Transformacja genetyczna komórek roślinnych z wykorzystaniem ultradźwięków

Transformacja za pośrednictwem Agrobacterium wspomagana sonikacją (SAAT) jest skuteczną metodą zakażania komórek roślinnych obcymi genami z wykorzystaniem Agrobacterium jako nośnika. Kawitacja ultradźwiękowa powoduje sonoporację, którą można opisać jako ukierunkowane tworzenie mikrouszkodzeń tkanki roślinnej. Przez te mikrouszkodzenia wytworzone ultradźwiękowo DNA i wektory DNA mogą być skutecznie transportowane do macierzy komórkowej.

Sonoporacja – transformacja komórek wspomagana ultradźwiękami

Gdy ultradźwięki o niskiej częstotliwości (ok. 20kHz) są stosowane do zawiesin komórek, efekty kawitacji akustycznej powodują przejściowe zwiększenie przepuszczalności błon komórek w tkankach. Ten efekt ultradźwiękowy jest znany jako sonoporacja i jest wykorzystywany do przenoszenia genów do komórek lub tkanek.
Zalety obróbki ultradźwiękowej wynikają z jej nietermicznej, mechanicznej zasady działania, dzięki której sonikacja jest często bardziej wszechstronna i mniej zależna od typu komórek. Wszechstronne zastosowanie sonoporacji otwiera możliwość wykorzystania roślin transgenicznych, które mają znaczny potencjał w bioprodukcji złożonych ludzkich białek terapeutycznych. Takie bioreaktory roślinne można łatwo modyfikować genetycznie, zapobiegają one potencjalnemu zanieczyszczeniu patogenami ludzkimi, nie uszkadzają bakterii pośredniczących w transformacji (np. Agrobacterium) i stanowią niedrogą, skuteczną metodę biosyntezy.

Transformacja komórek wspomagana ultradźwiękami

Sonikacja to technika wykorzystująca fale ultradźwiękowe o niskiej częstotliwości do wprawiania cząstek w roztworze w ruch oraz mieszania roztworów, co zwiększa szybkość transportu masy i rozpuszczania. Jednocześnie sonikacja może usuwać z cieczy rozpuszczone gazy. Podczas transformacji roślin sonikacja powoduje powstawanie mikrouszkodzeń tkanki roślinnej i usprawnia dostarczanie nagiego DNA do protoplastu roślinnego.

W transformacji genetycznej preferowaną metodą jest transformacja za pośrednictwem Agrobacterium wspomagana sonikacją (SAAT), której skuteczność jest znacznie wyższa niż sonikacji stosowanej do bezpośredniego przenoszenia nagiego DNA i wektorów DNA do protoplastu. Liczne badania wykazały, że transformacja za pośrednictwem Agrobacterium wspomagana sonikacją (SAAT) może być stosowana do wywoływania mechanicznego naruszenia struktury i powstawania uszkodzeń komórek roślinnych przez fale ultradźwiękowe oraz wynikającą z nich kawitację akustyczną. Krótka obróbka ultradźwiękowa tworzy mikrouszkodzenia na powierzchni eksplantatów. Uszkodzone komórki umożliwiają wnikanie Agrobacterium do głębszych części tkanek roślinnych, zwiększając tym samym prawdopodobieństwo zakażenia komórek roślinnych. Ponadto wydzielane związki fenolowe wspomagają transformację. Mikrouszkodzenia wytworzone ultradźwiękowo ułatwiają również wnikanie bakterii do eksplantatów. SAAT z powodzeniem zastosowano do transformacji genetycznej gatunków roślin uznawanych za szczególnie oporne na Agrobacterium.
Główne zalety SAAT to prostota i niski koszt metody oraz znaczne usprawnienie przenoszenia genów za pośrednictwem Agrobacterium. Oprócz udanego zastosowania SAAT do transformacji Chenopodium rubrum L. i Beta vulgaris L. podejście to wykorzystano również do produkcji w Nicotiana tabacum rekombinowanej termolabilnej holotoksyny Escherichia coli typu dzikiego oraz adiuwantów szczepionkowych opartych na zmutowanej LT Escherichia coli; najwyższe ogólnoustrojowe miana IgG swoistych wobec LT-B wykryto u ptaków.
(por. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka i R. Baranski, 2014)

