

Ultrasonikasyon, maymun çiçeği virüsünün (MPXV) analitik numunelerden izolasyonu, virüs DNA’sının parçalanması ve maymun çiçeği aşısı üretimi için önemli bir işleme yöntemidir. Tanı ve analiz (PCR, ELISA vb.) öncesinde numune hazırlamak için ultrasonikasyon, maymun çiçeği virüsünü hücre içinden serbest bırakmak ve / veya DNA’yı parçalamak amacıyla hücreleri lizise uğratmak için kullanılır. Aşı üretimindeki uygulamalar, virüs partikülü / DNA hazırlama, ilaç taşıyıcıları içinde kapsülleme ve inokulumların formülasyonunu kapsar.
Aşağıda, maymun çiçeği virüsü numunelerinin ultrasonik olarak hazırlanması ve ultrasonik destekli MPXV aşısı üretimi hakkında ayrıntılı bilgi bulabilirsiniz.

Bu sayfada bulacaklarınız:

Maymun Çiçeği Virüsünün Ekstraksiyonu için Ultrasonik Lizis
Maymun Çiçeği Virüsü DNA’sının Ultrasonik Parçalanması
MPXV Aşısı Üretiminde Ultrasonik Uygulamalar

Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Öncesinde Ultrasonik Lizis ve DNA Parçalanması

Maymun çiçeği virüsü enfeksiyonu, viral DNA’nın özgün dizilerini saptamak için gerçek zamanlı veya geleneksel polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanılarak nükleik asit amplifikasyon testi (NAAT) ile tespit edilir. Numune (örneğin nazofaringeal sürüntüden veya deri biyopsilerinden alınan numune), virüsü hücrelerin içinde içerir.
Analiz için virüsün hücrelerden serbest bırakılması ve viral DNA’nın PCR için parçalanması gerekir.

Ultrasonik Lizis:

Ultrasonik hücre parçalama / lizis, virüsleri hücre numunelerinden izole etmek için güvenilir ve verimli bir yöntemdir ve bu nedenle hücre lizisi ve DNA’nın serbest bırakılması için alternatif olarak kullanılan lizozim, proteinaz K ve çeşitli deterjanlar gibi kimyasal ajanlara göre tercih edilebilir bir tekniktir.
Ancak bu tür kimyasal reaktiflerin kullanımı, PCR reaksiyonunun inhibisyonunu önlemek için PCR analizinden önce birkaç aşamadan oluşan, zaman alıcı bir numune hazırlama süreci gerektirir. PCR inhibitörleri amplifikasyonun verimliliğini etkilediğinden, uzaklaştırılmayan inhibitörlerin miktarındaki küçük değişimler PCR ürününün amplifikasyonunda büyük değişimlere yol açabilir (Diaco, 1995).
Lizis için ultrasonikasyonun avantajı, lizis reaktiflerine ve zaman alıcı numune hazırlama işlemlerine gerek kalmadan hücresel yapıların tamamen parçalanmasının ve DNA’nın serbest bırakılmasının arzu edilir olmasıdır. (Bkz. Fykse et al., 2003)

Ultrasonik DNA Parçalanması:

Ultrasonik DNA parçalanması, uzunluğu ayarlanabilir DNA parçaları (baz çiftleri, bp) ürettiği için basit ve güvenilirdir. Ultrason kullanılarak DNA, hedeflenen DNA uzunluğuna etkili bir şekilde parçalanabilir. Ultrasonik parametrelerin hassas kontrolü ve gelişmiş soğutma seçenekleri DNA’nın bozunmasını önler.
Ultrasonik DNA parçalanması hakkında daha fazla bilgi edinin!

Bu videoda, tüm standart çok kuyucuklu plakalarda yüksek yoğunluklu ultrason kullanarak güvenilir numune hazırlamaya olanak tanıyan UIP400MTP ultrasonik numune hazırlama sistemi gösterilmektedir. UIP400MTP'nin tipik uygulamaları arasında hücre lizisi, DNA, RNA ve kromatinin parçalanması ile protein ekstraksiyonu yer alır.

Maymun Çiçeği Virüsü Aşısında Ultrasonik Uygulamalar

Maymun çiçeği virüsüne karşı kullanılan aşılar şu anda canlı virüs aşılarıdır. Yeni geliştirilen aşılar, DNA temelli gibi başka platformlar kullanabilir… Şu anda modifiye edilmiş bir Vaccinia Ankara virüsü, yani zayıflatılmış, çoğalmayan bir ortopoksvirüs içerir. Ayrıca Tris (tris-aminometan) ve sodyum klorür içerir. Aşı ayrıca, aşı virüsünü çoğaltmak için kullanılan tavuk embriyosu fibroblast hücrelerinden gelen az miktarda DNA ve protein, benzonaz ve gentamisin ve siprofloksasin gibi antibiyotik bileşikleri içerebilir.

