UIP400MTP Sonicator를 사용한 프리온의 고처리량 검출을 위한 PMCA

UIP400MTP 멀티웰 플레이트 초음파 발생기는 단백질 오접힘 순환 증폭(PMCA)에서 고처리량 시료 준비를 위한 강력한 솔루션을 제공합니다. 여러 웰에 걸쳐 균일한 에너지 분포를 제공하고 정확한 초음파 처리 매개변수를 유지함으로써 이 시스템은 탁월한 재현성을 가진 수많은 샘플을 동시에 처리할 수 있습니다. 이러한 기능은 분석 억제제가 결과를 모호하게 할 수 있는 타액과 같은 까다로운 생물학적 샘플에서 낮은 농도의 프리온을 검출하도록 PMCA를 최적화하는 데 매우 중요합니다.

자궁경부의 만성 소모성 질환(CWD) 및 인간의 크로이츠펠트-야콥병(CJD)과 같은 프리온 질환은 잘못 접힌 프리온 단백질(PrP^{사우스 캐롤라이나}). 이러한 질병은 종종 타액, 혈액 및 소변과 같은 체액에서 낮은 수준의 감염성 프리온을 포함하므로 진단과 연구가 복잡합니다. 환경 매트릭스에서 흘린 프리온을 통한 CWD의 수평 전염은 야생 동물 관리 및 생태 건강에 특히 중요한 영향을 미칩니다. 마찬가지로, 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease)과 같은 질병의 경우, 인간 샘플에서 잘못 접힌 프리온 단백질의 신뢰할 수 있는 증폭은 진단을 발전시키고 질병 진행을 이해하는 데 매우 중요합니다.

수정된 PMCA 프로토콜을 적용하면 일반적인 분석 억제제(예: 타액 내 뮤신)를 우회하고 실시간 진동 유도 변환(RT-QuIC)과 같은 기술을 사용하여 검출할 수 없거나 모호한 프리온을 검출하는 데 있어 높은 감도를 달성할 수 있습니다. 이러한 발전은 다양한 질병에 대한 프리온 검출을 향상시켜 PMCA를 프리온 연구 및 진단에 없어서는 안될 도구로 만들었습니다. 멀티웰 플레이트 초음파 발생기는 UIP400MTP 마이크로플레이트(예: 6웰, 24웰 또는 96웰 플레이트) 또는 튜브 랙의 바이알에 있는 수많은 샘플을 초음파 처리하는 고처리량 PMCA를 용이하게 합니다.

고처리량 PMCA(Protein Misfolding Cyclic Amplification) 프로토콜

다음 프로토콜을 사용하면 정확히 동일한 조건에서 많은 수의 시료를 효율적으로 처리할 수 있어 강력한 연구 결과를 얻을 수 있습니다.

시료 전처리

출발 물질:
다음을 통해 샘플을 준비합니다.

• PMCA 기질에서 사르코실 추출 펠릿을 재현탁.
• 뇌를 직접 스파이크하면 프리온 씨앗으로 혈액 샘플을 균질화하거나 혈액 샘플을 얻을 수 있습니다.

기판:

• PrP를 과발현하는 형질전환 마우스에서 제조한 10%(wt/vol) 뇌 균질액을 사용합니다.^C (예: Tg 마우스).
• 다음에서 뇌 조직을 균질화합니다.
  – 1× PBS입니다.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% 트리톤 X-100.
• 사용할 때까지 기판을 -80ºC에서 보관하십시오.

Microplate 또는 Tubes의 시료 설정:
튜브:

• 90 μL의 뇌 균질화 기질을 추가하고 10 μL의 샘플(예: 혈액, 뇌 균질액 또는 사르코실 펠릿)을 파종합니다.
• 각 0.2mL 튜브에 3개의 테프론 비드(직경 1.59mm 또는 2.38mm)를 넣습니다.
• UIP400MTP 초음파 발생기와 호환되는 랙에 튜브를 장착하십시오.

6-웰 마이크로플레이트:

• 5mL의 뇌 균질화 기질을 추가하고 웰당 500μL의 샘플로 시드합니다.
• 각 웰에 3개의 테프론 구슬을 추가합니다.

PMCA 절차

배치:
제조업체의 지침에 따라 튜브 랙 또는 6웰 마이크로플레이트를 UIP400MTP 초음파 발생기에 넣습니다.

사이클링 프로그램:
다음과 같이 144 PMCA 주기를 수행합니다.

• 배양: 37°C에서 29분 30초.
• 초음파 처리 : 60 % 진폭에서 30 초.
• 온도 모니터링: 플러그형 온도 센서를 사용하여 s를 모니터링합니다.ample 온도를 UIP400MTP 최대 48–50°C의 온도로 프로그래밍합니다.

후속 라운드:
144 사이클의 첫 번째 라운드를 완료한 후 증폭된 물질의 부분 표본을 전송합니다.

• 신선한 형질전환 마우스 뇌 균질화 기질에 10배 희석합니다.
• 후속 라운드에 대해 96 PMCA주기를 수행하여 동일한 초음파 처리 매개 변수를 유지합니다.
• 원하는 라운드 수(일반적으로 최대 5회) 동안 계속합니다.

PrP 검출^{사우스 캐롤라이나}

1. Proteinase K 소화:
   – Proteinase K(50μg/mL)로 37°C에서 1시간 동안 시료를 처리합니다.
   – SDS-sample 버퍼를 추가하고 10분 동안 끓여 분해를 종료합니다.
2. 웨스턴 블롯 분석:
   – 다음을 사용하여 분해된 시료를 분석합니다.
   – 6H4 또는 PRC1 항-PrP 항체.
   – SDS-PAGE를 수행하고 검출을 위해 PVDF 멤브레인으로 전송합니다.

 

 

더 확실한 결과를 위해 더 많은 시료 처리

UIP400MTP 멀티웰 플레이트 초음파 발생기는 단백질 오접기 순환 증폭(PMCA)의 효율성과 확장성을 크게 향상시켜 전통적으로 시간이 많이 소요되는 절차의 특성을 해결합니다. 96웰 플레이트에서 최대 96개의 샘플을 동시에 처리할 수 있도록 함으로써 이 시스템은 모든 웰에서 정확하고 균일한 초음파 처리 조건을 유지하면서 PMCA 워크플로우를 간소화합니다. 이 고처리량 기능은 수동 처리를 최소화하고 노동 집약적인 단계를 줄이며 재현성을 보장하여 프리온 연구에 없어서는 안될 도구입니다. 만성 소모성 질환 또는 크로이츠펠트-야콥 질환을 조사하는 경우, 이 UIP400MTP 보다 효율적으로 대규모 연구를 촉진하여 연구자들이 현대 진단 및 과학 응용 분야의 요구를 충족할 수 있도록 합니다.

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