초음파를 이용한 식물 세포의 유전적 형질전환

초음파 처리 보조 아그로박테리움 매개 형질전환(SAAT)은 아그로박테리움을 운반체로 사용하여 식물 세포를 외래 유전자로 감염시키는 효율적인 방법입니다. 초음파 캐비테이션은 초음파 천공을 유발하며, 이는 식물 조직의 표적 부위에 미세 상처를 내는 것으로 설명할 수 있습니다. 초음파로 생성된 이러한 미세 상처를 통해 DNA와 DNA 벡터를 세포 기질 내부로 효율적으로 전달할 수 있습니다.

초음파 천공 – 초음파로 향상되는 세포 형질전환

세포 현탁액에 저주파 초음파(약 20kHz)를 가하면 음향 캐비테이션의 영향으로 세포 조직의 세포막 투과성이 일시적으로 증가합니다. 이러한 초음파 효과는 초음파 천공으로 알려져 있으며, 세포나 조직에 유전자를 전달하는 데 사용됩니다.
초음파 처리의 장점은 비열적 기계 작용 원리에 기반하며, 이로 인해 초음파 처리는 흔히 활용 범위가 더 넓고 세포 유형에 대한 의존도가 더 낮습니다. 초음파 천공의 다양한 활용은 복잡한 인간 치료용 단백질의 생물학적 생산에 상당한 잠재력을 가진 형질전환 식물을 이용할 가능성을 열어 줍니다. 이러한 식물 기반 생물반응기는 유전적으로 쉽게 조작할 수 있고, 인간 병원체에 의한 잠재적 오염을 방지하며, 형질전환을 매개하는 세균(예: 아그로박테리움)을 손상시키지 않고, 저렴하고 효과적인 생합성 방법을 제공합니다.

초음파 보조 세포 형질전환

초음파 처리는 저주파 초음파를 가하여 용액 내 입자를 교반하고 용액을 혼합함으로써 물질 전달 속도와 용해 속도를 높이는 기술입니다. 동시에 초음파 처리는 액체에서 용존 기체를 제거할 수 있습니다. 식물 형질전환에서 초음파 처리는 식물 조직에 미세 상처를 형성하고 식물 원형질체 내부로의 나출 DNA 전달을 향상시킵니다.

유전적 형질전환에서는 초음파 처리 보조 아그로박테리움 매개 형질전환(SAAT)이 선호되는 방법이며, 나출 DNA와 DNA 벡터를 원형질체 내부로 직접 전달하는 데 사용하는 초음파 처리보다 효율이 유의하게 높습니다. 수많은 연구에서 초음파 처리 보조 아그로박테리움 매개 형질전환(SAAT)을 사용하면 초음파와 그에 따른 음향 캐비테이션으로 식물 세포에 기계적 파괴와 상처 형성을 유도할 수 있음이 입증되었습니다. 짧은 초음파 처리는 외식편 표면에 미세 상처를 생성합니다. 상처가 난 세포는 아그로박테리움이 식물 조직의 더 깊은 부분으로 침투할 수 있게 하므로 식물 세포가 감염될 가능성이 높아집니다. 또한 분비된 페놀성 화합물은 형질전환을 향상시킵니다. 초음파로 생성된 미세 상처는 세균이 외식편에 침투하는 것도 더 용이하게 합니다. SAAT는 특히 아그로박테리움에 저항성이 있다고 여겨지는 식물 종의 유전적 형질전환에 성공적으로 사용되었습니다.
매우 간단하고 저렴한 방법이라는 점과 아그로박테리움 매개 유전자 전달을 크게 향상시킨다는 점이 SAAT의 주요 장점입니다. SAAT는 Chenopodium rubrum L.과 Beta vulgaris L.의 형질전환에 성공적으로 적용되었을 뿐 아니라, Nicotiana tabacum에서 재조합 Escherichia coli 야생형 이열성 완전독소와 Escherichia coli 돌연변이 LT 백신 보조제를 생산하는 데에도 적용되었으며, 이와 관련하여 조류에서 가장 높은 전신 LT-B 특이적 IgG 역가가 검출되었습니다.
(cf. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka and R. Baranski, 2014)

