Protokoll fir den Asaz vun Hielscher Multi-Sample Sonicators an der Biofilm- a Proteomanalys

Den Asaz vun Ultraschallapparater fir méi Prouwen, wéi dem VialTweeter Multi-Tube Sonicator an dem UIP400MTP Microplate Sonicator, vereinfacht d’Aarbechtsofleef am Laboratoire fir Uwendunge mat héijem Prouwenduerchsaz. Béid Apparater erméiglechen eng präzis a gläichméisseg Ultraschallbehandlung vu méi Prouwen, reduzéieren d’Variabilitéit op e Minimum a verbesseren d’Reproduzéierbarkeet. Dëst ass besonnesch avantagéis bei Experimenter, déi eng eenheetlech Prouwelysis, Biofilmofléisung, Proteinextraktioun oder proteolytesch Verdauung erfuerderen, bei deene manuell Methoden oder Methode fir eenzel Prouwe manner effizient an ufälleg fir Onreegelméissegkeete sinn.

Vereinfacht Aarbechtsofleef mat Ultraschallapparater fir méi Prouwen

Den UIP400MTP erméiglecht zum Beispill déi gläichzäiteg Ultraschallbehandlung vun de Vertiefunge vu Mikroplacken a garantéiert dobäi eng gläichméisseg Ofléisung vu Biofilmer oder Zellmaterial. De VialTweeter bitt iwwerdeems eng präzis Lysis an Homogeniséierung vu méi Prouwen a Réiercher ouni Kräizkontaminatioun. Dës Ultraschallapparater verkierzen d’Veraarbechtungszäite wesentlech, verbesseren d’Reproduzéierbarkeet vun den Experimenter an erhalen eng héich Integritéit vun de Prouwen. Doduerch si se onverzichtbar Instrumenter fir d’Fuerschung an der Mikrobiologie, Proteomik a Molekularbiologie.
Hei drënner steet en detailléierte Protokoll, deen den Asaz vun den Hielscher Ultraschallapparater fir méi Prouwen, dem VialTweeter Multi-Tube Sonicator an dem Microplate Sonicator UIP400MTP, an enger Etüd iwwer d’Biofilmbildung vun E. coli an déi uschléissend Proteomanalys exemplaresch weist.

Protokoll: Biofilmbildung, Ofléisung a Proteomanalys mat Hielscher Ultraschallapparater fir méi Prouwen

1. Virbereedung vun der Bakteriekultur

• Kultivéiert E. coli-Bakterien (Stamm W3110) bei 30°C, enger Temperatur, déi fir d’Biofilmbildung vun E. coli gënschteg ass, an engem Tryptonbouillonmedium (TB) mat:
  – 10 g/L Trypton
  – 5 g/L NaCl
• Gitt no Bedarf Antibioticken derbäi, fir den Erhalt vun de Plasmiden ze garantéieren.
• Benotzt fir Mikroskopie an Ënnersichunge vun der Promotoraktivitéit den E. coli-Stamm W3110 mat engem genomeschen enhanced GFP-Reporter (eGFP) ënner der Kontroll vum rplL-Promotor.
• Benotzt GFP-Reporterplasmide fir verschidde Promotoren (z. B., csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ), fir d’Promotoraktivitéiten ze moossen.

2. Kultivéierung an Ofléisung vum Biofilm

• Gitt pro Vertiefung 1,5 mL verdënnte Bakteriekultur an eng Plack mat 12 Vertiefungen (CellStar-Placke mat 12 Vertiefungen, Greiner Bio-One).
• Inkubéiert, fir d’Bildung vun engem Biofilm ze erméiglechen.
• Huelt déi planktonesch (net uhaftend) Kultur virsiichteg ewech.

– Wäscht all Vertiefung mat 500 µL PBS.
– Léist déi uhaftend Zellen of, andeems Dir d’Plack mat 12 Vertiefungen am UIP400MTP Mikroplacken-Ultraschallapparat mat Ultraschall behandelt. Den UIP400MTP garantéiert eng gläichméisseg Ofléisung, andeems en an all Vertiefung déiselwecht Ultraschallenergie aleet.
– Ultraschallastellungen: 60% Amplitud, Zyklusmodus: 60 sec UN / 30 sec AUS.

3. Ernte vun den Zellen a Lysis

• Zentrifugéiert déi ofgeléiste Biofilmzelle bei 4.500 g fir 5 Minutten.
• Wäscht déi als Pellet ofgesaten Zelle mat PBS.
• Resuspendéiert d’Zellen an 100 µL 2% Natriumlauroylsarcosinat (SLS) an inkubéiert se bei 95°C fir 15 Minutten.
• Behandelt d’Prouwe mam VialTweeter Multi-Tube Sonicator mat Ultraschall, fir eng komplett Zelllysis ze garantéieren.
  – Ultraschallastellungen: 100% Amplitud, 50 s UN / 10 s AUS bei enger gesamter Lafzäit vun 10 min; haalt d’Prouwen op Äis.

4. Reduktioun an Alkyléierung

• Gitt 5 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) derbäi, fir Disulfidbindungen ze reduzéieren, an inkubéiert bei 95°C fir 15 Minutten.
• Alkyléiert d’Proteinne mat 10 mM Iodacetamid fir 30 Minutte bei 25°C.

5. Proteinquantifizéierung a Verdauung

• Zentrifugéiert d’Lysater, fir Zellreschter ze entfernen.
• Quantifizéiert de Gesamtproteingehalt mam Pierce BCA Protein Assay Kit.
• Verdaut 50 µg Gesamtprotein mat 1 µg Trypsin an enger Léisung, déi 2% SLS an 100 mM Ammoniumhydrogencarbonat enthält.
• Inkubéiert de Verdauungsusaz iwwer Nuecht bei 30°C.

6. Peptidrengegung

• Fällt SLS duerch d’Zousaz vun 1,5% Trifluoressigsäure (TFA) aus an zentrifugéiert duerno.
• Rengegt d’Peptide mat C18-Mikrospin-Sailen.
• Dréchent déi gerengegt Peptiden a resuspendéiert se an 0,1% TFA.

7. Flëssegchromatographie-Massespektrometrie (LC-MS/MS)

• Analyséiert d’Peptiden op engem Q-Exactive Plus-Massespektrometer, dee mat engem Ultimate 3000 RSLC nano-System gekoppelt ass.
• Trennt d’Peptide mat enger Ëmkéierphas-HPLC-Sail (75 µm × 42 cm), déi mat C18-Harz (2,4 µm) gefëllt ass.
• Benotzt iwwer 140 Minutten e Gradient vun 2% bis 35% Léisungsmëttel B (Acetonitril mat 0,15% Seechomessigsäure).
• Erfaasst d’Date mat héichopléisende MS-Scannen, gefollegt vun Tandem-MS/MS-Scanne vun den 10 Ione mat der héchster Intensitéit.

8. Datenanalys

• Veraarbecht d’LC-MS-Réidate mat der Progenesis-Software.
• Exportéiert .mgf-Dateien an analyséiert se mat MASCOT.
• Féiert d’Peptidquantifizéierung mat SafeQuant duerch, fir d’Qualitéitskontroll an d’Korrektur vu falsch positiven Identifikatiounen ze maachen.
• Féiert all Experimenter an duebeler oder dräifacher Ausféierung duerch, fir d’Reproduzéierbarkeet ze garantéieren.

Ultraschallapparater fir méi Prouwe fir d’Prouwevirbereedung mat héijem Prouwenduerchsaz

D’Ultraschallapparater fir méi Prouwen, d’Modeller VialTweeter an UIP400MTP, verbesseren d’Präzisioun an d’Effizienz vun experimentellen Aarbechtsofleef wesentlech, besonnesch an der Biofilmfuerschung an der Proteomik. Hir Fäegkeet, méi Prouwe gläichméisseg ze behandelen, garantéiert eng héich Prouwenduerchsazkapazitéit, ouni d’Datequalitéit ze beanträchtegen. Dës Virdeeler, zesumme mat de vereinfachten Aarbechtsofleef, déi hei uewen duergestallt sinn, maachen d’Hielscher Ultraschallapparater fir méi Prouwen zu wesentlechen Instrumenter fir déi modern biologesch Fuerschung.

Design, Fabrikatioun a Berodung – Qualitéit Made in Germany

Hielscher Ultraschallapparater si fir hir héchst Qualitéits- an Designstandarde bekannt. Robustheet an einfach Bedéngung erméiglechen eng reiwungslos Integratioun vun eisen Ultraschallapparater an industriell Anlagen. Hielscher Ultraschallapparater meeschtere rau Bedéngungen an usprochsvoll Ëmfelder ouni Schwieregkeeten.

Hielscher Ultrasonics ass en ISO-zertifizéiert Betrib a leet besonnesche Wäert op héichleeschtungsfäeg Ultraschallapparater mat Technologie um neiste Stand a Benotzerfrëndlechkeet. Selbstverständlech sinn Hielscher Ultraschallapparater CE-konform an erfëllen d’Ufuerderunge vun UL, CSA a RoHs.