Ultrasonik homojenizasyon, canlı zayıflatılmış virüs aşıları, DNA aşıları, çok değerlikli DNA kokteylleri, mRNA aşıları, rekombinant protein aşıları, virüs benzeri partikül aşıları vb. üretiminde kullanılır.

Aşı üretiminde ultrasonik uygulamalar şunları kapsar

virüs partiküllerinin ve ajanların dispersiyonu
emülsifikasyon
virüslerin inaktivasyonu
ilaç taşıyıcısı formülasyonu (NLC, SLN)
kapsülleme
ajanların çözündürülmesi
adjuvanların hazırlanması
gaz giderme / hava giderme

Aşı üretimini iyileştirmeye yönelik ultrasonik uygulamalar hakkında daha ayrıntılı bilgi bulabilirsiniz!

Maymun Çiçeği Virüsünün Ultrasonik İzolasyonu için Protokol

Stittelaar’ın araştırma ekibi (2005), maymun çiçeği virüsünü hem çoğaltmada kullanılan konak hücre kültüründen hem de enfekte primatlardan alınan boğaz sürüntülerinden elde edilen hücrelerden serbest bırakmak için ultrasonik lizis kullandı.

Maymun Çiçeği Aşısının Hazırlanması:

Maymun çiçeği virüsleri, belirli patojenlerden ari tavuk embriyosu fibroblast hücrelerinde çoğaltıldı. 1–2 günlük inkübasyonun ardından virüs-hücre süspansiyonu, bir dondurma-çözdürme döngüsüyle toplandı ve ardından santrifüjleme ile yoğunlaştırıldı. Pelet yeniden süspanse edildi ve birkaç ultrasonik homojenizasyon döngüsüne tabi tutuldu.

Aşılanmış Makaklardan Maymun Çiçeği Virüsünün İzolasyonu:

Numuneler üç kez dondurulup çözdürüldü ve ultrasonik bir CupHorn içinde sonikasyona tabi tutuldu. %1 fetal sığır serumu eklenmiş taşıma ortamında hazırlanan iki seyreltme (1:10 ve 1:100), altı kuyucuklu plakalardaki Vero hücresi tek katmanlarını inoküle etmek için kullanıldı. 37°C sıcaklıkta 1 h inkübasyonun ardından inokulumlar uzaklaştırıldı ve yerlerine %1 fetal sığır serumu eklenmiş kültür ortamı konuldu. Tek katmanlar 37°C sıcaklıkta 5 gün boyunca kültüre edildi ve kristal viyole çözeltisiyle boyandı.
(Bkz. Stittelaar et al., 2005)

Bu videoda, gazla süpürülebilen bir kabin içinde hat üzerinde çalışmak üzere tasarlanmış 2 kilowattlık bir ultrasonik sistem gösteriyoruz. Hielscher, kimya, ilaç, kozmetik ve petrokimya endüstrileri ile çözücü bazlı ekstraksiyon süreçleri dahil olmak üzere hemen hemen tüm endüstrilere ultrasonik ekipman tedarik etmektedir. Gazla süpürülebilen bu paslanmaz çelik kabin, tehlikeli alanlarda çalışmak üzere tasarlanmıştır. Bu amaçla müşteri, yanıcı gazların veya buharların kabine girmesini önlemek için sızdırmaz kabini azot veya temiz hava ile süpürebilir.

Virüs Analizi ve Aşı Üretimi için Sonikatörler

Hielscher Ultrasonics ürünlerinin geniş portföyü, araştırma ve analiz laboratuvarlarının yanı sıra endüstriyel aşı üretimi için de ideal sonikatörü sunar.
Hielscher Ultrasonics, araştırma ve analiz laboratuvarlarında kullanılmak ve endüstriyel aşı üretiminde uygulanmak üzere yüksek performanslı sonikatörlerin ve sono-biyoreaktörlerin tasarımı, üretimi ve dağıtımı konusunda uzmanlaşmıştır (örneğin aşılar, API’ler).
Sonikasyon, açık kaplara, sürekli karıştırılan kapalı reaktörlere ve sürekli akışlı reaktörlere uygulanabilir. Ultrasonik sistemlerin sıvı ortamla temas eden tüm parçaları paslanmaz çelik, titanyum veya camdan yapılır. Otoklavlanabilir parçalar ve hijyenik bağlantı elemanları, üretimin farmasötik kalite koşullarında gerçekleştirilmesini sağlar.
Otomatik Veri Kaydı: Akıllı yazılım, sonikasyon işleminin parametrelerini entegre SD bellek kartına otomatik olarak kaydeder. Tüm proses parametrelerinin hassas kontrolü, tekrarlanabilirliği, üretimin standardizasyonunu sağlar ve farmasötik ürün güvenliği standartlarının karşılanmasını kolaylaştırır.
Hielscher Ultrasonics ultrasonik işlemcileri son derece güvenilirdir ve hassas bir şekilde kontrol edilebilir. Tüm endüstriyel sonikatörler, düşük genliklerden çok yüksek genliklere kadar tüm aralığı sunacak şekilde ayarlanabilir. Hielscher ultrasonik sistemlerinin sağlamlığı, ağır hizmet koşullarında ve zorlu ortamlarda 24/7 çalışmaya olanak tanır.

