Deparaffinéierung a Proteinextraktioun aus FFPE

Erliichtert d’Proteinextraktioun aus formalinfixéierten, a Paraffin agebetteten (FFPE) Tissusschnëtter mat enger optiméierter Kombinatioun aus Deparaffinéierung, Solubiliséierung an Ultraschallbehandlung mat engem VialTweeter Ultraschallapparat fir méi Prouweréier. Dëse Protokoll ënnerstëtzt déi uschléissend massenspektrometriebaséiert Proteomik an ass mat Aarbechtsofleef fir d’SP3-Rengegung an den enzymateschen Ofbau kompatibel.

Dës Standardaarbechtsuweisung (SOP) riicht sech u Laborpersonal, dat FFPE-Tissusprouwe mat héichleeschtungsfäeger Ultraschallbehandlung proteomesch analyséiert. Si ass fir bis zu zéng FFPE-Prouwen optiméiert, déi mam VialTweeter Multi-Tube Sonicator parallel verschafft ginn.

Protokoll: Proteinextraktioun aus FFPE-Prouwe mam VialTweeter

Materialien a Reagenzien

Reagenzien

• Xylol (Qualitéit fir d’Histologie)
• Ethanol (absolut 96%)
• Lysepuffer:

6 M Guanidinhydrochlorid
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphin)
40 mM CAA (2-Chloracetamid)

• Proteaseinhibitor (optional; z. B. cOmplete™ mini EDTA-free)

Ausrëschtung

• VialTweeter Multi-Tube Ultrasonicator
• Mikrozentrifugeréier vun 1,5 mL oder 2,0 mL mat gerénger Bindungskapazitéit
• Heizblock oder Inkubator (Astellunge fir 95°C an 80°C)
• Mikrozentrifug
• Thermomixer (optional, awer recommandéiert)

Asazquantitéit vun de Prouwen

• 1–2 Schnëtter vun 10 µm déckem FFPE-Tissu pro Prouf (d. h. pro Prouweréier)

ODER

• Am Ganzen ~100 µg Tissu pro Prouf (d. h. pro Prouweréier)

Hiweis: Benotzt frësch Klinge fir d’Mikrotomie, fir d’Kontaminatioun duerch Paraffinreschter ze miniméieren.

Prozedur

1. Deparaffinéierung
   1. Iwwerféiert d’FFPE-Schnëtter a Mikrozentrifugeréier mat gerénger Bindungskapazitéit.
   2. Gitt 1 mL Xylol dobäi a mëscht kuerz um Vortexmëscher.
   3. Inkubéiert 10 Minutte bei Raumtemperatur.
   4. Zentrifugéiert 2 Minutte bei 14.000 × g; entsuergt den Iwwerstand.
   5. Widderhuelt de Wäschschrëtt mat Xylol nach eng Kéier (Schrëtt 2–4).
   6. Wäscht de Pellet mat 1 mL 96% Ethanol, mëscht um Vortexmëscher an zentrifugéiert duerno 2 Minutte bei 14.000 × g. Entsuergt den Iwwerstand.
   7. Widderhuelt de Wäschschrëtt mat Ethanol nach eng Kéier (am Ganzen 2 Wäschschrëtt mat Ethanol).
   8. Loosst de Pellet 10 Minutte bei Raumtemperatur mat oppenen Deckelen un der Loft dréchnen, fir de Reschtethanol ze verdonsten.
2. Proteinextraktioun an Ultraschallbehandlung
   1. Gitt bei all dréchene Pellet 200 µL Lysepuffer dobäi.

      Hiweis: Och wann den Ultraschallapparat bis zu 1 mL ophuele kann, sinn 200 µL fir déi uschléissend Veraarbechtung optimal.

   2. Mëscht um Vortexmëscher oder duerch virsiichtegt Pipettéieren.
3. Éischt thermesch Inkubatioun
   1. Inkubéiert d’Prouweréier 30 min bei 95 °C a beweegt se dobäi mat 400 rpm mat Hëllef vun engem Thermomixer oder Heizblock.
   2. Loosst d’Prouwe 5 min bei Raumtemperatur ofkillen.
4. Éischt Ultraschallbehandlung mam VialTweeter
   1. Setzt d’Prouweréier an de VialTweeter.
   2. Stellt de VialTweeter UP200St op déi ënnendrënner uginn Wäerter a féiert d’Ultraschallbehandlung duerch.
Astellunge vum Ultraschallapparat
• Stellt d’Amplitud (A) op 100%
• Stellt de Pulsatiounsmodus (C) op 100%
• Periodenzäitschaltung: Un
• Aschaltzäit: 60s
• Ausschaltzäit: 30s
• Grenzwäert: 15 min (entsprécht 10 Zyklen)
(Hiweis zur Berechnung: (60 s un + 30 s aus) × 10 Zyklen = 900 s = 15 min)
5. Zweet thermesch Inkubatioun
   Huelt d’Prouweréier eraus an inkubéiert se nach eng Kéier 15 min bei 95 °C a 400 rpm.
6. Zweet Ultraschallbehandlung
   Widderhuelt d’Ultraschallbehandlung mam VialTweeter mat de selwechten Astellungen (wéi uewen) fir 10 zousätzlech Zyklen (am Ganze 15 min).
7. Klärung vum Lysat
   1. Zentrifugéiert d’Prouwe bei 13.000 × g fir 10 min bei 23°C (Raumtemperatur).
   2. Iwwerféiert den Iwwerstand virsiichteg an en neit 2,0 mL Safe-lock Eppendorf-Prouweréier. Vermeit et, de Pellet opzewierbelen.
8. Uschléissend Veraarbechtung
   De Lysat ass elo prett fir d’SP3-Rengegung an den enzymateschen Ofbau.

Hiweiser a recommandéiert Aarbechtsweisen

1. De Risiko vun Iwwerhëtzung wärend der Ultraschallbehandlung gëtt duerch programméiert UN/AUS-Zykle reduzéiert.
2. Vermeit d’Mëschen um Vortexmëscher no der Ultraschallbehandlung, fir d’Aggregatioun vu Proteinnen ze verhënneren.

Offallentsuergung a Sécherheet

Déi folgend Tabell gëtt Iech en Unhaltspunkt fir déi ongeféier Veraarbechtungskapazitéit vun eisen Ultraschallapparater a Laborgréisst: