Sonikacja (SAAT - Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation) jest efektywną metodą infekcji komórek roślinnych obcymi genami z wykorzystaniem Agrobacterium jako transportera. Kawitacja ultradźwiękowa powoduje sonoporację, którą można opisać jako ukierunkowane mikro rany tkanki roślinnej. Poprzez te ultradźwiękowe mikro rany, DNA i wektory DNA mogą być skutecznie transportowane do macierzy komórkowej.

sonoporacja – Ultradźwiękowo wzmocniona transformacja komórek

Kiedy ultradźwięki o niskiej częstotliwości (ok. 20kHz) są stosowane do zawiesin komórkowych, efekty kawitacji akustycznej powodują przejściową permeabilizację błony w tkankach komórkowych. Ten efekt ultradźwiękowy jest znany jako sonoporacja i jest wykorzystywany do transferu genów do komórek lub tkanek.
Zalety ultradźwięków wynikają z ich nietermicznej, mechanicznej zasady działania, dzięki czemu sonikacja jest często bardziej uniwersalna i mniej zależna od typów komórek. Wszechstronne zastosowanie sonoporacji otwiera możliwość wykorzystania roślin transgenicznych, które mają znaczący potencjał w bioprodukcji złożonych ludzkich białek terapeutycznych. Takie roślinne bioreaktory mogą być łatwo manipulowane genetycznie, zapobiegają potencjalnemu zanieczyszczeniu ludzkimi patogenami, nie uszkadzają bakterii pośredniczących w transformacji (np. Agrobacterium) i są niedrogą, wydajną metodą biosyntezy.

Transformacja komórek wspomagana ultradźwiękami

Sonikacja jest techniką, w której stosuje się fale ultradźwiękowe o niskiej częstotliwości do mieszania cząstek w roztworze, w celu wymieszania roztworów, zwiększając w ten sposób szybkość przenoszenia masy i rozpuszczania. Jednocześnie sonikacja może usunąć z cieczy rozpuszczone gazy. W procesie transformacji roślin sonikacja powoduje powstawanie mikrorys na tkankach roślinnych i zwiększa dostarczanie nagiego DNA do protoplastu roślinnego.

Do transformacji genetycznej preferowaną metodą jest wspomagana sonikacją transformacja z udziałem Agrobacterium (SAAT), która charakteryzuje się znacznie wyższą wydajnością niż sonikacja stosowana do przenoszenia nagiego DNA i wektorów DNA bezpośrednio do protoplastu. Liczne badania wykazały, że sonikacja wspomagana transformacją z udziałem Agrobacterium (SAAT) może być wykorzystywana do indukowania mechanicznych zakłóceń i tworzenia ran na komórkach roślinnych przez fale ultradźwiękowe i wynikającą z nich kawitację akustyczną. Krótki zabieg ultradźwiękowy powoduje powstanie mikro ran na powierzchni eksplantatów. Zranione komórki umożliwią wniknięcie Agrobacterium do głębszych partii tkanek roślinnych, zwiększając tym samym prawdopodobieństwo zakażenia komórek roślinnych. Dodatkowo wydzielane związki fenolowe nasilają transformację. Generowane ultradźwiękowo mikro rany sprawiają, że penetracja eksplantatu przez bakterie jest również bardziej realna. SAAT został z powodzeniem wykorzystany do transformacji genetycznej w gatunkach roślin szczególnie uznanych za odporne na Agrobacterium.
SAAT jest bardzo prostą i niedrogą metodą, jak również znacząco zwiększa transfer genów z udziałem Agrobacterium. Oprócz udanego zastosowania SAAT w transformacji Chenopodium rubrum L. i Beta vulgaris L., podejście to zostało również zastosowane w produkcji rekombinowanej holotoksyny Escherichia coli typu dzikiego odpornej na wysoką temperaturę oraz zmutowanych adiuwantów szczepionkowych LT Escherichia coli w Nicotiana tabacum, w których wykryto najwyższe systemowe miana IgG specyficznych dla LT-B u ptaków.
(por. Laere i in., 2016; M. Klimek-Chodacka i R. Barański, 2014)

Naukowo udowodnione korzyści transformacji wspomaganej sonikacją (SAAT) przez Agrobacterium

Transformacja wspomagana sonikacją (SAAT) została zastosowana do wielu gatunków roślin. Krótka i stosunkowo łagodna obróbka ultradźwiękowa roślinnych kultur komórkowych powoduje sonoporację, która następnie umożliwia głęboką penetrację Agrobacterium jako transportera genów. Poniżej można zapoznać się z przykładowymi badaniami wykazującymi korzystne działanie SAAT.

Wspomagane ultradźwiękami przekształcanie Ashwagandhy

W celu poprawy wydajności transformacji w W. somnifera (znanej jako ashwagandha lub wiśnia zimowa), Dehdashti i współpracownicy (2016) badali zastosowanie acetosyringonu (AS) i sonikacji.
Acetosyringon (AS) był dodawany w trzech etapach: płynnej kultury Agrobacterium, infekcji Agrobacterium i współkultury eksplantatów z Agrobacterium. Dodatek 75 μM AS do płynnej kultury Agrobacterium okazał się optymalny dla indukcji genów vir.
Dodatkowe zastosowanie sonikacji (SAAT) spowodowało najwyższą ekspresję genów. Ekspresja genu gusA w korzeniach włośnikowych była najlepsza, gdy liście i wierzchołki pędów poddano sonikacji odpowiednio przez 10 i 20s. Wydajność transformacji w ulepszonym protokole wyniosła 66,5 i 59,5% odpowiednio w przypadku eksplantatów z liści i wierzchołków pędów. W porównaniu z innymi protokołami, wydajność transformacji ulepszonego protokołu okazała się 2,5-krotnie wyższa dla liści i 3,7-krotnie wyższa dla końcówek pędów. Analiza Southern blot potwierdziła obecność 1-2 kopii transgenu gusA w liniach W1-W4, podczas gdy w linii W5 wygenerowanej za pomocą ulepszonego protokołu wykryto 1-4 kopii transgenu.

Wpływ czasu trwania wspomaganej sonikacją transformacji Agrobacterium (SAAT) na częstotliwość transformacji eksplantatów liści (a) i wierzchołków pędów (b) W. somnifera
(opracowanie i grafika: © Dehdashti et al., 2016)

Przekształcanie bawełny wspomagane ultradźwiękami

Hussain i wsp. (2007) wykazują korzystne efekty transformacji bawełny wspomaganej sonikacją. Kawitacja akustyczna wywołana przez ultradźwięki o niskiej częstotliwości tworzy mikro rany na i pod powierzchnią tkanki roślinnej (sonoporacja) i pozwala Agrobacterium przemieszczać się głębiej i w całości w tkance roślinnej. Ten sposób ranienia zwiększa prawdopodobieństwo zainfekowania komórek roślinnych leżących głębiej w tkance. W celu oceny efektywności transformacji SAAT zmierzono ekspresję genu GUS. System reporterowy GUS jest systemem genów reporterowych, szczególnie przydatnym w biologii molekularnej roślin i mikrobiologii. Dostosowując różne parametry SAAT, znacząco zwiększono ekspresję GUS w bawełnie z wykorzystaniem dojrzałych zarodków jako eksplantatu. Ekspresję GUS wykryto po raz pierwszy po 24 godzinach od inkubacji eksplantatów, a po 48 godzinach ekspresja GUS była bardzo intensywna, co posłużyło jako użyteczny wskaźnik udanej transformacji eksplantatu bawełny po sonikacji wspomaganej transformacją Agrobacterium (SAAT). W porównaniu z różnymi technikami transformacji (mianowicie biolistyczną, Agro, BAAT, SAAT), transformacja wspomagana sonikacją Agrobacterium (SAAT) wykazała zdecydowanie najlepsze wyniki transformacji.

Wybór procedury transformacji na podstawie przejściowej ekspresji GUS. Transformacja wspomagana sonikacją z użyciem Agrobacterium (SAAT) wykazuje znacznie wyższą przejściową ekspresję.
(opracowanie i grafika: © Hussain et al., 2007)

Wysokowydajne rozwiązania ultradźwiękowe dla sonoporacji i SAAT

Firma Hielscher Ultrasonics posiada wieloletnie doświadczenie w projektowaniu i produkcji wysokowydajnych ultradźwięków dla laboratoriów, obiektów badawczych, jak również produkcji przemysłowej o bardzo dużej przepustowości. Dla mikrobiologii i nauk przyrodniczych firma Hielscher oferuje różne rozwiązania spełniające różne wymagania niezbędne dla określonych tkanek i ich obróbki. Do jednoczesnej ultradźwiękowej obróbki wielu próbek Hielscher oferuje UIP400MTP do płytek wielokomorowych, VialTweeter do sonikacji do 10 fiolek (np. probówek Eppendorf) lub ultradźwiękowy CupHorn. Ultradźwięki typu sonda są dostępne w zakresie mocy od 50 do 400 W jako homogenizatory laboratoryjne, natomiast systemy przemysłowe pokrywają zakres mocy od 500 W do 16kW.
Skontaktuj się z nami i daj nam znać o swoich wymaganiach dotyczących aplikacji i procesu. Nasz doświadczony personel chętnie poleci najbardziej odpowiedni ultradźwiękowiec dla Twojego procesu biologicznego.
Poniższa tabela daje wskazanie przybliżonej mocy przerobowych naszych ultrasonicators: