Protokoll benotzt Hielscher Multi-Sample Sonicators a Biofilm a Proteomesch Analyse

D'Benotzung vu Multi-Sample Sonicatoren, wéi de VialTweeter Multi-Tube Sonicator an den UIP400MTP Microplate Sonicator, streamlines Laboratoire Workflows fir High-Throughput Uwendungen. Béid Apparater erlaben präzis an eenheetlech Ultraschallveraarbechtung iwwer verschidde Proben, d'Verännerlechkeet ze minimiséieren an d'Reproduzibilitéit ze verbesseren. Dëst ass besonnesch avantagéis an Experimenter déi konsequent Probe-Lysis, Biofilm-Entloossung, Proteinextraktioun oder proteolytesch Verdauung erfuerderen, wou manuell oder Single-Probe Methoden manner effizient sinn an ufälleg fir Inkonsistenz.

Streamline Workflows mat Multi-Sample Sonicators

D'UIP400MTP, zum Beispill, erméiglecht eng simultan Ultraschallbehandlung vu Mikroplattewellen, fir eenheetlech Oflehnung vu Biofilmen oder Zellmaterial ze garantéieren. Mëttlerweil bitt de VialTweeter präzis Lysis an Homogeniséierung vu multiple Rouerproben ouni Kräizkontaminatioun. Dës Sonicatoren reduzéieren d'Veraarbechtungszäiten wesentlech, verbesseren d'experimentell Reproduzibilitéit an halen eng héich Probeintegritéit, sou datt se onverzichtbar Tools an der Mikrobiologie, Proteomik a Molekularebiologiefuerschung maachen.
Drënner ass en detailléierte Protokoll, deen d'Benotzung vun den Hielscher Multi-Sample Sonicator Modeller, de VialTweeter Multi-Tube Sonicator an de Microplate Sonicator UIP400MTP, an enger Studie mat der E. coli Biofilmbildung a spéider proteomescher Analyse involvéiert.

Protokoll: Biofilmbildung, Detachement a Proteomesch Analyse mat Hielscher Multi-Sample Sonicators

1. Bakteriell Kultur Virbereedung

• Kultur E. coli Bakterien (Stamm W3110) bei 30 ° C, eng Temperatur favorabel fir E. coli Biofilm Bildung, an Trypton Bouillon (TB) Medium mat:
  – 10 g/l Trypton
  – 5 g/l NaCl
• Ergänzung mat Antibiotike wéi néideg fir Plasmid Retention ze garantéieren.
• Fir Mikroskopie a Promoteur Aktivitéit Studien, benotzt de W3110 E. coli Stamm mat engem genomesche verstäerkte GFP (eGFP) Reporter ënner der Kontroll vum rplL Promoteur.
• Benotzt GFP Reporter Plasmide fir verschidde Promoteuren (zB, csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) Promoteur Aktivitéiten ze moossen.

2. Biofilm Kultivatioun an Détachement

• Seed 1,5 ml vun verdënntem Bakterienkultur pro gutt an eng 12-Well Plack (CellStar 12-Well Placke, Greiner Bio-One).
• Inkubéiert fir d'Bildung vu Biofilm z'erméiglechen.
• Ewechzehuelen der planktonescher (net adherent) Kultur virsiichteg.

– Wash all gutt mat 500 µL PBS.
– Trennt befestegt Zellen andeems Dir d'12-Well Plack am UIP400MTP Mikroplate-Sonicator sonikéiert. D'UIP400MTP suergt fir eng eenheetlech Detachement andeems se konsequent Ultraschallenergie iwwer all Brunnen liwweren.
– Sonication Astellunge: 60% Amplitude, Zyklus Modus: 60 sec ON / 30 sec OFF.

