Ultradźwiękowe przygotowanie liposomów

Liposomy wytwarzane ultradźwiękowo wykazują bardzo wysoką wydajność zamykania substancji, dużą pojemność załadunkową oraz jednolicie małe rozmiary i kulisty kształt. Dzięki temu liposomy wytwarzane ultradźwiękowo zapewniają doskonałą biodostępność. Hielscher Ultrasonics oferuje sonikatory do niezawodnej produkcji liposomów klasy farmaceutycznej w trybie okresowym i ciągłym.

Zalety ultradźwiękowej produkcji liposomów

Ultradźwiękowa enkapsulacja liposomalna to technika stosowana do zamykania leków lub innych substancji terapeutycznych w liposomach przy użyciu energii ultradźwiękowej. W porównaniu z innymi metodami enkapsulacji liposomalnej enkapsulacja ultradźwiękowa ma kilka zalet, które czynią ją lepszą techniką produkcji.

• Duży załadunek, wysoka wydajność zamykania substancji: Ultradźwiękowa produkcja liposomów jest dobrze znana z uzyskiwania liposomów o dużym załadunku składników aktywnych, np. witaminy C, cząsteczek leków itp. Jednocześnie metoda sonikacji wykazuje wysoką wydajność zamykania substancji. Oznacza to, że duży odsetek substancji aktywnej zostaje zamknięty w liposomach dzięki działaniu ultradźwięków. W rezultacie sprawia to, że sonikacja jest wysoce wydajną metodą produkcji liposomów.
• Liposomy o jednolicie małych rozmiarach: Jedną z zalet ultradźwiękowej enkapsulacji liposomalnej jest możliwość wytwarzania wysoce jednorodnych liposomów o wąskim rozkładzie wielkości. Energia ultradźwiękowa może być wykorzystywana do rozbijania większych liposomów lub agregatów lipidowych na mniejsze, bardziej jednorodne liposomy. Prowadzi to do większej jednorodności wielkości i kształtu liposomów, co może mieć znaczenie w zastosowaniach związanych z dostarczaniem leków, w których wielkość cząstek może wpływać na ich farmakokinetykę i skuteczność.
• Możliwość zastosowania do dowolnych cząsteczek: Kolejną zaletą ultradźwiękowej enkapsulacji liposomalnej jest możliwość zamykania szerokiej gamy leków i innych substancji terapeutycznych. Technikę tę można stosować do enkapsulacji zarówno leków hydrofilowych, jak i hydrofobowych, co może być trudne przy użyciu innych metod. Ponadto energia ultradźwiękowa może być wykorzystywana do enkapsulacji makrocząsteczek i nanocząstek, które mogą być zbyt duże, aby zamknąć je przy użyciu innych metod.
• Szybkość i niezawodność: Ultradźwiękowa enkapsulacja liposomalna jest również stosunkowo prostym i szybkim procesem. Nie wymaga stosowania agresywnych substancji chemicznych ani wysokich temperatur, które mogą niekorzystnie wpływać na enkapsulowane substancje terapeutyczne.
• Zwiększanie skali: Ponadto technikę tę można łatwo skalować do produkcji na dużą skalę, co czyni ją opłacalnym rozwiązaniem w zastosowaniach związanych z dostarczaniem leków.

Podsumowując, ultradźwiękowa enkapsulacja liposomalna jest lepszą techniką enkapsulacji liposomalnej dzięki możliwości wytwarzania jednorodnych liposomów o wąskim rozkładzie wielkości, zamykania szerokiej gamy substancji terapeutycznych oraz dzięki prostocie i skalowalności.

Po utworzeniu filmu lipidowego i jego późniejszym ponownym uwodnieniu stosuje się sonikację, aby wspomóc zamykanie składników aktywnych w liposomie. Ponadto sonikacja pozwala uzyskać pożądaną wielkość liposomów.

