UIP400MTP Microplate Sonicator를 사용한 아밀로이드 피브릴 형성

아밀로이드 원섬유는 결정과 마찬가지로 핵형성 과정과 그에 따른 성장 과정을 통해 형성됩니다. 그러나 핵형성의 높은 자유 에너지 장벽으로 인해 자발적인 아밀로이드 피브릴 형성은 장기간의 지연 단계 후에만 발생합니다. 초음파는 아밀로이드 핵형성을 유도하는 강력한 도구로 부상하여 섬유소 형성을 크게 가속화합니다. 티오플라빈 T(ThT) 형광을 사용하는 마이크로플레이트 리더와 결합하면 초음파를 통해 여러 샘플에서 동시에 아밀로이드 원섬유를 고처리량으로 검출할 수 있습니다.

UIP400MTP Microplate Sonicator를 사용한 초음파 유도 아밀로이드 피브릴 형성

UIP400MTP multi-well plate sonicator를 사용하면 동일한 품질의 아밀로이드 원섬유를 대량으로 연구 목적으로 신속하게 합성할 수 있습니다. 이 효율적인 접근 방식을 통해 단백질 아밀로이드 발생성을 연구할 수 있습니다. 이 기술은 투석 관련 아밀로이드증과 관련된 아밀로이드 생성 단백질인 β2-마이크로글로불린(β2-m)에서 입증된 바와 같이 빠르고 재현 가능한 아밀로이드 세동을 촉진합니다.

간단한 실험적 접근법: 초음파 유도 아밀로이드 세동

피브릴 형성을 유도하기 위해 96웰 마이크로플레이트를 UIP400MTP 멀티웰 플레이트 초음파 발생기의 중앙에 배치하여 모든 웰에서 균일한 초음파 노출을 보장합니다. 실험 조건은 다음과 같습니다.

1. 각 웰에는 5μM ThT가 보충된 0.2ml의 β2-마이크로글로불린 용액(0.3mg/ml, pH 2.5)이 포함되어 있습니다.
2. 플레이트는 1 분 초음파 처리 후 9 분의 일시 중지와 같은 초음파 처리 사이클을 거쳤습니다.
3. 초음파 처리 후, ThT 형광은 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 측정되었습니다.

(참조. So et al., 2011)

기존 교반과의 비교

전통적인 교반 방법과 비교하여, 초음파는 섬유소 형성의 지연 단계를 크게 줄였습니다. 기존의 마이크로플레이트 진탕 조건에서는 10개의 웰 중 1개만이 20시간 후에 ThT 형광이 증가한 것으로 나타났습니다. 대조적으로, 순환 초음파 처리 (15 분 초음파 처리 후 5 분 정지)를 사용하여 첫 번째 초음파 처리 직후 상당한 ThT 형광 증가가 감지되었습니다.

Fibrillation Kinetics의 급속한 가속

So et al. (2011)은 pH 2.5에서 β2-마이크로글로불린의 자발적 피브릴 형성이 초음파로 몇 시간에서 단 10-15분으로 가속화될 수 있음을 보여주었습니다.
원자력 현미경(AFM) 이미지는 15분마다 10분 초음파를 통해 생성된 원섬유가 10분마다 1분 초음파를 사용하여 형성된 원섬유와 형태학적으로 구별할 수 없음을 확인했습니다. 이는 초음파 유도 아밀로이드 세동의 재현성과 견고성을 강조합니다.

10분마다 1분 초음파화(i), 15분마다 10분 초음파화(ii) 및 초음파화 없이 파종(iii)에 의해 생성된 아밀로이드 피브릴의 AFM 이미지. 흰색 눈금 막대는 1μm를 나타냅니다.
연구 및 이미지: ©So et al., 2011

중성 pH 조건에서의 세동

중성 pH 조건에서도 1.5 시간의 지연 시간 후에 피브릴 형성이 달성되었으며, 이는 초음파가 핵 형성 및 성장에 대한 에너지 장벽을 크게 낮춘다는 것을 보여줍니다. 이것은 아밀로이드 세동이 주로 물리적 반응이며, 초음파가 효과적으로 감소시키는 핵 생성 에너지 장벽에 의해 크게 제한된다는 가설을 뒷받침합니다.

아밀로이드 관련 질환 연구에 미치는 영향

UIP400MTP 마이크로플레이트 초음파 처리기를 사용한 아밀로이드 원섬유의 쉽고 신뢰할 수 있는 형성은 알츠하이머병(AD) 연구 및 파킨슨병, 제2형 당뇨병 및 전신 아밀로이드 증후군과 같은 기타 아밀로이드 관련 질환에 중요한 의미를 갖습니다. 알츠하이머병에서 아밀로이드-β(Aβ) 응집은 주요 병리학적 특징이지만, 기존 방법의 긴 지연 단계와 가변성으로 인해 세동 역학을 연구하는 것은 여전히 어렵습니다. 초음파 유도 피브릴 형성은 핵형성을 가속화하여 높은 재현성과 감소된 변동성을 보장하며, 이는 잠재적인 억제제를 스크리닝하고 아밀로이드 생성 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다. 또한 UIP400MTP의 고처리량 기능을 통해 단백질 잘못 접힘 및 응집에 대한 대규모 조사를 수행할 수 있어 원섬유질 형성을 조절하고 잠재적으로 신경퇴행성 진행을 완화할 수 있는 치료제의 발견을 촉진할 수 있습니다.

이 연구는 아밀로이드 피브릴 형성을 가속화하기 위한 고효율 방법으로 UIP400MTP 멀티웰 플레이트 초음파 처리기를 사용하여 초음파를 확립합니다. 이 접근 방식의 주요 이점은 다음과 같습니다.

• 세동에 대한 지연 시간이 크게 단축됩니다.
• 모든 웰에서 균일한 초음파 노출로 재현 가능한 원섬유 형성이 가능합니다.
• 고처리량 스크리닝 기능으로 단백질 아밀로이드원성의 게놈 전체 검색에 적합합니다.

초음파와 ThT 형광 검출을 통합함으로써이 방법은 아밀로이드 세동 연구를위한 빠르고 확장 가능하며 신뢰할 수있는 플랫폼을 제공합니다. 효율성과 높은 처리량 잠재력을 감안할 때 이 접근 방식은 생물물리학 및 제약 연구를 위한 아밀로이드 원섬유의 손쉬운 합성을 촉진할 수 있으며 아밀로이드 관련 연구 및 약물 스크리닝을 위한 유망한 도구를 제공할 수 있습니다.