Ogólna procedura przenoszenia genów do komórek roślinnych poprzez sonoporację

1. Przygotowanie materiału genetycznego: Zacznij od przygotowania materiału genetycznego, który chcesz wprowadzić do komórek roślinnych. Może to być plazmidowe DNA, RNA lub inne kwasy nukleinowe.
2. Izolacja komórek roślinnych: Wyizoluj komórki roślinne, które mają być poddane zabiegowi. W zależności od eksperymentu komórki te mogą być izolowane z tkanek roślinnych lub hodowli.
3. Zawiesina komórek: Zawieś komórki roślinne w odpowiednim podłożu lub buforze. Jest to niezbędne, aby zapewnić zdrowie komórek i ich stan sprzyjający pobieraniu genów.
4. Konfiguracja sonikatora: Przygotuj sonikator z sonotrodą, ustawiając wstępnie parametry sonikacji, takie jak amplituda, czas, energia i temperatura. Zanurz sonotrodę ultradźwiękową w zawiesinie komórek.
5. Sonikacja: Rozpocznij procedurę sonikacji. Szybkie drgania końcówki sonotrody wytwarzają w cieczy pęcherzyki kawitacyjne. Pod wpływem fal ultradźwiękowych pęcherzyki te rozszerzają się i zapadają, wytwarzając siły mechaniczne i mikroprzepływy w zawiesinie.
6. Sonoporacja: Siły mechaniczne i mikroprzepływy wytwarzane przez kawitację tworzą przejściowe pory i otwory w błonach komórek roślinnych. Materiał genetyczny obecny w zawiesinie może przez te pory wnikać do komórek roślinnych.
7. Inkubacja: Po zabiegu sonoporacji inkubuj komórki roślinne, aby umożliwić im regenerację i stabilizację błon. Jest to kluczowy etap zapewniający przeżycie komórek i skuteczne przeniesienie genów.

Przenoszenie genów za pośrednictwem Agrobacterium lub liposomów

Istnieją dwie powszechne metody transfekcji komórek roślinnych. Wykorzystują one jako nośnik materiału genetycznego albo Agrobacterium, rodzaj bakterii Gram-ujemnych, albo liposomy.

• Sonoporacja za pośrednictwem Agrobacterium: Agrobacterium tumefaciens to bakteria powszechnie stosowana w inżynierii genetycznej roślin. W tej metodzie plazmidowe DNA zawierające pożądany gen jest wprowadzane do Agrobacterium, które następnie miesza się z komórkami roślinnymi. Zawiesinę komórek poddaje się sonoporacji z użyciem sonikatora z sonotrodą. Energia ultradźwiękowa usprawnia przenoszenie materiału genetycznego z Agrobacterium do komórek roślinnych. Metoda ta jest szeroko stosowana do modyfikacji genetycznej roślin.
• Sonoporacja za pośrednictwem liposomów: Liposomy to pęcherzyki zbudowane z lipidów, które mogą przenosić materiał genetyczny. W tej metodzie liposomy zawierające plazmidowe DNA lub inne kwasy nukleinowe miesza się z komórkami roślinnymi. Sonoporację z użyciem sonikatora z sonotrodą stosuje się, aby ułatwić pobieranie liposomów przez komórki roślinne. Ultradźwięki naruszają dwuwarstwy lipidowe liposomów, uwalniając materiał genetyczny do komórek roślinnych. Podejście to jest przydatne w badaniach przejściowej ekspresji genów w komórkach roślinnych.

Naukowo potwierdzone korzyści transformacji za pośrednictwem Agrobacterium wspomaganej sonikacją (SAAT)

Transformację za pośrednictwem Agrobacterium wspomaganą sonikacją (SAAT) zastosowano u licznych gatunków roślin. Krótka i stosunkowo łagodna obróbka ultradźwiękowa hodowli komórek roślinnych powoduje sonoporację, która następnie umożliwia głębokie wnikanie Agrobacterium jako nośnika genów. Poniżej można zapoznać się z przykładowymi badaniami wykazującymi korzystne efekty SAAT.

