샷건 프로테오믹스에서의 마이크로플레이트 초음파 처리 – 응용 노트

샷건 프로테오믹스는 복잡한 생물학적 시료를 LC-MS/MS 분석에 적합한 펩타이드로 변환하기 위해 효율적이고 재현성 높은 시료 전처리에 의존합니다. UIP400MTP 마이크로플레이트 초음파 처리는 소량 시료에 대한 표준화된 병렬 초음파 처리를 가능하게 함으로써 이 과정을 지원하며, 실험실에서 마이크로플레이트 기반 워크플로우의 세포 분해, 추출 및 재용해 과정을 개선하는 데 도움을 줍니다. 이 애플리케이션 노트에서는 PLA2G12A/Th17 연구에서 발표된 세포외 소포 워크플로우를 실험실 검증 사례로 활용하여, UIP400MTP를 단백질체학 시료 전처리 과정에 어떻게 통합할 수 있는지 설명합니다.

재현성을 높인 샷건 프로테오믹스를 위한 마이크로플레이트 초음파 처리

단백질체학 연구자들에게 있어 재현성 있는 시료 전처리는 고품질의 LC-MS/MS 데이터를 얻기 위해 매우 중요합니다. UIP400MTP 마이크로플레이트 초음파 처리는 플레이트 기반 및 소용적/고속 처리 워크플로우에서 표준화된 병렬 초음파 처리를 지원합니다.

다음과 같은 분야를 다루는 연구실에 특히 유용합니다:

• 많은 웰에 걸쳐 일관된 처리가 필요한 대규모 시료 세트
• 시료 손실과 변동성을 최소화해야 하는 제한된 입력 재료
• 세포외 소포와 같은 지질이 풍부한 시료
• 효율적인 분해, 추출 또는 재용해 과정이 필요한 복합 생물학적 제제
• 다양한 조건과 반복 실험 간 재현성이 필수적인 비교 샷건 프로테오믹스

분해 과정 전에 마이크로플레이트 초음파 처리를 통합함으로써, 연구자들은 다음 용도에 대한 시료 준비 상태를 개선할 수 있습니다:

• 단백질 추출 및 재용해
• 트립신/Lys-C 분해
• 나노-LC/MS/MS 데이터 수집
• 정량적 다운스트림 단백질체학 분석

 

자신 있게 프로테오믹스 시료 전처리 규모를 확장하세요!
마이크로플레이트 초음파 처리가 어떻게 수작업에 따른 변동성을 줄이고, 시료 분해를 개선하며, 신뢰할 수 있는 LC-MS/MS 분석을 위해 복잡한 생물학적 시료를 전처리하는 데 도움이 되는지 알아보세요.

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마이크로플레이트 초음파 처리는 다음과 같은 이점을 제공합니다:

• 단백질체학 핵심 시설
• 전기차 연구소
• 면역학 및 세포생물학 실험실
• 임상 적용 연구 그룹
• 단일 시료 전처리에서 고처리량 워크플로로 확장해 나가는 생명과학 팀들

세포외 소포 단백질체 분석을 위한 고처리량 시료 전처리

샷건 프로테오믹스란 무엇인가?

샷건 프로테오믹스는 전체 세포 용해물과 조직 추출물부터 정제된 세포소기관, 세포외 소포, 소량 임상 검체에 이르기까지 복잡한 생물학적 시료를 특성화하는 핵심 분석 전략으로 자리 잡았습니다. 이 기법의 핵심 강점은 단백질 분해, 고분해능 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법, 그리고 전산적 펩타이드-단백질 추론의 결합에 있습니다. 그러나 최종 프로테옴 데이터 세트의 품질은 시료가 질량 분석기에 도달하기 훨씬 전에 결정됩니다. 효율적인 시료 분해, 단백질 용해, 간섭 물질의 제거, 재현성 있는 효소 분해, 그리고 안정적인 펩타이드 회수는 모두 커버리지의 깊이와 정량적 신뢰성을 결정하는 핵심 요소입니다.
시료량이 제한적이거나 귀중한 시료를 다루는 단백질체학 연구자 및 생명과학 연구실의 경우, 시료 전처리가 종종 병목 현상이 됩니다.

프로테오믹스 분야에서 세포외 소포가 제기하는 과제

예를 들어, 세포외 소포(EVs)는 특히 처리하기 까다로운 시료 유형에 속합니다. 이들은 막으로 둘러싸인 지질이 풍부한 나노 크기의 입자로, 단백질 수율이 상대적으로 낮을 뿐만 아니라 지질, 염류, 계면활성제, 혈청 단백질 및 기타 매트릭스 성분이 시료로 유입될 가능성이 높습니다. 이러한 특성들은 분해 효율, 크로마토그래피 성능, 전기분무 안정성 및 펩타이드 동정에 방해가 될 수 있습니다. 따라서 EV 단백질체학 분석용 시료 전처리 워크플로는 소포 구조를 파괴하고 단백질 화물을 용해시킬 수 있을 만큼 강력하면서도, 후속 단계인 효소 분해 및 LC-MS/MS 분석과 호환되어야 합니다.
이러한 맥락에서, 마이크로플레이트 호환 초음파 처리는 재현성이 뛰어나고 병렬화된 시료 처리를 위한 실용적인 접근 방식을 제공합니다. Hielscher의 마이크로플레이트 초음파 처리기 모델인 UIP400MTP(400W) 및 UIP550MTP(550W)는 멀티웰 플레이트 및 소용적 용기 내 시료의 초음파 처리를 위해 설계되었으며, 기존의 단일 프로브 초음파 처리기보다 더 높은 처리량을 지원하는 워크플로우를 제공합니다. 단백질체학 연구실의 경우, 이 형식은 수작업으로 인한 변동성을 줄이고, 여러 시료의 병렬 처리를 개선하며, 플레이트 기반 시료 전처리 파이프라인에 보다 자연스럽게 통합될 수 있다는 점에서 매력적입니다.

모범적인 워크플로우

최근 PLA2G12A에 의해 유도된 Th17 세포 생물학 분야에서 수행된 세포외 소포 단백질체학 워크플로는 마이크로플레이트 초음파 처리기 UIP400MTP를 샷건 단백질체학 시료 전처리 과정에 어떻게 통합할 수 있는지에 대한 유용하고 실험실에서 검증된 사례를 제시합니다. 해당 연구 시리즈에서, EV 시료는 메탄올 처리, UIP400MTP 초음파 처리, 원심분리, 건조, 트립신/Lys-C 분해, 나노 유량 LC-고분해능 탠덤 MS를 거쳐 프로테옴 분석을 위해 처리되었습니다. 동일한 생물학적 연구 결과는 처음에 bioRxiv 프리프린트로 보고된 후 Cell Reports에 게재되었으며, 이 논문에서 프로테오믹스 분석을 통해 PLA2G12A가 병원성 T 세포 반응의 맥락에서 EV 화물 단백질을 어떻게 변화시키는지를 규명하는 데 기여했습니다.

멀티웰 플레이트 초음파 발생기 UIP400MTP

왜 마이크로플레이트 초음파 처리를 하는가?
UIP400MTP는 소량 시료에 대한 표준화된 병렬 초음파 처리를 가능하게 합니다. 이는 재현성, 적은 시료 투입량, 다중 시료 처리 능력이 중요한 경우에 유용합니다.

품질 관리 체크리스트

• 모든 시료에 대해 동일한 EV 단백질 상당량의 투입량이 적용되었는지 확인하십시오.
• 무작위 또는 균형 잡힌 샘플 처리 레이아웃을 사용하십시오.
• 메탄올의 부피, 초음파 처리 시간, 건조 시간 및 분해 부피를 일관되게 유지하십시오.
• 펩타이드 수율과 총 단백질 동정 결과를 모니터링한다.
• 미분해 비율과 펩타이드 길이 분포를 확인하십시오.
• 크로마토그래피 피크의 형태와 유지 시간의 재현성을 확인하십시오.
• 이월분을 확인하기 위해 빈 칸을 포함하십시오.
• 대규모 연구의 경우 통합된 품질 관리(QC) 샘플을 사용하십시오.
• 반복 실험의 변동계수를 평가하십시오.
• PCA 또는 관련 기법을 사용하여 배치 효과나 이상치 샘플을 식별하십시오.

의정서 작성 권고 사항

이 워크플로우를 발표하거나 문서화할 때는 EV 투입량, 플레이트 형식, 메탄올 부피, UIP400MTP의 진폭 및 초음파 처리 시간, 원심분리 조건, 건조 방법, 분해 완충액, 효소 농도, 분해 시간, 산성화 조건, LC-MS/MS 플랫폼, 데이터 수집 모드, 소프트웨어 버전, 데이터베이스, FDR 임계값, 정규화 방법 및 통계 워크플로우를 보고하십시오.
모든 Hielscher 마이크로플레이트 초음파 처리기는 진폭, 초음파 처리 시간, 온도 등 중요한 공정 매개변수를 날짜 및 시간 정보와 함께 내장 SD 카드에 CSV 파일로 자동으로 기록합니다. 재현성 및 품질 관리를 위한 데이터 기록이 이토록 간편했던 적은 없었습니다!

연구 심층 분석: PLA2G12A 연구에서의 EV 샷건 프로테오믹스

PLA2G12A 연구는 샷건 프로테오믹스 워크플로우에서 UIP400MTP를 활용한 구체적인 사례를 제시합니다. 이 연구의 생물학적 질문은 분비형 포스포리파제 PLA2G12A가 Th17 세포 유래 세포외 소포를 어떻게 변형시키고, 이를 통해 병원성 T 세포 분화에 어떤 영향을 미치는지였습니다. 저자들은 PLA2G12A가 EV 막에 작용하여 1-올레오일-리소포스파티딜에탄올아민을 포함한 리소포스포리피드를 생성하며, LPA2를 통한 하류 리소포스파티드산 신호전달이 Th17 분화에 기여함을 보여주었다. 지질 신호전달 외에도, 이 연구에서는 RNA 및 단백질 함량을 포함한 EV의 내용물을 조사했으며, 이로 인해 샷건 프로테오믹스가 특성 분석 전략의 중요한 구성 요소로 자리매김했다.
EV 준비 과정에서는 엑소좀이 제거된 소 태아 혈청이 포함된 배지에서 Th17 세포를 배양하였다. 배양 상층액을 먼저 원심분리하여 세포를 제거하고, 0.22 µm 필터를 통해 여과한 후, 한외여과/초원심분리를 통해 농축하고, 세척한 뒤 PBS에 재현탁시켜 BCA 단백질 정량법을 통해 단백질 농도를 측정했습니다. 이러한 상류 EV 준비 과정을 통해 정의된 단백질 등가량의 EV 물질을 프로테오믹스 워크플로우로 이관할 수 있었습니다.
샷건 프로테오믹스 분석을 위해 저자들은 단백질 환산량 5 µg에 해당하는 EV 시료를 사용했다. 이 시료들은 PCR 튜브에서 건조시킨 후, 메탄올 25 µL를 첨가했다. 그런 다음 UIP400MTP 마이크로플레이트 초음파 처리기를 사용하여 시료를 3분간 초음파 처리했다. 초음파 처리 후, 시료를 4°C에서 19,000 × g로 20분 동안 원심분리했다. 상층액 20 µL를 제거한 후, 시료를 완전히 건조될 때까지 원심분리했다. 그 후, 50 mM 암모늄 바이카보네이트 용액에 100 ng/µL 농도로 조제된 트립신/Lys-C 용액 4 µL를 사용하여 초음파 처리를 통해 단백질을 용해시켰습니다. 37°C에서 300 rpm으로 교반하며 2시간 동안 분해를 진행했습니다. 분해물을 1 µL의 1.25% 트리플루오로아세트산으로 산성화한 후, 나노 플로우 LC-고분해능 탠덤 질량 분석법에 회부했습니다.
이 워크플로는 저입력 엑소좀(EV) 단백질체학에 유용한 몇 가지 원칙을 보여줍니다. 첫째, 입력량은 단백질 등가량으로 정규화되었는데, 이는 서로 다른 유전자형이나 처리 조건에서 유래한 엑소좀을 비교할 때 중요합니다. 둘째, 초음파 처리 전에 메탄올을 사용함으로써, LC-MS/MS 분석을 복잡하게 만들 수 있는 계면활성제 시스템을 피하면서도 엑소좀의 파괴와 추출을 촉진했습니다. 셋째, 초음파 처리 단계는 짧고 표준화되어 있어, 시료의 병렬 처리에 적합합니다. 넷째, 트립신/Lys-C 분해는 매우 적은 부피에서 수행되어 희석 정도를 줄이고 저입력 펩타이드 회수를 지원했습니다. 마지막으로, 분해 단계에서 산성화 및 LC-MS/MS 단계로 직접 전환함으로써 불필요한 처리 단계를 최소화했습니다.
후단 LC-MS/MS 분석법에서는 나노 유량 역상 분리를 Q-Exactive HF Orbitrap 질량 분석기와 결합하여 사용하였다. 시료는 C18 프리컬럼에 포집된 후, 내경 50 µm의 분석 컬럼에서 200 nL/min의 유속과 40°C의 조건으로 분리되었다. 그라디언트는 60분 동안 저농도 유기 용매에서 35% 용매 B까지 진행되었으며, 그 후 고농도 유기 용매로 세척하고 재평형화했습니다. MS 데이터 수집은 고에너지 충돌 해리(HEDD)를 이용한 데이터 독립적 수집(DIA) 방식으로 양이온 모드에서 수행되었습니다. DIA 원시 파일은 DIA-NN 1.8을 사용하여 컴퓨터 시뮬레이션을 통해 예측된 스펙트럼 라이브러리와 함께 분석되었습니다.