식물 세포에서 초음파 천공을 통한 유전자 전달의 일반적인 절차

1. 유전 물질 준비: 먼저 식물 세포에 도입하려는 유전 물질을 준비합니다. 이는 플라스미드 DNA, RNA 또는 기타 핵산일 수 있습니다.
2. 식물 세포 분리: 표적으로 삼을 식물 세포를 분리합니다. 실험에 따라 이 세포들은 식물 조직이나 배양물에서 분리할 수 있습니다.
3. 세포 현탁액: 식물 세포를 적절한 배지나 완충액에 현탁합니다. 이는 세포가 건강하고 유전자 흡수에 유리한 상태를 유지하도록 하는 데 필수적입니다.
4. 초음파 처리기 설정: 진폭, 시간, 에너지, 온도와 같은 초음파 처리 매개변수를 사전 설정하여 프로브형 초음파 처리기를 준비합니다. 초음파 프로브를 세포 현탁액에 담급니다.
5. 초음파 처리: 초음파 처리 절차를 시작합니다. 프로브 팁의 빠른 진동으로 액체에 캐비테이션 기포가 생성됩니다. 이 기포들은 초음파에 의해 팽창하고 붕괴하면서 현탁액에 기계적 힘과 미세유동을 발생시킵니다.
6. 초음파 천공: 캐비테이션에 의해 발생한 기계적 힘과 미세유동이 식물 세포막에 일시적으로 미세공과 구멍을 만듭니다. 현탁액에 존재하는 유전물질은 이 미세공을 통해 식물 세포 안으로 들어갈 수 있습니다.
7. 배양: 초음파 천공 처리 후에는 식물 세포를 배양하여 세포가 회복되고 세포막이 안정화되도록 합니다. 이는 세포 생존과 성공적인 유전자 전달을 보장하는 데 매우 중요한 단계입니다.

아그로박테리움 또는 리포솜을 통한 유전자 전달

식물 세포에 유전물질을 도입하는 데 일반적으로 사용되는 방식은 두 가지입니다. 이들 방식에서는 그람 음성 세균의 한 속인 아그로박테리움이나 리포솜을 유전물질의 운반체로 사용합니다.

• 아그로박테리움 매개 초음파 천공: Agrobacterium tumefaciens는 식물 유전공학에서 흔히 사용되는 세균입니다. 이 방법에서는 원하는 유전자를 포함한 플라스미드 DNA를 아그로박테리움에 도입한 다음, 이를 식물 세포와 혼합합니다. 프로브형 초음파 처리기를 사용하여 세포 현탁액에 초음파 천공 처리를 수행합니다. 초음파 에너지는 아그로박테리움에서 식물 세포로 유전물질이 전달되는 것을 촉진합니다. 이 방법은 식물의 유전자 변형에 널리 사용됩니다.
• 리포솜 매개 초음파 천공: 리포솜은 유전물질을 운반할 수 있는 지질 기반 소포입니다. 이 방법에서는 플라스미드 DNA나 기타 핵산을 담은 리포솜을 식물 세포와 혼합합니다. 식물 세포의 리포솜 흡수를 촉진하기 위해 프로브형 초음파 처리기를 이용한 초음파 천공을 수행합니다. 초음파는 리포솜의 지질 이중층을 파괴하여 유전물질을 식물 세포 안으로 방출합니다. 이 접근법은 식물 세포의 일시적 유전자 발현 연구에 유용합니다.

과학적으로 입증된 초음파 처리 보조 아그로박테리움 매개 형질전환(SAAT)의 이점

초음파 처리 보조 아그로박테리움 매개 형질전환(SAAT)은 수많은 식물 종에 적용되어 왔습니다. 식물 세포 배양물에 짧고 비교적 온화한 초음파 처리를 하면 초음파 천공이 발생하며, 이에 따라 유전자 운반체인 아그로박테리움이 깊숙이 침투할 수 있게 됩니다. 아래에서 SAAT의 유익한 효과를 입증하는 연구 사례를 살펴볼 수 있습니다.

초음파 보조 아슈와간다 형질전환

W. somnifera(아슈와간다 또는 윈터체리로 알려짐)의 형질전환 효율을 개선하기 위해 Dehdashti와 동료들(2016)은 아세토시링곤(AS)과 초음파 처리의 사용을 연구했습니다.
아세토시링곤(AS)은 Agrobacterium 액체 배양, Agrobacterium 감염, 외식편과 Agrobacterium의 공동 배양이라는 세 단계에서 첨가되었습니다. Agrobacterium 액체 배양에 75 μM AS를 첨가하는 것이 vir 유전자 유도에 최적인 것으로 나타났습니다.
초음파 처리(SAAT)를 추가로 적용했을 때 가장 높은 유전자 발현이 나타났습니다. 잎과 줄기 정단을 각각 10 및 20s 동안 초음파 처리했을 때 모상근에서 gusA 유전자 발현이 가장 우수한 것으로 나타났습니다. 개선된 프로토콜의 형질전환 효율은 잎과 줄기 정단 외식편에서 각각 66.5 및 59.5%로 기록되었습니다. 다른 프로토콜과 비교했을 때 이 개선된 프로토콜의 형질전환 효율은 잎에서 2.5배, 줄기 정단에서 3.7배 높은 것으로 나타났습니다. 서던 블롯 분석으로 W1-W4 계통에서 gusA 도입유전자의 사본 1–2개가 확인되었으며, 개선된 프로토콜로 생성된 W5 계통에서는 도입유전자 사본 1–4개가 검출되었습니다.

초음파 처리 보조 Agrobacterium 매개 형질전환(SAAT)의 처리 시간이 W. somnifera 잎(a) 및 줄기 정단(b) 외식편의 형질전환 빈도에 미치는 영향
(연구 및 도표: © Dehdashti et al., 2016)

초음파 보조 목화 형질전환

Hussain et al. (2007)은 초음파 처리 보조 목화 형질전환의 유익한 효과를 보여 줍니다. 저주파 초음파로 발생하는 음향 캐비테이션은 식물 조직의 표면과 그 아래에 미세 상처를 형성하며(소노포레이션), Agrobacterium이 식물 조직의 더 깊은 곳까지, 그리고 조직 전체에 걸쳐 이동할 수 있게 합니다. 이러한 상처 형성 방식은 조직 깊숙이 있는 식물 세포가 감염될 확률을 높입니다. SAAT의 형질전환 효율을 평가하기 위해 GUS 유전자 발현을 측정했습니다. GUS 리포터 시스템은 식물 분자생물학과 미생물학에서 특히 유용한 리포터 유전자 시스템입니다. 다양한 SAAT 매개변수를 조정한 결과, 성숙 배아를 외식편으로 사용한 목화에서 GUS 일시적 발현이 유의하게 증가했습니다. GUS는 외식편 배양 후 24h에 처음 검출되었으며, 48h에는 GUS 발현이 매우 강하게 나타나 초음파 처리 보조 Agrobacterium 매개 형질전환(SAAT) 후 목화 외식편의 성공적인 형질전환을 나타내는 유용한 지표가 되었습니다. 다양한 형질전환 기법(즉, 바이오리스틱, Agro, BAAT, SAAT)을 비교한 결과, 초음파 처리 보조 Agrobacterium 매개 형질전환(SAAT)이 단연 가장 우수한 형질전환 결과를 보였습니다.

GUS의 일시적 발현을 기준으로 한 형질전환 절차의 선택. 초음파 처리 보조 Agrobacterium 매개 형질전환(SAAT)은 유의하게 더 높은 일시적 발현을 보입니다.
(연구 및 도표: © Hussain et al., 2007)

소노포레이션 및 SAAT를 위한 고성능 초음파 솔루션

Hielscher Ultrasonics는 실험실, 연구 시설 및 처리량이 매우 높은 산업 생산용 고성능 초음파 처리기의 개발과 제조 분야에서 오랜 경험을 보유하고 있습니다. 미생물학 및 생명과학 분야를 위해 Hielscher는 특정 조직과 그 처리에 필요한 다양한 요구 사항을 충족하는 여러 솔루션을 제공합니다. 다수의 시료를 동시에 초음파 처리하기 위해 Hielscher는 멀티웰 플레이트용 UIP400MTP, 최대 10개의 바이알(예: Eppendorf 튜브)을 초음파 처리하는 VialTweeter 또는 초음파 CupHorn을 제공합니다. 프로브형 초음파 처리기는 실험실용 균질기로서 50–400와트의 출력으로 제공되며, 산업용 시스템의 출력 범위는 500와트–16kW입니다.
당사에 연락하여 적용 분야와 공정 요구 사항을 알려 주십시오. 경험이 풍부한 당사 직원이 귀하의 생물학적 공정에 가장 적합한 초음파 처리기를 기꺼이 추천해 드립니다.
아래 표는 당사 초음파 처리기의 대략적인 처리 용량을 보여 줍니다: