Hielscher Ultrasonics
Mir wäerte frou Äre Prozess ze diskutéieren.
Rufft eis un: +49 3328 437-420
Mail eis: [email protected]

Deparaffiniséierung a Protein Extraktioun aus FFPE

Erliichtert d'Proteinextraktioun aus formalin-fixéierte Paraffin-embedded (FFPE) Tissue Sektiounen mat enger optimiséierter Kombinatioun vun Deparaffiniséierung, Solubiliséierung a Sonikatioun mat engem VialTweeter Multi-Tube Ultrasonicator. Dëse Protokoll ënnerstëtzt Downstream Massespektrometrie-baséiert Proteomik an ass kompatibel mat SP3 Cleanup an enzymatesch Verdauungsworkflows.

Dëse SOP ass geduecht fir Laborpersonal involvéiert an der proteomescher Analyse vu FFPE Tissue-Exemplare mat High-Performance-Sonicatioun. Et ass optimiséiert fir bis zu zéng FFPE Echantillon parallel veraarbecht mam VialTweeter Multi-Tube Sonicator.

Informatiounen Ufro



VialTweeter am Ultraschallprozessor UP200ST

VialTweeter sonicator fir déi simultan Sonikatioun vun 10 Proben, zB fir Lysis a Proteinextraktioun aus FFPE Proben

Protokoll: Protein Extraktioun aus FFPE Echantillon mam VialTweeter

Material a Reagenz

reagents

  • Xylene (Histologiegrad)
  • Ethanol (absolut 96%)
  • Lysisbuffer:

    • 6 M Guanidinhydrochlorid
    50 mM Tris-HCl, pH 8,5
    10 mM TCEP (Tris(2-Carboxyethyl)phosphin)
    40 mM CAA (2-Chloracetamid)

  • Protease-Inhibitor (optional; zB cOmplete™ mini EDTA-gratis)

 
 

Equipement

  • VialTweeter Multi-Tube Ultrasonicator
  • 1,5 ml oder 2,0 ml niddereg-bindend Mikrocentrifuge Tubes
  • Hëtzt Block oder Inkubator (95 ° C an 80 ° C Astellungen)
  • Mikrocentrifuge
  • Thermomixer (optional awer recommandéiert)

Sample Input

  • 1-2 Sektiounen vun 10 µm décke FFPE Tissue pro Probe (dh pro Fläsch)

    • oder

  • Insgesamt ~100 µg Tissue pro Probe (dh pro Fläsch)

Bemierkung: Benotzt frësch Blades fir Mikrotomie fir Paraffinschuttkontaminatioun ze minimiséieren.

Prozedur

  1. deparaffinization
    1. Transfert FFPE Sektiounen an niddereg-bindende Mikrocentrifuge-Réier.
    2. Füügt 1 ml Xylen, vortex kuerz.
    3. Inkubéiert 10 Minutten bei Raumtemperatur.
    4. Zentrifuge bei 14.000 × g fir 2 Minutten; Supernatant entwerfen.
    5. Widderhuelen d'Xylenwäsch nach eng Kéier (Schrëtt 2-4).
    6. Wäscht Pellet mat 1 ml 96% Ethanol, vortex, centrifugéiert dann bei 14.000 × g fir 2 Minutten. Supernatant ofleeën.
    7. Widderhuelen d'Ethanolwäsch nach eng Kéier (total 2 Ethanolwäschen).
    8. Loftdrock Pellet fir 10 Minutten bei Raumtemperatur mat oppenen Deckele fir de Rescht Ethanol ze verdampen.
  2. Protein Extraktioun a Sonication
    1. Füügt 200 μL Lysisbuffer op all dréchene Pellet.
      Bemierkung: Och wann de Sonicator bis zu 1 ml empfänkt, ass 200 µL optimal fir Downstream Veraarbechtung.

    2. Mix duerch Wirbelen oder sanft Pipetten.
  3. Éischt thermesch Inkubatioun
    1. Inkubéiert d'Tuber bei 95 ° C fir 30 min, mat Agitatioun bei 400 rpm mat engem Thermomixer oder Hëtztblock.
    2. Loosst d'Proben bei Raumtemperatur fir 5 min ofkillen.
  4. Éischt Sonication mam VialTweeter
    1. Setzt d'Réier an de VialTweeter.
    2. Setzt de VialTweeter UP200St op d'Wäerter hei drënner a sonicate.
    5. Sonicator Astellungen
    • Setzt d'Amplitude (A) op 100%
    • Setzt de Pulsatiounsmodus (C) op 100%
    • Period Auer: Op
    • Op Zäit: 60s
    • Off Time: 30s
    • Limitwert: 15 min (entsprécht 10 Zyklen)
    (Berechnung Notiz: (60 s On + 30 s Off) × 10 Zyklen = 900 s = 15 min)
  5. Zweet thermesch Inkubatioun
    Ewechzehuelen d'Tube a inkubéieren erëm bei 95 ° C fir 15 min, 400 rpm.
  6. Zweet Sonication
    Widderhuelen d'Sonication op VialTweeter mat de selwechten Astellungen (wéi uewen) fir eng zousätzlech 10 Zyklen (15 min am Ganzen).
  7. Klärung vum Lysat
    1. Zentrifuge d'Proben bei 13.000 × g fir 10 min bei 23 ° C (Raumtemperatur).
    2. Sammelt den Supernatant virsiichteg an en neit 2,0 ml Safe-lock Eppendorf Tube. Vermeiden de Pellet ze stéieren.
  8. Downstream Veraarbechtung
    D'Lysat ass elo prett fir SP3 Botzen an enzymatesch Verdauung.