Transformacja ashwagandhy wspomagana ultradźwiękami

Aby poprawić skuteczność transformacji W. somnifera (znanej jako ashwagandha lub wiśnia zimowa), Dehdashti i współpracownicy (2016) zbadali zastosowanie acetosyringonu (AS) i sonikacji.
Acetosyringon (AS) dodawano na trzech etapach: hodowli Agrobacterium w płynnym podłożu, zakażania Agrobacterium i wspólnej hodowli eksplantatów z Agrobacterium. Stwierdzono, że dodanie 75 μM AS do hodowli Agrobacterium w płynnym podłożu było optymalne dla indukcji genów vir.
Dodatkowe zastosowanie sonikacji (SAAT) skutkowało najwyższą ekspresją genów. Stwierdzono, że ekspresja genu gusA w korzeniach włośnikowych była najlepsza, gdy liście i wierzchołki pędów poddawano sonikacji odpowiednio przez 10 i 20s. Skuteczność transformacji przy zastosowaniu ulepszonego protokołu wyniosła odpowiednio 66,5 i 59,5% dla eksplantatów liści i wierzchołków pędów. W porównaniu z innymi protokołami stwierdzono, że skuteczność transformacji przy zastosowaniu tego ulepszonego protokołu była 2,5 razy wyższa dla liści i 3,7 razy większa dla wierzchołków pędów. Analizy metodą Southern blot potwierdziły 1–2 kopie transgenu gusA w liniach W1-W4, natomiast w linii W5 uzyskanej przy zastosowaniu ulepszonego protokołu wykryto 1–4 kopie transgenu.

Wpływ czasu trwania transformacji za pośrednictwem Agrobacterium wspomaganej sonikacją (SAAT) na częstość transformacji eksplantatów liści (a) i wierzchołków pędów (b) W. somnifera
(badanie i grafika: © Dehdashti et al., 2016)

Transformacja bawełny wspomagana ultradźwiękami

Hussain et al. (2007) wykazują korzystne efekty transformacji bawełny wspomaganej sonikacją. Kawitacja akustyczna wywołana ultradźwiękami o niskiej częstotliwości tworzy mikrouszkodzenia na powierzchni i pod powierzchnią tkanki roślinnej (sonoporacja) oraz umożliwia Agrobacterium wnikanie głębiej i przenikanie całej tkanki roślinnej. Ten sposób tworzenia uszkodzeń zwiększa prawdopodobieństwo zakażenia komórek roślinnych położonych głębiej w tkance. Aby ocenić skuteczność transformacji metodą SAAT, zmierzono ekspresję genu GUS. System reporterowy GUS jest systemem genu reporterowego szczególnie przydatnym w biologii molekularnej roślin i mikrobiologii. Dzięki dostosowaniu różnych parametrów SAAT znacznie zwiększono przejściową ekspresję GUS w bawełnie, wykorzystując dojrzałe zarodki jako eksplantaty. GUS wykryto po raz pierwszy po 24h od rozpoczęcia inkubacji eksplantatów, a po 48h ekspresja GUS była bardzo intensywna, co stanowiło przydatny wskaźnik udanej transformacji eksplantatu bawełny po transformacji za pośrednictwem Agrobacterium wspomaganej sonikacją (SAAT). W porównaniu różnych technik transformacji (mianowicie biolistycznej, Agro, BAAT, SAAT) transformacja za pośrednictwem Agrobacterium wspomagana sonikacją (SAAT) dała zdecydowanie najlepsze wyniki transformacji.

Wybór procedury transformacji na podstawie przejściowej ekspresji GUS. Transformacja za pośrednictwem Agrobacterium wspomagana sonikacją (SAAT) wykazuje znacznie wyższą przejściową ekspresję.
(badanie i grafika: © Hussain et al., 2007)

Wysokowydajne rozwiązania ultradźwiękowe do sonoporacji i SAAT

Hielscher Ultrasonics ma wieloletnie doświadczenie w opracowywaniu i produkcji wysokowydajnych sonikatorów do laboratoriów, placówek badawczych oraz produkcji przemysłowej o bardzo dużej wydajności przetwarzania. Na potrzeby mikrobiologii i nauk o życiu Hielscher oferuje różnorodne rozwiązania spełniające odmienne wymagania dotyczące określonych tkanek i ich obróbki. Do jednoczesnej obróbki ultradźwiękowej licznych próbek Hielscher oferuje UIP400MTP do płytek wielodołkowych, VialTweeter do sonikacji do 10 fiolek (np. probówek Eppendorf) lub ultradźwiękowy CupHorn. Sonikatory z sonotrodą mają moc od 50 do 400 watów w przypadku homogenizatorów laboratoryjnych i od 500 watów do 16kW w przypadku systemów przemysłowych.
Skontaktuj się z nami i przedstaw nam swoje zastosowanie oraz wymagania procesowe. Nasz doświadczony personel z przyjemnością poleci sonikator najlepiej dopasowany do Twojego procesu biologicznego.
Poniższa tabela przedstawia orientacyjną wydajność przetwarzania naszych sonikatorów: