초음파를 이용한 식물 세포의 유전자 형질전환

SAAT(Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation)는 Agrobacterium을 수송체로 사용하여 외부 유전자로 식물 세포를 감염시키는 효율적인 방법입니다. 초음파 캐비테이션은 식물 조직의 표적 미세 상처로 설명 될 수있는 초음파 형성을 유발합니다. 이러한 초음파를 통해 미세 상처를 생성하면 DNA 및 DNA 벡터를 세포 기질로 효율적으로 운반 할 수 있습니다.

sonoporation – 초음파로 강화된 세포 형질전환

저주파 초음파(약 20kHz)가 세포 현탁액에 적용되면 음향 캐비테이션의 영향으로 세포 조직에 일시적인 막 투과화가 발생합니다. 이 초음파 효과는 초음파 파공으로 알려져 있으며 세포나 조직으로의 유전자 전달에 사용됩니다.
초음파의 장점은 비열적 기계적 작동 원리를 기반으로하며, 이는 초음파 처리를 종종 더 다재다능하고 세포 유형에 덜 의존하게합니다. 초음파 처리의 다양한 응용 분야는 복잡한 인간 치료 단백질의 생물 생산에 상당한 잠재력을 가진 형질 전환 식물의 활용 가능성을 열어줍니다. 이러한 식물 기반 생물 반응기는 유전자 조작이 용이하고, 인간 병원체에 의한 잠재적 오염을 방지하며, 형질 전환 매개 박테리아(예: Agrobacterium)를 손상시키지 않으며, 저렴하고 효과적인 생합성 방법입니다.

초음파 보조 세포 형질전환

초음파 처리는 저주파 초음파를 적용하여 용액의 입자를 교반하고 용액을 혼합하여 물질 전달 및 용해 속도를 높이는 기술입니다. 동시에, 초음파 처리는 액체에서 용해 된 가스를 제거 할 수 있습니다. 식물 변형에서 초음파 처리는 식물 조직에 미세 상처를 형성하고 식물 원생 체형으로의 벌거 벗은 DNA의 전달을 향상시킵니다.

유전 형질전환의 경우, SAAT(Sonication-Assisted Agrobacterium-mediated Transformation)가 선호되는 방법이며, 벌거벗은 DNA 및 DNA 벡터를 프로토플라스트로 직접 전달하는 데 사용되는 초음파검사보다 훨씬 더 높은 효율을 갖는다. 수많은 연구에 따르면 초음파 보조 Agrobacterium 매개 변환 (SAAT)은 초음파와 그로 인한 음향 캐비테이션에 의해 식물 세포에 기계적 파괴 및 상처 형성을 유도하는 데 사용될 수 있습니다. 짧은 초음파 치료는 외식물 표면에 미세 상처를 만듭니다. 상처 입은 세포는 Agrobacterium이 식물 조직의 더 깊은 부분으로 침투 할 수 있도록하여 식물 세포가 감염 될 가능성을 높입니다. 또한 분비된 페놀 화합물은 변형을 촉진합니다. 초음파로 생성된 미세 상처는 박테리아에 의한 식물 침투를 더욱 가능하게 합니다. SAAT는 특히 Agrobacterium에 내성이 있는 것으로 간주되는 식물 종의 유전적 변형에 성공적으로 사용되었습니다.
매우 간단하고 저렴한 방법일 뿐만 아니라 Agrobacterium 매개 유전자 전달의 상당한 향상이 SAAT의 주요 장점입니다. Chenopodium rubrum L. 및 Beta vulgaris L.의 형질전환에 SAAT를 성공적으로 적용한 것 외에도, 이 접근법은 조류에서 가장 높은 전신 LT-B 특이적 IgG 역가가 검출된 니코티아나 타바쿰에서 재조합 대장균 야생형 열 불안정 홀로톡신 및 대장균 돌연변이 LT 백신 보조제 생산에도 적용되었습니다.
(참조: Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka and R. Baranski, 2014)

식물 세포에서 Sonoporation을 통한 유전자 전달을 위한 일반 절차

1. 유전 물질의 준비: 식물 세포에 도입하려는 유전 물질을 준비하는 것으로 시작하십시오. 이것은 플라스미드 DNA, RNA 또는 기타 핵산일 수 있습니다.
2. 식물 세포 분리: 표적으로 삼고자 하는 식물 세포를 분리합니다. 실험에 따라 이러한 세포는 식물 조직 또는 배양물에서 분리될 수 있습니다.
3. 세포 현탁액: 식물 세포를 적절한 배지 또는 완충액에 현탁시킵니다. 이것은 세포가 건강하고 유전자 흡수에 도움이 되는 상태에 있는지 확인하는 데 필수적입니다.
4. Sonicator 설정 : 진폭, 시간, 에너지 및 온도와 같은 매개 변수를 사전 설정 한 초음파 처리로 프로브 형 초음파 발생기를 준비하십시오. 초음파 프로브를 셀 현탁액에 담그십시오.
5. 쥡니다: 초음파 처리 절차를 시작하십시오. 프로브 팁의 빠른 진동은 액체에 캐비테이션 기포를 생성합니다. 이 기포는 초음파로 인해 팽창 및 붕괴되어 서스펜션에 기계적 힘과 마이크로 스트리밍을 생성합니다.
6. 소포포레이션: 캐비테이션에 의해 생성된 기계적 힘과 미세스트리밍은 식물 세포의 막에 일시적으로 기공과 구멍을 만듭니다. 현탁액에 존재하는 유전 물질은 이러한 기공을 통해 식물 세포로 들어갈 수 있습니다.
7. 잠복: 초음파 처리 후 식물 세포를 배양하여 막을 회복하고 안정화 할 수 있도록합니다. 이는 세포의 생존과 성공적인 유전자 전달을 보장하기 위한 중요한 단계입니다.

아그로박테리움(Agrobacterium) 또는 리포좀(Liposome)을 통한 유전자 전달

식물 세포를 transfection하는 데는 두 가지 일반적인 형태가 있습니다. 그들은 그람 음성 박테리아의 속인 아그로박테리아(agrobacterium) 또는 유전 물질의 운반체로 리포솜을 사용합니다.

• Agrobacterium-Mediated Sonoporation: Agrobacterium tumefaciens는 식물 유전 공학에서 일반적으로 사용되는 박테리아입니다. 이 방법에서는 원하는 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA를 Agrobacterium에 도입한 다음 식물 세포와 혼합합니다. 세포 현탁액은 프로브 형 초음파 발생기를 사용하여 초음파 작용을받습니다. 초음파 에너지는 Agrobacterium에서 식물 세포로의 유전 물질의 전달을 향상시킵니다. 이 방법은 식물의 유전자 변형에 널리 사용됩니다.
• 리포솜 매개 Sonoporation: 리포좀은 유전 물질을 운반할 수 있는 지질 기반 소포입니다. 이 방법에서는 플라스미드 DNA 또는 기타 핵산이 로드된 리포좀을 식물 세포와 혼합합니다. 프로브 형 초음파 발생기를 사용한 Sonoporation은 식물 세포의 리포솜 흡수를 촉진하기 위해 사용됩니다. 초음파는 리포좀의 지질 이중층을 파괴하여 유전 물질을 식물 세포로 방출합니다. 이 접근법은 식물 세포의 일시적인 유전자 발현 연구에 유용합니다.

SAAT(Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation)의 과학적으로 입증된 이점

SAAT(Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation)는 수많은 식물 종에 적용되었습니다. 식물 세포 배양에 대한 짧고 상대적으로 가벼운 초음파 처리는 초음파 형성을 유발하여 유전자 수송체로서 Agrobacterium의 깊은 침투를 허용합니다. 아래에서 SAAT의 유익한 효과를 입증하는 모범적인 연구를 읽을 수 있습니다.

Ashwagandha의 초음파 보조 변환

W. somnifera (ashwagandha 또는 겨울 체리로 알려짐)의 변형 효율을 향상시키기 위해 Dehdashti와 동료 (2016)는 아세토시린곤 (AS) 및 초음파 처리의 사용을 조사했습니다.
아세토시링곤(AS)은 아그로박테리움 액체 배양, 아그로박테리움 감염 및 아그로박테리움과 외식물 공동 배양의 세 단계로 첨가되었습니다. 아그로박테리움(Agrobacterium) 액체 배양액에 75μM AS를 첨가하는 것이 vir 유전자 유도에 최적인 것으로 나타났습니다.
초음파 처리 (SAAT)의 추가 적용은 가장 높은 유전자 발현을 초래했습니다. 털이 많은 뿌리에서 gusA 유전자 발현은 잎과 새싹 끝을 각각 10초와 20초 동안 초음파 처리했을 때 가장 좋은 것으로 밝혀졌습니다. 개선된 프로토콜의 형질전환 효율은 잎과 새싹 팁 이식의 경우 각각 66.5%와 59.5%를 기록했다. 다른 프로토콜과 비교했을 때, 이 개선된 프로토콜의 변형 효율은 잎의 경우 2.5배, 새싹 끝의 경우 3.7배 더 높은 것으로 나타났습니다. 서던 블롯 분석은 W1-W4 라인에서 gusA 전이유전자의 1-2개 카피를 확인한 반면, 개선된 프로토콜에 의해 생성된 W5 라인에서 1-4개의 전이유전자 카피가 검출되었습니다.

W. somnifera 잎 (a) 및 새싹 팁 (b) explants의 변형 빈도에 대한 초음파 보조 Agrobacterium 매개 변환 (SAAT) 기간의 효과
(연구 및 그래픽: © Dehdashti et al., 2016)

목화의 초음파 보조 변형

Hussain et al. (2007)은 초음파 처리 보조 면화 변형의 유익한 효과를 보여줍니다. 저주파 초음파로 인한 음향 캐비테이션은 식물 조직의 표면 위와 아래에 미세 상처를 생성하고(초음파 파열) Agrobacterium이 식물 조직 전체에 더 깊고 완전하게 이동할 수 있도록 합니다. 이러한 상처 치료는 조직 깊숙한 곳에 있는 식물 세포를 감염시킬 확률을 높입니다. SAAT의 형질전환 효율을 평가하기 위해 GUS 유전자 발현을 측정하였다. GUS 리포터 시스템은 리포터 유전자 시스템으로, 식물 분자 생물학 및 미생물학에서 특히 유용합니다. 다양한 SAAT 매개변수를 조정하면 성숙한 배아를 이식으로 사용하는 면화의 GUS 과도 발현이 크게 향상되었습니다. GUS는 외향 식물의 배양 후 24 시간 후에 처음 감지되었으며 48 시간까지 GUS 발현은 매우 강렬하여 초음파 처리 보조 Agrobacterium 매개 변환 (SAAT) 후 면화 외식물의 성공적인 변형을 나타내는 유용한 지표로 작용했습니다. 다양한 형질전환 기법 (즉, biolistic, Agro, BAAT, SAAT), 초음파 처리 보조 Agrobacterium 매개 형질전환 (SAAT)의 비교는 형질전환의 가장 좋은 결과를 보여주었습니다.

GUS의 일시적인 발현을 기반으로 한 변환 절차 선택. 초음파 처리 보조 아그로박테리움 매개 형질전환(SAAT)은 상당히 높은 과도 발현을 보여줍니다.
(연구 및 그래픽: © Hussain et al., 2007)

Sonoporation 및 SAAT를 위한 고성능 초음파 솔루션

Hielscher 초음파는 실험실, 연구 시설 및 매우 높은 처리량을 가진 산업 생산을위한 고성능 초음파의 개발 및 제조에 오랜 경험을 가지고 있습니다. 미생물학 및 생명 과학의 경우 Hielscher는 특정 조직 및 치료에 필요한 다양한 요구 사항을 수용 할 수있는 다양한 솔루션을 제공합니다. 수많은 샘플의 동시 초음파를 위해 Hielscher는 멀티웰 플레이트에 대한 UIP400MTP, 최대 10 개의 바이알 (예 : Eppendorf 튜브) 또는 초음파 CupHorn의 초음파 처리를위한 VialTweeter를 제공합니다. 프로브 형 초음파는 실험실 균질화기로 50에서 400 와트까지 사용할 수 있으며 산업 시스템은 500 와트에서 16kW까지의 전력 범위를 커버합니다.
당사에 연락하여 귀하의 응용 프로그램 및 프로세스 요구 사항에 대해 알려주십시오. 경험이 풍부한 직원이 생물학적 과정에 가장 적합한 초음파를 추천하게되어 기쁩니다.
아래 표는 초음파기의 대략적인 처리 용량을 나타냅니다.