Aşağıdaki tablo, sonikatörlerimizin yaklaşık işleme kapasitesi hakkında bilgi verir:

Parti Hacmi	Debi	Önerilen Cihazlar
çok kuyucuklu / mikrotitre plakaları	uygulanamaz	UIP400MTP
1–500mL	10–200mL/min	UP100H
10–2000mL	20–400mL/min	UP200Ht, UP400St
0,1–20L	0,2–4L/min	UIP2000hdT
10–100L	2–10L/min	UIP4000hdT
uygulanamaz	10–100L/min	UIP16000
uygulanamaz	daha yüksek	şu cihazdan oluşan küme: UIP16000

Bizimle İletişime Geçin! / Bize Sorun!

İlgili Konular

Literatür / Kaynaklar

Stittelaar, Koert; Amerongen, Geert; Kondova, Ivanela; Kuiken, Thijs; Lavieren, Rob; Pistoor, Frank; Niesters, Hubert; Doornum, Gerard; Van der Zeijst, Bernard; Mateo, Luis; Chaplin, Paul; Osterhaus, Albert (2005): Modified Vaccinia Virus Ankara Protects Macaques against Respiratory Challenge with Monkeypox Virus. Journal of Virology 79, 2005. 7845-51.
Shah Purvin, Parameswara Rao Vuddanda, Sanjay Kumar Singh, Achint Jain, and Sanjay Singh (2014): Pharmacokinetic and Tissue Distribution Study of Solid Lipid Nanoparticles of Zidov in Rats. Journal of Nanotechnology, Volume 2014.
J. Robin Harris, Andrei Soliakova, Richard J. Lewis, Frank Depoix, Allan Watkinson, Jeremy H. Lakeya (2012): Alhydrogel® adjuvant, ultrasonic dispersion and protein binding: a TEM and analytical study. Micron Volume 43, Issues 2–3, February 2012, 192-200.
Doron Melamed, Gabriel Leitner, E. Dan Heller (1991): A Vaccine against Avian Colibacillosis Based on Ultrasonic Inactivation of Escherichia coli. Avian Diseases Vol. 35, No. 1 (Jan. – Mar., 1991), 17-22.
Huang C-F, Wu T-C, Wu C-C, Lee C-C, Lo W-T, Hwang K-S, Hsu M-L, Peng H-J. (2011): Sublingual vaccination with sonicated Salmonella proteins and mucosal adjuvant induces mucosal and systemic immunity and protects mice from lethal enteritis. APMIS 119, 2011. 468–78.

Bilinmesi Gereken Bilgiler

Maymun Çiçeği Virüsü

Maymun çiçeği (MPV, MPXV veya hMPXV), viral bir zoonotik hastalığa neden olan çift sarmallı bir DNA virüsü türüdür. Bu hastalık, maymun çiçeği enfeksiyonu olarak bilinir ve insanlarda ve hayvanlarda görülebilir. Poxviridae ailesinin Orthopoxvirus cinsine aittir. Maymun çiçeği virüsü, variola (VARV), sığır çiçeği (CPX) ve vaccinia (VACV) virüsleriyle birlikte insan ortopoksvirüslerinden biridir. Ortopoksvirüsler, yaklaşık 200.000 bp uzunluğunda çift sarmallı bir DNA genomu içeren büyük, tuğla biçimli virüs partikülleriyle karakterize edilir.

ELISA Testi

ELISA, Enzime Bağlı İmmünosorbent Test anlamına gelir ve immünolojik testlerin altın standardı olarak kabul edilen işaretli bir immünolojik testtir. ELISA, yüksek tanısal duyarlılığı nedeniyle değer verilen bir immünolojik testtir; antikorlar, antijenler, proteinler, glikoproteinler ve hormonlar dahil olmak üzere molekülleri tespit etmek ve miktarlarını belirlemek için kullanılır. ELISA’nın prensibi, antijen-antikor etkileşimine dayanır. Bu antijen-antikor etkileşimiyle özgül antikorlar hedef antijenlerine bağlanır. Yalnızca bu etkileşim gerçekleştiğinde substrat enzime bağlanabilir ve ardından substrat dönüşümü gözlemlenebilir; bu da pozitif bir sonuç elde edildiği anlamına gelir.