초음파 처리 보조 아그로박테리움-매개 형질전환(SAAT)은 아그로박테리움을 수송체로 사용하여 식물 세포에 외래 유전자를 감염시키는 효율적인 방법입니다. 초음파 캐비테이션은 식물 조직의 표적 미세 상처로 묘사 될 수있는 sonoporation을 일으 킵니다. 이러한 초음파를 통해 미세 상처를 생성하고, DNA 및 DNA 벡터는 세포 매트릭스로 효율적으로 수송 될 수 있습니다.

소노포레이션 – 초음파로 강화된 세포 형질전환

저주파 초음파 (약 20kHz)가 세포 현탁액에 적용될 때, 음향 캐비테이션의 효과는 세포 조직에 일시적인 막 투과를 일으킨다. 이 초음파 효과는 sonoporation으로 알려져 있으며 세포 또는 조직으로의 유전자 전달에 사용됩니다.
초음파의 장점은 비 열 기계적 작동 원리에 기반을두고 있으며, 이는 초음파 처리를보다 다재다능하고 세포 유형에 덜 의존하게 만듭니다. sonoporation의 다목적 적용은 복잡한 인간 치료 단백질의 생물 생산에 상당한 잠재력을 가진 형질전환 식물의 활용에 대한 가능성을 열어줍니다. 이러한 식물-기반 생물반응기는 유전적으로 조작되기 쉽고, 인간 병원균과의 잠재적 오염을 방지하며, 형질전환 매개균(예를 들어 아그로박테리움)을 손상시키지 않으며, 저렴하고 효과적인 생체합성 방법이다.

초음파 보조 세포 변환

초음파 처리는 저주파수 초음파를 적용하여 용액의 입자를 교반하고 용액을 혼합하여 질량 전달 및 용해 속도를 높이는 기술입니다. 동시에, 초음파 처리는 액체에서 용해 된 가스를 제거 할 수 있습니다. 식물 변형에서 초음파 처리는 식물 조직에 미세 상처가 형성되고 벌거 벗은 DNA가 식물 원형질체로 전달되도록 향상시킵니다.

유전자 변형의 경우, 초음파 처리 보조 아그로박테리움 매개 형질전환 (SAAT)이 선호되는 방법이며 네이키드 DNA 및 DNA 벡터를 원형질체로 직접 전송하는 데 사용되는 초음파 처리보다 훨씬 높은 효율을 가지고 있습니다. 수많은 연구 결과에 따르면 초음파 처리 보조 아그로박테리움 매개 형질전환 (SAAT)은 초음파와 이로 인한 음향 캐비테이션에 의한 식물 세포의 기계적 파괴 및 상처 형성을 유도하는 데 사용될 수 있습니다. 짧은 초음파 처리는 외래 식물의 표면에 미세 상처를 만듭니다. 상처 입은 세포가 식물 조직의 더 깊은 부분으로 아그로박테리움의 침투를 허용함에 따라 식물 세포가 감염 될 가능성이 높아집니다. 추가적으로, 분비된 페놀 화합물은 형질전환을 강화시킨다. 초음파로 생성 된 미세 상처는 박테리아에 의한 explant 침투를보다 실현 가능하게 만듭니다. SAAT는 특히 아그로박테리움에 내성이 있는 것으로 간주되는 식물 종의 유전자 변형에 성공적으로 사용되었습니다.
매우 간단하고 저렴한 방법뿐만 아니라 아그로박테리움 매개 유전자 전달의 현저한 향상은 SAAT의 주요 장점입니다. Chenopodium rubrum L. 및 Beta vulgaris L.의 형질전환에서 SAAT의 성공적인 적용 외에도,이 접근법은 Nicotiana tabacum에서 재조합 에스케리치아 콜라이 야생형 열 불안정성 홀로톡신 및 에스케리치아 콜라이 돌연변이체 LT 백신 보조제의 생산에도 적용되었으며, 조류에서 가장 높은 전신 LT-B 특이적 IgG 역가가 검출되었습니다.
(Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka and R. Baranski, 2014)

식물 세포에서 sonoporation을 통한 유전자 전달에 대한 일반 절차

1. 유전 물질의 준비 : 식물 세포에 도입하려는 유전 물질을 준비하는 것으로 시작하십시오. 이것은 플라스미드 DNA, RNA 또는 기타 핵산일 수 있습니다.
2. 식물 세포 분리: 표적으로 삼으려는 식물 세포를 분리합니다. 실험에 따라 이러한 세포는 식물 조직 또는 배양물에서 분리될 수 있습니다.
3. 세포 현탁액: 식물 세포를 적절한 배지 또는 완충액에 현탁시킨다. 이것은 세포가 건강하고 유전자 흡수에 도움이 되는 상태인지 확인하는 데 필수적입니다.
4. 초음파 처리기 설정: 진폭, 시간, 에너지 및 온도와 같은 초음파 처리 사전 설정 매개 변수로 프로브 형 초음파 처리기를 준비하십시오. 초음파 프로브를 세포 현탁액에 담그십시오.
5. 쥡니다: 초음파 처리 절차를 시작하십시오. 프로브 팁의 빠른 진동은 액체에 캐비테이션 기포를 생성합니다. 이 기포는 초음파로 인해 팽창 및 붕괴되어 서스펜션에 기계적 힘과 마이크로 스트리밍을 생성합니다.
6. Sonoporation: 캐비테이션에 의해 생성 된 기계적 힘과 마이크로 스트리밍은 식물 세포의 막에 일시적으로 기공과 구멍을 만듭니다. 현탁액에 존재하는 유전 물질은 이러한 구멍을 통해 식물 세포로 들어갈 수 있습니다.
7. 잠복: sonoporation 처리 후, 식물 세포를 배양하여 막을 회복하고 안정화시킵니다. 이것은 세포 생존과 성공적인 유전자 전달을 보장하는 중요한 단계입니다.

아그로박테리움 또는 리포솜을 통한 유전자 전달

식물 세포를 형질감염시키는 데는 두 가지 일반적인 형태가 있습니다. 그들은 그람 음성 박테리아의 속인 아그로박테리움 또는 리포솜을 유전 물질의 운반체로 사용합니다.

• 아그로박테리움 매개 Sonoporation: Agrobacterium tumefaciens는 식물 유전 공학에 일반적으로 사용되는 박테리아입니다. 이 방법에서는 원하는 유전자를 함유하는 플라스미드 DNA를 아그로박테리움에 도입한 다음 식물 세포와 혼합합니다. 세포 현탁액은 프로브 형 초음파 처리기를 사용하여 sonoporation을 실시합니다. 초음파 에너지는 아그로박테리움에서 식물 세포로의 유전 물질의 전달을 향상시킵니다. 이 방법은 식물의 유전자 변형에 널리 사용됩니다.
• 리포솜 매개 Sonoporation: 리포솜은 유전 물질을 운반할 수 있는 지질 기반 소포입니다. 이 방법에서는 플라스미드 DNA 또는 다른 핵산이 로드된 리포솜을 식물 세포와 혼합합니다. 프로브 형 초음파 처리기를 사용한 Sonoporation은 식물 세포에 의한 리포솜의 흡수를 촉진하기 위해 사용됩니다. 초음파는 리포솜의 지질 이중층을 파괴하여 유전 물질을 식물 세포로 방출합니다. 이 접근법은 식물 세포의 일시적인 유전자 발현 연구에 유용합니다.

초음파 처리 보조 아그로박테리움 매개 형질전환(SAAT)의 과학적으로 입증된 이점

초음파 처리 보조 아그로박테리움-매개 형질전환 (SAAT)은 수많은 식물 종에 적용되어 왔습니다. 식물 세포 배양물의 짧고 비교적 온화한 초음파 처리는 sonoporation을 일으키며, 이는 나중에 유전자 운반체로서 Agrobacterium의 깊은 침투를 허용합니다. 아래에서 SAAT의 유익한 효과를 보여주는 모범적 인 연구를 읽을 수 있습니다.

Ashwagandha의 초음파 보조 변환

W. somnifera (ashwagandha 또는 겨울 체리로 알려짐)의 변형 효율을 향상시키기 위해 Dehdashti와 동료 (2016)는 아세토 시링곤 (AS) 및 초음파 처리의 사용을 조사했습니다.
아세토시링곤 (AS)은 세 단계로 첨가되었다: 아그로박테리움 액체 배양, 아그로박테리움 감염 및 아그로박테리움과 외식식물의 공동 배양. 아그로박테리움 액체 배양물에 75 μM AS를 첨가하는 것은 vir 유전자의 유도에 최적인 것으로 밝혀졌다.
초음파 처리 (SAAT)의 추가 적용은 가장 높은 유전자 발현을 가져 왔습니다. 털이 많은 뿌리에서의 gusA 유전자 발현은 잎과 쏘는 끝이 각각 10 초와 20 초 동안 초음파 처리되었을 때 가장 좋은 것으로 나타났습니다. 개선된 프로토콜의 형질전환 효율은 잎 및 싹 팁 외식식물의 경우 각각 66.5 및 59.5%를 기록하였다. 다른 프로토콜과 비교했을 때이 개선 된 프로토콜의 변형 효율은 잎의 경우 2.5 배 더 높았고 촬영 팁의 경우 3.7 배 더 높은 것으로 나타났습니다. 서던 블롯 분석은 W1-W4 라인에서 gusA 전이유전자의 1-2 카피를 확인했으며, 개선된 프로토콜에 의해 생성된 라인 W5에서 1-4개의 전이유전자 카피가 검출되었다.

초음파 처리 보조 아그로박테리움-매개 형질전환(SAAT)이 W. somnifera 잎(a) 및 싹 팁(b) 외식식물의 형질전환 빈도에 미치는 영향
(연구 및 그래픽: © Dehdashti et al., 2016)

코튼의 초음파 보조 변환

Hussain et al. (2007)은 초음파 처리 보조 면화 변형의 유익한 효과를 입증합니다. 저주파 초음파로 인한 음향 캐비테이션은 식물 조직 표면 (sonoporation)의 표면과 아래에 미세 상처를 만들고 아그로박테리움이 식물 조직 전체에 걸쳐 더 깊고 완전하게 여행 할 수있게합니다. 이 상처 입은 패션은 조직 깊숙이 누워있는 식물 세포를 감염시킬 가능성을 증가시킵니다. SAAT의 형질전환 효율을 평가하기 위하여, GUS 유전자 발현을 측정하였다. GUS 리포터 시스템은 리포터 유전자 시스템으로, 특히 식물 분자 생물학 및 미생물학에 유용하다. 다양한 SAAT 파라미터를 조정하면, 성숙한 배아를 외식성으로 사용하는 면화에서의 GUS 일시적 발현이 상당히 향상되었다. GUS는 외식식물의 인큐베이션 후 24h까지 처음 검출되었고, 48h에 의해, GUS 발현은 매우 강렬하였고, 이는 초음파 처리 보조 아그로박테리움 매개 형질전환(SAAT)에 이어 목화 외식편의 성공적인 형질전환의 유용한 지표로서 작용하였다. 다양한 형질전환 기술 (즉, 생물학적, Agro, BAAT, SAAT), 초음파 처리 보조 아그로박테리움 매개 형질전환 (SAAT)의 비교는 지금까지 형질전환의 가장 좋은 결과를 보여주었습니다.

GUS의 일시적인 발현에 기초한 변형 절차의 선택. 초음파 처리-보조 아그로박테리움-매개 형질전환 (SAAT)은 상당히 더 높은 과도 발현을 나타낸다.
(연구 및 그래픽: © Hussain et al., 2007)

Sonoporation 및 SAAT를 위한 고성능 초음파 솔루션

Hielscher 초음파는 실험실, 연구 시설 및 매우 높은 처리량을 가진 산업 생산을위한 고성능 초음파 발생기의 개발 및 제조에 오랜 경험을 가지고 있습니다. 미생물학 및 생명 과학을 위해 Hielscher는 특정 조직 및 치료에 필요한 다양한 요구 사항을 수용 할 수있는 다양한 솔루션을 제공합니다. 수많은 샘플의 동시 초음파 처리를 위해 Hielscher는 멀티 웰 플레이트 용 UIP400MTP, 최대 10 개의 바이알 (예 : Eppendorf 튜브) 또는 초음파 CupHorn의 초음파 처리를위한 VialTweeter를 제공합니다. 프로브 형 초음파 발생기는 실험실 균질 기로 50 ~ 400 와트에서 사용할 수 있으며 산업 시스템은 500 와트에서 16kW까지의 전력 범위를 포괄합니다.
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아래 표는 초음파 장비의 대략적인 처리 용량을 보여줍니다.