Ultradźwiękowe przygotowanie liposomów do zastosowań farmaceutycznych i kosmetycznych

Liposomy (pęcherzyki lipidowe), transferosomy (ultraodkształcalne liposomy), etosomy (ultraodkształcalne pęcherzyki o dużej zawartości alkoholu) i niosomy (pęcherzyki syntetyczne) są mikroskopijnymi pęcherzykami, które można sztucznie przygotować jako kuliste nośniki, w których można zamykać cząsteczki aktywne. Pęcherzyki te, o średnicach od 25 do 5000 nm, są często wykorzystywane jako nośniki leków w przemyśle farmaceutycznym i kosmetycznym, np. do doustnego lub miejscowego dostarczania leków, terapii genowej i immunizacji. Sonikacja jest naukowo potwierdzoną metodą wysoce wydajnej produkcji liposomów. Sonikatory Hielscher wytwarzają liposomy o dużym załadunku składników aktywnych i lepszej biodostępności.

Liposomy i formulacje liposomalne

Liposomy to jednolamelarne, oligolamelarne lub wielolamelarne układy pęcherzykowe zbudowane z tego samego materiału co błona komórkowa (dwuwarstwa lipidowa). Ze względu na skład i wielkość liposomy dzieli się następująco:

• pęcherzyki wielolamelarne (MLV, 0,1–10μm)
• małe pęcherzyki jednolamelarne (SUV, <100 nm)
• duże pęcherzyki jednolamelarne (LUV, 100–500 nm)
• olbrzymie pęcherzyki jednolamelarne (GUV, ≥1 μm)

Główną strukturę liposomów tworzą fosfolipidy. Fosfolipidy mają hydrofilową grupę główkową i hydrofobową grupę ogonową, która składa się z długiego łańcucha węglowodorowego.
Błona liposomu ma skład bardzo podobny do bariery skórnej, dzięki czemu liposomy mogą łatwo integrować się z ludzką skórą. Gdy liposomy łączą się ze skórą, mogą uwalniać zamknięte w nich substancje bezpośrednio w miejscu docelowym, gdzie składniki aktywne mogą pełnić swoje funkcje. W ten sposób liposomy zwiększają zdolność przenikania przez skórę / przepuszczalność skóry dla zamkniętych w nich substancji farmaceutycznych i kosmetycznych. Również liposomy bez enkapsulowanych substancji, czyli puste pęcherzyki, są silnie działającymi składnikami aktywnymi dla skóry, ponieważ „phosphatidylcholin” zawiera dwa niezbędne składniki, których organizm ludzki nie może sam wytwarzać: kwas linolowy i cholinę.
Liposomy są stosowane jako biokompatybilne nośniki leków, peptydów, białek, „plasmic DNA”, oligonukleotydów antysensownych lub rybozymów do celów farmaceutycznych, kosmetycznych i biochemicznych. Ogromna różnorodność wielkości cząstek i parametrów fizycznych lipidów stwarza atrakcyjne możliwości konstruowania nośników dostosowanych do szerokiej gamy zastosowań. (Ulrich 2002)

Ultradźwiękowe tworzenie liposomów

Liposomy można tworzyć przy użyciu ultradźwięków. Podstawowym materiałem do przygotowania liposomów są cząsteczki określone jako „amphilic”, pochodzące z lipidów błon biologicznych lub oparte na nich. Aby utworzyć małe pęcherzyki jednolamelarne (SUV), dyspersję lipidową poddaje się łagodnej sonikacji – np. za pomocą ręcznego urządzenia ultradźwiękowego UP50H (50W, 30kHz), VialTweeter lub reaktora ultradźwiękowego CupHorn – w łaźni lodowej. Taka obróbka ultradźwiękowa trwa około 5 – 15 minut. Inną metodą wytwarzania małych pęcherzyków jednolamelarnych jest sonikacja liposomów w postaci pęcherzyków wielolamelarnych.
Dinu-Pirvu et al. (2010) opisują uzyskiwanie transferosomów przez sonikację MLV w temperaturze pokojowej.
Hielscher Ultrasonics oferuje różne urządzenia ultradźwiękowe, sonotrody i akcesoria, dzięki czemu może zapewnić najbardziej odpowiedni zestaw ultradźwiękowy do wysoce wydajnej enkapsulacji liposomalnej w dowolnej skali.

