Transformacja genetyczna w komórkach roślinnych przy użyciu ultradźwięków

Wspomagana sonikacją transformacja za pośrednictwem Agrobacterium (SAAT) jest skuteczną metodą infekowania komórek roślinnych obcymi genami przy użyciu Agrobacterium jako transportera. Kawitacja ultradźwiękowa powoduje sonoporację, którą można opisać jako ukierunkowane mikro-ranienie tkanki roślinnej. Poprzez te ultradźwiękowe mikro-rany, DNA i wektory DNA mogą być skutecznie transportowane do macierzy komórkowej.

sonoporacja – Transformacja komórek wzmocniona ultradźwiękami

Gdy ultradźwięki o niskiej częstotliwości (ok. 20 kHz) są stosowane do zawiesin komórkowych, efekty kawitacji akustycznej powodują przejściową permeabilizację błony w tkankach komórkowych. Ten efekt ultradźwiękowy jest znany jako sonoporacja i jest wykorzystywany do transferu genów do komórek lub tkanek.
Zalety ultradźwięków opierają się na ich nietermicznej mechanicznej zasadzie działania, co sprawia, że sonikacja jest często bardziej wszechstronna i mniej zależna od typów komórek. Wszechstronne zastosowanie sonoporacji otwiera możliwość wykorzystania roślin transgenicznych, które mają znaczący potencjał w bioprodukcji złożonych ludzkich białek terapeutycznych. Takie bioreaktory roślinne mogą być łatwo manipulowane genetycznie, zapobiegają potencjalnemu zanieczyszczeniu ludzkimi patogenami, nie uszkadzają bakterii pośredniczących w transformacji (np. Agrobacterium) i są niedrogą, skuteczną metodą biosyntezy.

Transformacja komórek wspomagana ultradźwiękami

Sonikacja jest techniką, która stosuje fale ultradźwiękowe o niskiej częstotliwości do mieszania cząstek w roztworze, w celu wymieszania roztworów, zwiększając w ten sposób szybkość przenoszenia masy i rozpuszczania. Jednocześnie sonikacja może usuwać rozpuszczone gazy z cieczy. W przypadku transformacji roślin sonikacja powoduje powstawanie mikrowiązek na tkance roślinnej i zwiększa dostarczanie nagiego DNA do protoplastu rośliny.

W przypadku transformacji genetycznej preferowaną metodą jest transformacja wspomagana sonikacją za pośrednictwem Agrobacterium (SAAT), która ma znacznie wyższą skuteczność niż sonikacja stosowana do przenoszenia nagiego DNA i wektorów DNA bezpośrednio do protoplastu. Liczne badania wykazały, że wspomagana sonikacją transformacja za pośrednictwem Agrobacterium (SAAT) może być stosowana do wywoływania mechanicznego rozerwania i tworzenia ran na komórkach roślinnych przez fale ultradźwiękowe i wynikającą z nich kawitację akustyczną. Krótka obróbka ultradźwiękowa tworzy mikro-rany na powierzchni eksplantatów. Ponieważ zranione komórki pozwolą na penetrację Agrobacterium do głębszych części tkanek roślinnych, zwiększając w ten sposób prawdopodobieństwo zakażenia komórek roślinnych. Dodatkowo, wydzielane związki fenolowe wspomagają transformację. Ultradźwiękowo generowane mikro-rany sprawiają, że penetracja eksplantatu przez bakterie jest również bardziej wykonalna. SAAT został z powodzeniem wykorzystany do transformacji genetycznej gatunków roślin szczególnie uważanych za odporne na Agrobacterium.
Głównymi zaletami SAAT jest bardzo prosta i niedroga metoda, a także znaczne usprawnienie transferu genów za pośrednictwem Agrobacterium. Oprócz udanego zastosowania SAAT w transformacji Chenopodium rubrum L. i Beta vulgaris L., podejście to zostało również zastosowane w produkcji rekombinowanej holotoksyny termolabilnej Escherichia coli typu dzikiego i zmutowanych adiuwantów szczepionkowych Escherichia coli LT w Nicotiana tabacum, w których wykryto najwyższe ogólnoustrojowe miana IgG specyficzne dla LT-B u ptaków.
(por. Laere i in., 2016; M. Klimek-Chodacka i R. Barański, 2014)