3. Zell Recolte an Lysis

• Zentrifuge ofgebaute Biofilmzellen bei 4.500 g fir 5 Minutten.
• Wäsch pelletéiert Zellen mat PBS.
• Resuspendéiert Zellen an 100 μL 2% Natriumlauroylsarcosinat (SLS) a inkubéiert bei 95 ° C fir 15 Minutten.
• Sonicate mat dem VialTweeter Multi-Tube Sonicator fir eng komplett Zelllyse ze garantéieren.
  – Sonication Astellungen: 100% Amplitude, 50 s ON / 10 s OFF fir 10 min Gesamtlaufzäit; halen Echantillon op Äis.

4. Reduktioun an Alkylatioun

• Füügt 5 mM Tris (2-Carboxyethyl) Phosphin (TCEP) fir Disulfidbindungen ze reduzéieren a bei 95 ° C fir 15 Minutten inkubéieren.
• Alkylat Proteine mat 10 mM Jodacetamid fir 30 Minutten bei 25 ° C.

5. Protein Quantifikatioun a Verdauung

• Zentrifuge Lysate fir Dreck ze läschen.
• Quantifizéiert Gesamtproteingehalt mam Pierce BCA Protein Assay Kit.
• Verdauen 50 µg Gesamtprotein mat 1 µg Trypsin an enger Léisung mat 2% SLS an 100 mM Ammoniumbikarbonat.
• Inkubéiert Verdauungsreaktioun iwwer Nuecht bei 30 ° C.

6. Peptid Purification

• Ausfällt SLS andeems Dir 1,5% Trifluoresdiksäure (TFA) bäidréit, dann centrifugéiert.
• Purifizéiert Peptiden mat C18 Mikrospin Sailen.
• Dréchent gereinegt Peptiden a resuspendéiert an 0,1% TFA.

7. Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS/MS)

• Analyséiert Peptiden op engem Q-Exactive Plus Massespektrometer gekoppelt mat engem Ultimate 3000 RSLC Nano System.
• Separéiert Peptiden mat enger ëmgedréint-Phase HPLC Kolonn (75 µm × 42 cm) gepackt mat C18 Harz (2,4 µm).
• Fëllt e Gradient vun 2% bis 35% Léisungsmëttel B (Acetonitril mat 0,15% Mieresäure) iwwer 140 Minutten.
• Kaaft Daten mat héijer Opléisung MS Scans gefollegt vun Tandem MS / MS Scans vun den 10 intensivsten Ionen.

8. Donnéeën Analyse

• Veraarbecht rau LC-MS Daten mat Progenesis Software.
• Export .mgf Dateien an analyséiert se mat MASCOT.
• Maacht Peptidquantifikatioun mat SafeQuant fir Qualitéitskontroll a falsch Entdeckung Upassung.
• Féiert all Experimenter an Duplikaten oder Triplikaten fir d'Reproduktioun ze garantéieren.

Multi-Sample Sonicators fir High-Throughput Sample Virbereedung

D'Multi-Sample Sonicator Modeller VialTweeter an UIP400MTP verbesseren d'Präzisioun an d'Effizienz vun experimentellen Workflows wesentlech an der Biofilmfuerschung a Proteomik. Hir Fäegkeet fir verschidde Proben eenheetlech ze verarbeiten suergt fir High-Throughput Kapazitéit ouni d'Datequalitéit ze kompromittéieren. Dës Virdeeler, kombinéiert mat de streamlined Workflows uewe beschriwwen, maachen Hielscher Multi-Sample Sonicators wesentlech Tools fir modern biologesch Fuerschung.

Design, Fabrikatioun a Berodung – Qualitéit Made in Germany

Hielscher Ultraschaller si bekannt fir hir héchst Qualitéit an Designnormen. Robustheet an einfach Operatioun erlaben déi glat Integratioun vun eisen Ultraschaller an industriellen Ariichtungen. Rau Konditiounen an erfuerderlech Ëmfeld ginn einfach vun Hielscher Ultraschaller gehandhabt.

Hielscher Ultrasonics ass eng ISO zertifizéiert Firma a setzt spezielle Wäert op High-Performance Ultrasonicatoren mat modernste Technologie a Benotzerfrëndlechkeet. Natierlech sinn Hielscher Ultraschaller CE konform an entspriechen d'Ufuerderunge vun UL, CSA a RoHs.