Ultradźwiękowa enkapsulacja substancji aktywnych w liposomach

Liposomy pełnią funkcję nośników składników aktywnych, takich jak witaminy, cząsteczki terapeutyczne, peptydy itp. Ultradźwięki są skutecznym narzędziem do przygotowywania i tworzenia liposomów w celu zamykania substancji aktywnych. Jednocześnie sonikacja wspomaga proces enkapsulacji i zamykania substancji, dzięki czemu powstają liposomy o dużym załadunku składników aktywnych. Przed enkapsulacją liposomy mają tendencję do tworzenia skupisk wskutek powierzchniowych oddziaływań między ładunkami polarnych główek fosfolipidów (por. Míckova et al. 2008); ponadto muszą zostać otwarte. Na przykład Zhu et al. (2003) opisują enkapsulację sproszkowanej biotyny w liposomach przy użyciu ultradźwięków. Po dodaniu sproszkowanej biotyny do roztworu zawierającego zawiesinę pęcherzyków roztwór poddano sonikacji. Po tej obróbce biotyna została zamknięta w liposomach.
Dowiedz się więcej o ultradźwiękowej enkapsulacji „peptrides” GLP-1 (np. semaglutydu) w liposomach!

Emulsje liposomalne z wykorzystaniem ultradźwięków

Aby wzmocnić działanie pielęgnacyjne kremów nawilżających lub przeciwstarzeniowych, balsamów, żeli i innych formulacji kosmeceutycznych, do dyspersji liposomalnych dodaje się emulgatory w celu stabilizacji większych ilości lipidów. Badania wykazały jednak, że możliwości liposomów są na ogół ograniczone. Po dodaniu emulgatorów efekt ten pojawi się wcześniej, a dodatkowe emulgatory powodują osłabienie powinowactwa fosfatydylocholiny do bariery skórnej. Odpowiedzią na ten problem są nanocząstki – złożone z fosfatydylocholiny i lipidów. Nanocząstki te tworzy kropla oleju pokryta monowarstwą fosfatydylocholiny. Zastosowanie nanocząstek umożliwia uzyskanie formulacji, które mogą przyjmować więcej lipidów i pozostają stabilne, dzięki czemu dodatkowe emulgatory nie są potrzebne.
Sonikacja jest sprawdzoną metodą produkcji nanoemulsji i nanodyspersji. Ultradźwięki o bardzo wysokiej intensywności dostarczają mocy potrzebnej do rozproszenia fazy ciekłej (fazy rozproszonej) w postaci małych kropli w drugiej fazie (fazie ciągłej). W strefie dyspergowania implodujące pęcherzyki kawitacyjne wywołują intensywne fale uderzeniowe w otaczającej cieczy i prowadzą do powstawania strug cieczy o dużej prędkości. Aby zabezpieczyć nowo powstałe krople fazy rozproszonej przed koalescencją, do emulsji dodaje się emulgatory (substancje powierzchniowo czynne, surfaktanty) i stabilizatory. Ponieważ koalescencja kropli po ich rozbiciu wpływa na końcowy rozkład wielkości kropli, stosuje się skutecznie stabilizujące emulgatory, aby utrzymać końcowy rozkład wielkości kropli na poziomie równym rozkładowi bezpośrednio po rozbiciu kropli w ultradźwiękowej strefie dyspergowania.

Dyspersje liposomalne z wykorzystaniem ultradźwięków

Dyspersje liposomalne oparte na nienasyconym związku „phosphatidylchlorine” wykazują niewystarczającą stabilność wobec utleniania. Stabilizację dyspersji można osiągnąć za pomocą przeciwutleniaczy, takich jak kompleks witamin C i E.
 

Tworzenie liposomów metodą odparowania fazy odwróconej z wykorzystaniem sonikacji

 
Ortan et al. (2002) uzyskali dobre wyniki w badaniu dotyczącym ultradźwiękowego przygotowania olejku eterycznego z Anethum graveolens w liposomach. Po sonikacji wielkość liposomów mieściła się w zakresie 70–150 nm, a w przypadku MLV w zakresie 230–475 nm; wartości te pozostawały w przybliżeniu stałe również po 2 miesiącach, ale wzrosły po 12 miesiącach, zwłaszcza w dyspersji SUV (zob. histogramy poniżej). Pomiar stabilności, dotyczący utraty olejku eterycznego i rozkładu wielkości, również wykazał, że dyspersje liposomalne zachowały zawartość olejku lotnego. Sugeruje to, że zamknięcie olejku eterycznego w liposomach zwiększyło jego stabilność.

