VialTweeter 초음파 처리기를 이용한 알파-시누클레인 단편화

과학 연구에서는 α-시누클레인 원섬유와 리본을 단편화하여 더 작은 원섬유 조각이나 개별 단백질 분자까지 생성하며, 이를 다양한 실험 기법으로 더욱 쉽게 분석할 수 있습니다. VialTweeter 초음파 처리기는 효율적이고 신뢰할 수 있는 알파-시누클레인 단편화를 위해 가장 널리 사용되는 초음파 처리기 중 하나입니다.

연구에서의 α-시누클레인

알파-시누클레인 원섬유는 파킨슨병 및 루이소체 치매를 포함한 특정 형태의 치매와 같은 신경퇴행성 질환과 밀접하게 연관된 단백질 응집체입니다. 알파-시누클레인 원섬유 연구는 질병 진행에서 이들의 역할을 이해하고 잠재적인 치료적 중재법을 개발하는 것을 목표로 합니다. 연구자들은 알파-시누클레인 원섬유를 더 작은 조각으로 분해하여 이들의 구체적인 구조적 특징을 조사할 수 있습니다. 예를 들어, 알파-시누클레인 원섬유를 단편화하면 단백질, 지질 또는 소분자와 같은 다른 분자와의 상호작용을 조사할 수 있습니다. 더 작은 조각을 생성하면 이러한 상호작용 상대에 대한 결합 부위와 친화도를 더욱 효과적으로 탐색할 수 있습니다. 더 작은 α-Syn 원섬유와 리본은 독성과 생화학적 효과도 달라질 수 있습니다. 따라서 빠르고 간단한 시료 처리로 재현성 있는 결과를 얻을 수 있는 신뢰할 수 있고 효율적인 단편화 기법이 매우 중요합니다.
초음파를 이용한 Alpha-Syn 단편화: VialTweeter 초음파 처리기는 완전히 동일한 조건에서 최대 10개의 바이알을 동시에 초음파 처리하는 확립된 초음파 시료 전처리 시스템입니다. 프로그래밍 가능한 설정을 통해 동일한 실험을 간단하고 빠르게 반복 실행할 수 있어, 알파-시누클레인 원섬유 단편화에서 신뢰성과 재현성이 매우 높은 결과를 얻을 수 있습니다.

초음파 처리기를 이용한 α-시누클레인 시료 전처리

알파-시누클레인 원섬유를 연구하는 한 가지 접근법은 초음파 처리와 같은 기법으로 원섬유를 추출하고 단편화하는 것입니다. 초음파 처리는 고강도 저주파 초음파를 사용하여 단백질 응집체를 파쇄하고 분해함으로써 더 작은 원섬유나 개별 단백질 분자가 방출되도록 하는 공정입니다. VialTweeter 초음파 처리기는 α-시누클레인 관련 연구에서 이러한 목적으로 널리 사용되는 장치입니다.

수많은 연구에서 효율적이고 신뢰할 수 있는 α-시누클레인 원섬유 단편화를 위해 Hielscher VialTweeter를 사용하는 정밀한 알파-시누클레인 원섬유 초음파 처리 시료 전처리 프로토콜을 기술하고 있습니다. 연구자들은 원섬유를 초음파로 단편화하여 생성물을 분석하고 그 구조, 독성 및 다른 분자와의 상호작용을 조사할 수 있습니다. 이러한 연구는 신경퇴행의 기저 메커니즘에 대한 중요한 통찰을 제공하며, 새로운 치료 표적을 찾아내는 데에도 도움이 될 수 있습니다. VialTweeter 초음파 처리기를 사용하는 잘 확립된 α-시누클레인 초음파 처리 프로토콜을 통해 신뢰할 수 있고 재현성 있는 결과를 얻을 수 있습니다.