 

De VialTweeter ass en eenzegaartegt Ultraschallsystem fir déi gläichzäiteg Sonikatioun vu bis zu 10 Fläschen ënner genau deeselwechte Bedéngungen ouni Kräizkontaminatioun.

UP200St mat VialTweeter fir Sonication vun zougemaach Vials

Video Thumbnail

 

VialTweeter mat 2.0mL Eppendorf Tube fir zouverlässeg Probepräparatioun ënner sterile Konditiounen

Hielscher VialTweeter mat 10 Eppenduerf Réier

Informatiounen Ufro



Notizen a Best Practices

  1. Iwwerhëtzungsrisiko wärend der Sonikatioun gëtt reduzéiert duerch programméiert ON / OFF Cycling.
  2. Vermeit vortexing Post-Sonication fir Proteinaggregatioun ze vermeiden.

Offall Entsuergung a Sécherheet

  • Xylen a Guanidin Hydrochlorid si geféierlech Chemikalien; handhaben ënner engem Dampkapp.
  • Entsuergt all Léisungsmëttel a biologescht Offall pro institutionell Biosécherheet a chemesch Hygiène Protokoller.

    •  
     

    D'Tabell hei drënner gëtt Iech eng Indikatioun vun der geschätzter Veraarbechtungskapazitéit vun eise Labo-Gréisst Ultraschaller:

    Recommandéiert Apparater Batch Volume Duerchflossrate
    UIP400MTP 96-Well Plate Sonicator Multi-Well / Mikrotiter Placke na
    Ultraschall CupHorn CupHorn fir Fläschen oder Becher na
    GDmini 2 Ultraschall Mikro-Flow Reaktor na
    VialTweeter 0,5 bis 1,5 ml na
    UP100H 1 bis 500 ml 10 bis 200 ml/min
    UP200Ht, UP 200 St 10 bis 1000 ml 20 bis 200 ml/min
    UP 400 St 10 bis 2000 ml 20 bis 400 ml/min
    Ultrasonic Sieve Shaker na na

    Frot méi Informatiounen

    Benotzt w.e.g. de Formulaire hei ënnen fir zousätzlech Informatioun iwwer Ultraschallprozessoren, Uwendungen a Präis ze froen. Mir freeën eis Äre Prozess mat Iech ze diskutéieren an Iech en Ultraschallsystem ze bidden deen Är Ufuerderungen entsprécht!




    Ultrasonic High-Shear Homogenisatoren ginn am Labo, Bench-Top, Pilot an Industrieveraarbechtung benotzt.

    Hielscher Ultrasonics fabrizéiert High-Performance Ultrasonic Homogenisatoren fir d'Vermëschung vun Uwendungen, Dispersioun, Emulsifikatioun an Extraktioun op Labo, Pilot an Industrieskala.

    Zesummenhang Themen

    Literatur / Referenzen

    Oft gestallten Froen

    Firwat sinn Tissue Echantillon als FFPE fixéiert?

    Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) Konservatioun stabiliséiert Tissuemorphologie a Proteinstrukturen andeems kovalent Kräizverbindunge iwwer Formaldehyd bilden. Embedding am Paraffin erméiglecht laangfristeg Lagerung bei Raumtemperatur wärend histologesch a molekulare Integritéit fir retrospektiv Analysen behalen.

    Wéi deparaffinéieren ech FFPE Echantillon?

    Deparaffiniséierung beinhalt sequentiell Léisungsmëttelwäschen fir Paraffin ze entfernen: typesch zwou Inkubatioune mat Xylen, gefollegt vun zwee Wäschen mat Ethanol (96%). No der Zentrifugéierung an der Trocknung ass den Tissu prett fir downstream Extraktioun. Dëse Prozess restauréiert Probe Accessibilitéit fir Lysis an enzymatesch Verdauung.

    Wat ass den Zweck vun der thermescher Inkubatioun?

    Thermesch Inkubatioun bezitt sech op déi kontrolléiert Belaaschtung vun enger Probe fir eng definéiert Temperatur fir eng spezifesch Zäit fir biochemesch oder kierperlech Verännerungen ze induzéieren. An der Proteomik gëtt et allgemeng benotzt fir Proteinen ze denaturéieren, Formaldehyd-Kräizverbindungen an FFPE Stoffer ëmgedréint oder d'Lyse-Puffer Effizienz ze verbesseren. D'Temperatur an d'Dauer si kritesch Parameteren, ugepasst op d'Zilreaktioun oder d'Probetyp.

    Wat ass SP3 Verdauung?

    Single-Pot Solid-Phase-enhanced Sample Preparation (SP3) ass e Bead-baséiert Proteomics Workflow. Et benotzt paramagnetesch Perlen fir Proteinen ze binden, wat effizient Botzen, Konzentratioun an enzymatesch Verdauung ënner denaturéierende Bedéngungen erméiglecht. SP3 miniméiert Probeverloscht an ass héich kompatibel mat Low-Input an FFPE Echantillon.

    Héich performant Ultraschall! D'Hielscher Produktpalette befaasst de ganze Spektrum vum kompakten Labo Ultraschall iwwer Bench-Top Eenheeten bis voll industriell Ultraschallsystemer.

    Hielscher Ultrasonics fabrizéiert High-Performance Ultrasonic Homogenisatoren aus Labo zu industriell Gréisst.

    Mir wäerte frou Äre Prozess ze diskutéieren.

    ✕