Ogólna procedura transferu genów poprzez sonoporację w komórkach roślinnych

1. Przygotowanie materiału genetycznego: Rozpocznij od przygotowania materiału genetycznego, który chcesz wprowadzić do komórek roślinnych. Może to być plazmidowe DNA, RNA lub inne kwasy nukleinowe.
2. Izolacja komórek roślinnych: Wyizoluj komórki roślinne, które chcesz namierzyć. W zależności od eksperymentu, komórki te mogą być izolowane z tkanek lub kultur roślinnych.
3. Zawieszenie komórek: Zawiesić komórki roślinne w odpowiedniej pożywce lub buforze. Jest to niezbędne do zapewnienia, że komórki są zdrowe i w stanie sprzyjającym absorpcji genów.
4. Konfiguracja urządzenia Sonicator: Przygotować sonikator z sondą poprzez wstępne ustawienie parametrów sonikacji, takich jak amplituda, czas, energia i temperatura. Zanurzyć sondę ultradźwiękową w zawiesinie komórek.
5. Sonikacja: Rozpocząć procedurę sonikacji. Szybkie oscylacje końcówki sondy generują pęcherzyki kawitacyjne w cieczy. Pęcherzyki te rozszerzają się i zapadają z powodu fal ultradźwiękowych, tworząc siły mechaniczne i mikrostrumieniowanie w zawiesinie.
6. Sonoporacja: Siły mechaniczne i mikrostrumienie generowane przez kawitację tworzą tymczasowe pory i otwory w błonach komórek roślinnych. Materiał genetyczny obecny w zawiesinie może dostać się do komórek roślinnych przez te pory.
7. Inkubacja: Po zabiegu sonoporacji należy inkubować komórki roślinne, aby umożliwić im regenerację i stabilizację błon. Jest to kluczowy krok zapewniający przetrwanie komórek i udany transfer genów.

Transfer genów za pośrednictwem Agrobacterium lub liposomów

Istnieją dwie powszechne formy transfekcji komórek roślinnych. Wykorzystują one albo agrobacterium, rodzaj bakterii Gram-ujemnych, albo liposomy jako nośnik materiału genetycznego.

• Sonoporacja za pośrednictwem Agrobacterium: Agrobacterium tumefaciens to bakteria powszechnie stosowana w inżynierii genetycznej roślin. W tej metodzie plazmidowe DNA zawierające pożądany gen jest wprowadzane do Agrobacterium, które jest następnie mieszane z komórkami roślinnymi. Zawiesina komórek jest poddawana sonoporacji przy użyciu sonikatora. Energia ultradźwiękowa zwiększa transfer materiału genetycznego z Agrobacterium do komórek roślinnych. Metoda ta jest szeroko stosowana do genetycznej modyfikacji roślin.
• Sonoporacja za pośrednictwem liposomów: Liposomy to pęcherzyki na bazie lipidów, które mogą przenosić materiał genetyczny. W tej metodzie liposomy wypełnione plazmidowym DNA lub innymi kwasami nukleinowymi są mieszane z komórkami roślinnymi. Aby ułatwić wchłanianie liposomów przez komórki roślinne, stosuje się sonoporację przy użyciu sonikatora. Ultradźwięki rozbijają dwuwarstwy lipidowe liposomów, uwalniając materiał genetyczny do komórek roślinnych. Podejście to jest przydatne w badaniach przejściowej ekspresji genów w komórkach roślinnych.

Naukowo udowodnione korzyści płynące z transformacji wspomaganej sonikacją agrobakterii (SAAT)

Transformacja wspomagana sonikacją (SAAT) została zastosowana do wielu gatunków roślin. Krótka i stosunkowo łagodna obróbka ultradźwiękowa kultur komórek roślinnych powoduje sonoporację, która następnie umożliwia głęboką penetrację Agrobacterium jako transportera genów. Poniżej można zapoznać się z przykładowymi badaniami demonstrującymi korzystne efekty SAAT.