상단 이미지: 단편화하지 않은 알파-시누클레인 원섬유
하단 이미지: VialTweeter 초음파 처리기로 초음파 단편화한 알파-시누클레인 원섬유
(연구 및 이미지: ©Dieriks et al., 2022)

α-시누클레인 원섬유의 초음파 단편화 – 프로토콜

수많은 연구자가 균일한 α-시누클레인 원섬유 조각을 생성하기 위해 VialTweeter 초음파 처리기를 선호하는 단편화 기법으로 사용하므로, 확립된 프로토콜을 쉽게 찾아볼 수 있습니다. 아래에서 몇 가지 단편화 프로토콜의 예를 확인할 수 있습니다.
 

 
ClearTau 시드 준비: ClearTau 원섬유를 dH2O로 10 μM까지 희석하고, VialTweeter가 장착된 UP200St 초음파 처리기를 사용하여 튜브 내에서 70 % 진폭으로 1 s 작동, 1 s 정지 주기를 반복하며 50 s 동안 초음파 처리했습니다. 시드의 특성은 전자현미경으로 분석했습니다.
ThS 형광 측정: ClearTau 섬유를 dH2O로 2.5 μM까지 희석하고, VialTweeter가 장착된 UP200St를 사용하여 튜브 내에서 진폭 70 %, 1 s 작동 및 1 s 정지 주기로 50 s 동안 초음파 처리하였다. 2.5 μM 전장 Tau 4R2N 단량체를 대조군으로 사용하였다. 100 μl 반응액에 ThS(10 μM) 100 μl를 첨가하여 최종 단백질 농도를 1.25 μM로 맞추었다. FLUOstar Omega 마이크로플레이트 리더에 장착한 투명 바닥 96웰 플레이트를 사용하여 단일 시점의 ThS 형광을 측정하였으며, 여기 파장은 445 nm로 설정하고 485 nm에서 방출되는 형광을 기록하였다.
(cf. Limorenko et al., 2023)
 
초음파 처리를 통한 균일한 α-시누클레인 길이 확보: α-syn 섬유와 리본의 길이 이질성은 진폭 75%, 펄스 0.5 s로 설정한 VialTweeter에서 2-ml Eppendorf 튜브를 얼음 위에 놓고 20 min 동안 초음파 처리하여 줄였다.
(cf. Bousset et al., 2013)
 
인간 재조합 단량체 WT 또는 S129A a-Syn과 이들이 형성하는 섬유성 다형체 및 a-Syn 1–110에 대한 품질 관리를 수행하였다. 이어서 VialTweeter 초음파 처리기에서 2-mL Eppendorf 튜브를 사용하여 섬유성 다형체를 20 min 동안 초음파 처리로 단편화하여, 세포내이입에 적합한 평균 크기 42–52 nm의 섬유성 입자를 생성하였다.
(cf. Shrivastava et al., 2020)
 

다섯 가지 섬유성 α-Syn 다형체의 특성 분석. (A) 음성 염색한 α-Syn 섬유성 다형체인 fibrils, ribbons, fibrils-91, fibrils-65 및 fibrils-110의 VialTweeter 단편화 전(위쪽 줄)과 후(아래쪽 줄)의 투과전자현미경 사진을 제시하였다. (B) 단편화된 섬유성 다형체의 길이 분포를 제시하였다. 히스토그램을 산출하는 데 사용한 섬유성 집합체의 수(n)를 표시하였다.
(연구 및 이미지: Shrivastava et al., 2020)

 
α-Syn 섬유를 VialTweeter에서 2 ml Eppendorf 튜브를 사용하여 20 min 동안 초음파 처리로 단편화하여 섬유성 입자를 생성하였으며, TEM 분석으로 평가한 평균 크기는 42–52 nm였다.
(cf. Negrini et al., 2022)
 
PBS에 재현탁한 fibrils91은 세포 배양물에 첨가하기 전에 Vial Tweeter 초음파 처리기에서 2 mL Eppendorf 튜브를 사용하여 20 min 동안 초음파 처리로 단편화한 후, 분주하고 액체 질소에서 급속 동결하여 사용할 때까지 -80 ̊C에서 보관하였다.
(cf. Vajhøj et al., 2021)
 

α-Syn 단편화를 위한 VialTweeter 및 실험실용 초음파 처리기

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