Ortan et al. (2009): Stabilność dyspersji MLV i SUV po 1 roku. Formulacje liposomalne przechowywano w temperaturze 4±1 ºC.

Procesory ultradźwiękowe Hielscher są idealnymi urządzeniami do zastosowań w przemyśle kosmetycznym i farmaceutycznym. Systemy składające się z kilku procesorów ultradźwiękowych o mocy do 16 000 watów każdy zapewniają wydajność potrzebną do przekształcenia tego zastosowania laboratoryjnego w wydajną metodę produkcji drobno zdyspergowanych emulsji w przepływie ciągłym lub w trybie okresowym – umożliwiając uzyskanie wyników porównywalnych z wynikami najlepszych obecnie dostępnych homogenizatorów wysokociśnieniowych, takich jak zawory z otworem dławiącym. Oprócz wysokiej wydajności emulgowania ciągłego urządzenia ultradźwiękowe Hielscher wymagają bardzo niewielkiej konserwacji i są bardzo łatwe w obsłudze oraz czyszczeniu. Ultradźwięki rzeczywiście wspomagają czyszczenie i płukanie. Moc ultradźwięków jest regulowana i można ją dostosować do konkretnych produktów oraz wymagań emulgowania. Dostępne są również specjalne reaktory z komorą przepływową spełniające zaawansowane wymagania CIP (czyszczenie na miejscu) i SIP (sterylizacja na miejscu).

Najczęściej zadawane pytania dotyczące liposomów

Jakie rodzaje liposomów się wyróżnia?

Liposomy dzieli się na różne rodzaje na podstawie ich wielkości i liczby zawartych w nich dwuwarstw. Kategorie te obejmują:

• Małe pęcherzyki jednolamelarne (SUV): Są to najmniejsze liposomy z pojedynczą dwuwarstwą lipidową.
• Duże pęcherzyki jednolamelarne (LUV): Są większe od SUV i również mają pojedynczą dwuwarstwę.
• Pęcherzyki wielolamelarne (MLV): Zawierają wiele koncentrycznych dwuwarstw.
• Pęcherzyki wielopęcherzykowe (MVV): Składają się z wielu mniejszych pęcherzyków znajdujących się wewnątrz większego pęcherzyka.

 
Inne wyspecjalizowane rodzaje obejmują:

• Liposomy PEGylowane: Liposomy modyfikowane glikolem polietylenowym (PEG) w celu zwiększenia stabilności i wydłużenia czasu krążenia.
• Nanoliposomy: Bardzo małe liposomy, zwykle stosowane do ukierunkowanego dostarczania leków.

Jakie struktury pęcherzykowe mogą wykazywać liposomy?

Liposomy dzieli się również na siedem głównych rodzajów na podstawie ich struktury pęcherzykowej:

• Duże pęcherzyki wielolamelarne (MLV): Zawierają wiele dwuwarstw.
• Pęcherzyki oligolamelarne (OLV): Mają kilka dwuwarstw.
• Małe pęcherzyki jednolamelarne (SUV): Najmniejsze, z pojedynczą dwuwarstwą.
• Pęcherzyki jednolamelarne średniej wielkości (MUV): Pośredniej wielkości, z pojedynczą dwuwarstwą.
• Duże pęcherzyki jednolamelarne (LUV): Większe, z pojedynczą dwuwarstwą.
• Olbrzymie pęcherzyki jednolamelarne (GUV): Bardzo duże, z pojedynczą dwuwarstwą.
• Pęcherzyki wielopęcherzykowe (MVV): Wiele pęcherzyków wewnątrz pojedynczego dużego pęcherzyka.

Jakie są różnice między liposomami a niosomami?

Liposomy i niosomy różnią się głównie składem:
Liposomy: Są zbudowane z dwułańcuchowych fosfolipidów, które mogą być obojętne lub naładowane.
Niosomy: Są zbudowane z nienaładowanych jednołańcuchowych surfaktantów i cholesterolu.
Obie struktury powstają w wyniku sonikacji, która wspomaga organizowanie się pęcherzyków o strukturze dwuwarstwowej.

Jaka jest idealna wielkość liposomu?

W przypadku dostarczania substancji terapeutycznych idealna wielkość liposomu teoretycznie odpowiada średnicy od 50 do 200 nanometrów. Ten zakres wielkości optymalizuje stabilność i biodostępność. Sonikacja jest powszechnie stosowana do zmniejszania pęcherzyka do pożądanej wielkości.

Czy liposomy mogą przenosić leki hydrofilowe?

Tak, liposomy mogą przenosić leki hydrofilowe. Są cenione w zastosowaniach biomedycznych ze względu na możliwość enkapsulacji zarówno substancji hydrofobowych, jak i hydrofilowych. Ponadto wykazują wysoką biokompatybilność i biodegradowalność, co czyni je skutecznymi systemami dostarczania.

Jak wytwarzać liposomy?

Najczęściej stosowanymi technikami przygotowania liposomów są metoda cienkiego filmu i metoda odparowania fazy odwróconej.
Metoda uwadniania cienkiego filmu:

1. Rozpuść lipidy w rozpuszczalniku organicznym.
2. Odparuj rozpuszczalnik, aby utworzyć cienki film lipidowy.
3. Uwodnij film roztworem wodnym przy użyciu sonikacji, aby utworzyć pęcherzyki wielolamelarne.

Metoda odparowania fazy odwróconej:

1. Rozpuść lipidy w wodzie i etanolu.
2. Poddaj roztwór sonikacji w temperaturze 60°C przez około 10 minut, aby utworzyć pastę lipidową.
3. Ochłodź zawiesinę lipidową i dodawaj kroplami wodę lub bufor, mieszając.
4. Uwadniaj zawiesinę przez 1 godzinę, aby utworzyć pęcherzyki wielolamelarne.
5. Zmniejsz wielkość liposomów przez dalszą sonikację.

Czym są archeosomy?

Archeosomy to liposomy wytwarzane z lipidów archeonów, które są znane ze swojej stabilności i odporności na ekstremalne warunki. Właściwości te sprawiają, że archeosomy są szczególnie przydatne do dostarczania leków i opracowywania szczepionek w wymagających środowiskach.

Jak przygotowuje się archeosomy?

Procedura sonikacji według Pise (2022): Archeosomy można wytwarzać z polarnej frakcji lipidowej „PLF” Sulfolobussolfataricus przez sonikację w temperaturze 60°C bez konieczności uzupełniania lipidów z zewnątrz. W temperaturze 0°C lipidy polarne Sulfolobusacidocaldarius skutecznie poddawano sonikacji w celu utworzenia archeosomów. Archeosomy zawierające BMD i konwencjonalne liposomy, a także lipidy archeonów wyizolowane z Archaea H. salinarum i wzbogacone fosfatydylocholiną, wytwarzano przy użyciu technik sonikacji. Pęcherzyki poddane sonikacji tworzono do dostarczania miejscowego przez sonikację dyspersji MLV przy amplitudzie 80 procent przez 4 minuty za pomocą sonikatora sondowego Hielscher UP50H (zob. zdjęcie po lewej).

Literatura / źródła

• Raquel Martínez-González, Joan Estelrich, Maria Antònia Busquets (2016): Liposomes Loaded with Hydrophobic Iron Oxide Nanoparticles: Suitable T2 Contrast Agents for MRI. International Journal of Molecular Science 2016.
• Zahra Hadian, Mohammad Ali Sahari, Hamid Reza Moghimi; Mohsen Barzegar (2014): Formulation, Characterization and Optimization of Liposomes Containing Eicosapentaenoic and Docosahexaenoic Acids; A Methodology Approach. Iranian Journal of Pharmaceutical Research (2014), 13 (2): 393-404.
• Joanna Kopecka, Giuseppina Salzano, Ivana Campia, Sara Lusa, Dario Ghigo, Giuseppe De Rosa, Chiara Riganti (2014): Insights in the chemical components of liposomes responsible for P-glycoprotein inhibition. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2013.
• Pise, Ganesh (2022): Archaeosomes for both cell-based delivery applications and drug-based delivery applications. Journal of Medical Pharmaceutical and Allied Sciences 11, 2022. 4995-5003.