Wspomagana ultradźwiękami transformacja Ashwagandhy

W celu poprawy wydajności transformacji W. somnifera (znanej jako ashwagandha lub wiśnia zimowa), Dehdashti i współpracownicy (2016) zbadali zastosowanie acetosyringonu (AS) i sonikacji.
Acetosyringon (AS) dodawano w trzech etapach: Płynna hodowla Agrobacterium, infekcja Agrobacterium i współhodowla eksplantatów z Agrobacterium. Stwierdzono, że dodanie 75 μM AS do płynnej kultury Agrobacterium jest optymalne dla indukcji genów wirusa.
Dodatkowe zastosowanie sonikacji (SAAT) spowodowało najwyższą ekspresję genów. Ekspresja genu gusA we włochatych korzeniach była najlepsza, gdy liście i wierzchołki pędów poddawano sonikacji odpowiednio przez 10 i 20 sekund. Wydajność transformacji w ulepszonym protokole odnotowano odpowiednio 66,5 i 59,5% w przypadku eksplantatów liści i wierzchołków pędów. W porównaniu z innymi protokołami, wydajność transformacji tego ulepszonego protokołu okazała się 2,5-krotnie wyższa w przypadku liści i 3,7-krotnie wyższa w przypadku wierzchołków pędów. Analizy Southern blot potwierdziły 1-2 kopie transgenu gusA w liniach W1-W4, podczas gdy 1-4 kopie transgenu wykryto w linii W5 wygenerowanej przez ulepszony protokół.

Wpływ czasu trwania transformacji wspomaganej sonikacją Agrobacterium (SAAT) na częstotliwość transformacji eksplantatów liści W. somnifera (a) i wierzchołków pędów (b)
(badanie i grafika: © Dehdashti et al., 2016)

Transformacja bawełny wspomagana ultradźwiękami

Hussain et al. (2007) demonstrują korzystne efekty transformacji bawełny wspomaganej sonikacją. Kawitacja akustyczna spowodowana ultradźwiękami o niskiej częstotliwości tworzy mikro-rany na i pod powierzchnią tkanki roślinnej (sonoporacja) i pozwala Agrobacterium na głębsze i całkowite przemieszczanie się w tkance roślinnej. Ten sposób zranienia zwiększa prawdopodobieństwo zainfekowania komórek roślinnych leżących głębiej w tkance. W celu oceny skuteczności transformacji SAAT zmierzono ekspresję genu GUS. System reporterowy GUS jest systemem genów reporterowych, szczególnie przydatnym w biologii molekularnej roślin i mikrobiologii. Dostosowując różne parametry SAAT, ekspresja przejściowa GUS w bawełnie przy użyciu dojrzałych zarodków jako eksplantatów została znacznie zwiększona. GUS został wykryty po raz pierwszy 24 godziny po inkubacji eksplantatów, a po 48 godzinach ekspresja GUS była bardzo intensywna, co służyło jako użyteczny wskaźnik udanej transformacji eksplantatu bawełny po transformacji wspomaganej sonikacją Agrobacterium (SAAT). Porównanie różnych technik transformacji (mianowicie biolistycznej, Agro, BAAT, SAAT), transformacji wspomaganej sonikacją Agrobacterium (SAAT) wykazało zdecydowanie najlepsze wyniki transformacji.

Wybór procedury transformacji na podstawie przejściowej ekspresji GUS. Transformacja za pośrednictwem Agrobacterium wspomagana sonikacją (SAAT) wykazuje znacznie wyższą przejściową ekspresję.
(badanie i grafika: © Hussain et al., 2007)

Wysokowydajne rozwiązania ultradźwiękowe do sonoporacji i SAAT

Firma Hielscher Ultrasonics posiada wieloletnie doświadczenie w opracowywaniu i produkcji wysokowydajnych ultrasonografów dla laboratoriów, placówek badawczych, a także produkcji przemysłowej o bardzo dużej przepustowości. Dla mikrobiologii i nauk przyrodniczych, Hielscher oferuje różne rozwiązania, aby spełnić różne wymagania niezbędne dla określonych tkanek i ich leczenia. Do jednoczesnej ultrasonizacji wielu próbek Hielscher oferuje UIP400MTP do płytek wielodołkowych, VialTweeter do sonikacji do 10 fiolek (np. probówek Eppendorf) lub ultradźwiękowy CupHorn. Ultradźwięki typu sondowego są dostępne od 50 do 400 watów jako homogenizatory laboratoryjne, podczas gdy systemy przemysłowe obejmują zakres mocy od 500 watów do 16 kW.
Skontaktuj się z nami i daj nam znać o swojej aplikacji i wymaganiach procesowych. Nasz doświadczony personel z przyjemnością poleci najbardziej odpowiedni ultrasonicator do procesu biologicznego.
Poniższa tabela przedstawia przybliżoną wydajność przetwarzania naszych ultradźwiękowców: