ულტრაბგერითი დამუშავება უჯრედების ლიზისთვის: უჯრედების დესტრუქცია და ექსტრაქცია
უჯრედების ულტრაბგერითი ლიზი არის ფართოდ გამოყენებული ნიმუშების მომზადების ტექნიკა თანამედროვე ბიოტექნოლოგიურ ლაბორატორიებში. მისი ძირითადი მიზანია უჯრედული მემბრანების ან მთლიანი უჯრედების დესტრუქცია, რათა მოხდეს უჯრედშიდა კომპონენტების, როგორიცაა ცილები, ნუკლეინის მჟავები ან ორგანელები, გამოთავისუფლება. ყოველდღიურ ლაბორატორიულ მუშაობაში ეს ნიშნავს, რომ ულტრაბგერითი დამუშავება არის სტანდარტული მეთოდი უჯრედების კონტროლირებადი დესტრუქციისა და ბიომოლეკულების ეფექტური ექსტრაქციისთვის. სონიკატორების მთავარი უპირატესობა მდგომარეობს მათ შესაძლებლობაში, ზუსტად არეგულირონ პროცესის კრიტიკული პარამეტრები, მათ შორის ულტრაბგერის ინტენსივობა, იმპულსური რეჟიმი და ტემპერატურა. ეს კონტროლი საშუალებას აძლევს მკვლევრებს მიაღწიონ საიმედო ლიზს და ამავდროულად მინიმუმამდე შეამცირონ მგრძნობიარე ბიომოლეკულების თერმული ან მექანიკური დაზიანება, რაც უზრუნველყოფს დამზოგველ, მაგრამ მაღალეფექტურ ექსტრაქციის პროცესს.
უჯრედების ლიზი სონიკატორების გამოყენებით
უჯრედების ულტრაბგერითი ლიზი იყენებს აკუსტიკურ კავიტაციას უჯრედული მემბრანების დესტრუქციისა და უჯრედშიდა მოლეკულების გამოთავისუფლებისთვის. Hielscher Ultrasonics გთავაზობთ კლასიკურ ზონდური ტიპის სონიკატორს, ასევე მრავალნიმუშიან სონიკატორებს სტერილური დამუშავებისთვის: VialTweeter-ს მრავალი სინჯარისა და ვიალისთვის და 96-ფოსოიანი ფირფიტის სონიკატორს UIP400MTP-ს სტანდარტული მიკროფირფიტებისთვის.
Hielscher Ultrasonics აწვდის მძლავრ არაკონტაქტურ სონიკატორებს ნიმუშების მომზადებისა და კლინიკური ანალიზისთვის. მრავალფოსოიანი ფირფიტის სონიკატორი UIP400MTP, VialTweeter, CupHorn და GDmini2 გამდინარე სონიკატორი ამუშავებენ ნიმუშებს სტერილურ პირობებში.
ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები UP100H (100 ვატი) და UP400St (400 ვატი): ულტრაბგერითი დამუშავება უჯრედების ლიზისა და ექსტრაქციისთვის.
ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები უჯრედების ლიზისა და ექსტრაქციისთვის
| ულტრაბგერითი მოწყობილობის ტიპი | გამოყენების ფოკუსი | ნიმუშის მოცულობა | ტიპური გამოყენების შემთხვევა | უპირატესობები | მოდელების მაგალითები |
|---|---|---|---|---|---|
| ზონდური ტიპის სონიკატორები | ერთნიმუშიანი ულტრაბგერითი დამუშავება | 0,1 mL-დან ~1000 mL-მდე | უჯრედების ლიზი, ცილების ექსტრაქცია, DNA/RNA ფრაგმენტაცია | ენერგიის ზუსტი კონტროლი; სხვადასხვა სონოტროდები; ოპტიმალური მცირე და საშუალო ნიმუშებისთვის | UP100H, UP200St, UP400St |
| VialTweeter / CupHorn | მრავალი დახურული ვიალის პარალელური დამუშავება | 8–10 ვიალი (თითოეული ~1–20 mL) | მრავალი უჯრედული სუსპენზიის სტანდარტიზებული ლიზი | თანაბარი ულტრაბგერითი დამუშავება; თავიდან აცილებს ჯვარედინ კონტამინაციას; გამეორებადი შედეგები | VialTweeter, CupHorn |
| 96-ფოსოიანი ფირფიტის სონიკატორი | მრავალფოსოიანი და მიკროტიტრული ფირფიტების ულტრაბგერითი დამუშავება | მიკროფირფიტის ფორმატი | მაღალი გამტარუნარიანობის სკრინინგი, პროტეომიკა, უჯრედული ანალიზები | ერთდროული, თანაბარი ულტრაბგერითი დამუშავება ფოსოებში; იდეალური მრავალნიმუშიანი სამუშაო პროცესებისთვის | UIP400MTP |
| გამდინარე კამერის რეაქტორები | უწყვეტი ულტრაბგერითი დამუშავება უფრო მაღალი მოცულობებისთვის | >1 L, მასშტაბირებადი | სამრეწველო მასშტაბის უჯრედების დესტრუქცია, ექსტრაქტების წარმოება | უწყვეტი დამუშავება; მასშტაბირებადი; სრული პროცესის კონტროლი (ამპლიტუდა, წნევა, ტემპერატურა) | UIP1000hdT, UIP2000hdT + გამდინარე კამერა |
| სტერილური / ირიბი ულტრაბგერითი დამუშავების სისტემები | კონტამინაციის გარეშე ნიმუშების დამუშავება | დამოკიდებული ვიალზე/სინჯარაზე/მიკროფირფიტაზე | მგრძნობიარე ნიმუშები, სტერილური გარემო, რეგულაციური პირობები | ზონდთან კონტაქტის გარეშე; თავიდან აცილებს ნიმუშებს შორის ნარჩენების გადატანას; გაწმენდას მინიმალური ძალისხმევა სჭირდება | VialTweeter, CupHorn, UIP400MTP |
ულტრაბგერითი დამუშავების გამოყენების უპირატესობები უჯრედების ლიზისთვის
უჯრედების ლიზისა და ექსტრაქციის სხვა მეთოდებთან შედარებით, უჯრედების ულტრაბგერით ლიზს აქვს რამდენიმე უპირატესობა:
- სისწრაფე: უჯრედების ულტრაბგერითი ლიზი და ექსტრაქცია არის სწრაფი მეთოდი, რომელსაც შეუძლია წამებში დაშალოს უჯრედები. ეს ბევრად უფრო სწრაფია, ვიდრე სხვა მეთოდები, როგორიცაა ჰომოგენიზაცია, გაყინვა-გალღობა ან ბურთულებიანი წისქვილით დაფქვა.
- ეფექტურობა: ულტრაბგერითი უჯრედების ლიზი და ექსტრაქცია შეიძლება გამოყენებულ იქნას მცირე, დიდი ან მრავალი ნიმუშის ერთდროულად დამუშავებისთვის, რაც მას უფრო ეფექტურს ხდის, ვიდრე სხვა მეთოდები, რომლებიც მოითხოვენ მცირე ნიმუშების ინდივიდუალურ დამუშავებას.
- ქიმიკატების გარეშე: უჯრედების ულტრაბგერითი ლიზი და ექსტრაქცია არის არაინვაზიური მეთოდი, რომელიც არ მოითხოვს აგრესიული ქიმიკატების ან ფერმენტების გამოყენებას. ეს მას იდეალურს ხდის იმ შემთხვევებისთვის, სადაც უჯრედული შიგთავსის მთლიანობის შენარჩუნებაა საჭირო. შესაძლებელია ნიმუშების არასასურველი კონტამინაციის თავიდან აცილება.
- მაღალი გამოსავლიანობა: უჯრედების ულტრაბგერითი ლიზითა და ექსტრაქციით შესაძლებელია უჯრედული შიგთავსის, მათ შორის DNA-ის, RNA-ისა და ცილების, მაღალი გამოსავლიანობით მიღება. ეს იმიტომ ხდება, რომ მაღალი სიხშირის ბგერითი ტალღები არღვევენ უჯრედის კედლებს და ათავისუფლებენ შიგთავსს გარემომცველ ხსნარში.
- ტემპერატურის კონტროლი: მოწინავე სონიკატორები ნიმუშის ტემპერატურის ზუსტი კონტროლის საშუალებას იძლევა. Hielscher-ის ციფრული სონიკატორები აღჭურვილია მიერთებადი ტემპერატურის სენსორით და ტემპერატურის მონიტორინგის პროგრამული უზრუნველყოფით.
- გამეორებადი: ულტრაბგერითი უჯრედული ლიზის პროტოკოლები მარტივად გამეორებადია და შეიძლება მორგდეს სხვადასხვა, უფრო დიდ ან მცირე ნიმუშის მოცულობებს მარტივი წრფივი მასშტაბირების გზით.
- მრავალფუნქციური: ულტრაბგერითი უჯრედული ლიზი და ექსტრაქცია შეიძლება გამოყენებულ იქნას უჯრედების ფართო სპექტრის, მათ შორის ბაქტერიების, საფუარის, სოკოების, მცენარეული და ძუძუმწოვართა უჯრედების ექსტრაქციისთვის. ის ასევე შეიძლება გამოყენებულ იქნას სხვადასხვა ტიპის მოლეკულების, მათ შორის ცილების, დნმ-ის, რნმ-ის და ლიპიდების ექსტრაქციისთვის.
- მრავალი ნიმუშის ერთდროული მომზადება: Hielscher Ultrasonics გთავაზობთ რამდენიმე გადაწყვეტას მრავალი ნიმუშის მოსახერხებლად დასამუშავებლად პროცესის ზუსტად ერთნაირ პირობებში. ეს ლიზისა და ექსტრაქციისთვის ნიმუშების მომზადების ეტაპს მაღალეფექტურს ხდის და დროს ზოგავს.
- მარტივი გამოსაყენებელი: ულტრაბგერითი უჯრედული ლიზისა და ექსტრაქციის აღჭურვილობა მარტივად გამოსაყენებელია და მინიმალურ სწავლებას მოითხოვს. აღჭურვილობა ასევე ეკონომიურია, რადგან ის წარმოადგენს ერთჯერად ინვესტიციას და არ საჭიროებს ერთჯერადი სახარჯი მასალების განმეორებით შეძენას. ეს მას მიმზიდველს ხდის მკვლევართა და ლაბორატორიების ფართო სპექტრისთვის.
ზოგადად, ულტრაბგერითი უჯრედული ლიზი და ექსტრაქცია არის სწრაფი, ეფექტური, ზუსტად კონტროლირებადი და მრავალფუნქციური მეთოდი უჯრედული შიგთავსის ექსტრაქციისთვის. მისი უპირატესობები ალტერნატიულ მეთოდებთან შედარებით მას მიმზიდველ არჩევანს ხდის კვლევითი და სამრეწველო გამოყენების ფართო სპექტრისთვის.
ულტრაბგერითი უჯრედული ლიზის მოქმედების პრინციპი
ულტრაბგერითი უჯრედული ლიზი და ექსტრაქცია იყენებს მაღალი სიხშირის ბგერით ტალღებს უჯრედების დასაშლელად და მათი შიგთავსის ამოსაღებად. ბგერითი ტალღები ქმნის წნევის ცვლილებებს გარემომცველ სითხეში, რაც იწვევს მცირე ბუშტუკების წარმოქმნასა და კოლაფსს პროცესში, რომელიც ცნობილია როგორც კავიტაცია. ეს ბუშტუკები წარმოქმნის ლოკალიზებულ, ძალიან ინტენსიურ მექანიკურ ძალებს, რომლებსაც შეუძლია უჯრედების დაშლა და მათი შიგთავსის გარემომცველ ხსნარში გამოთავისუფლება.
ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორის გამოყენებით უჯრედული ლიზი ჩვეულებრივ მოიცავს შემდეგ ეტაპებს:
- ნიმუში თავსდება მილში ან ჭურჭელში თხევად ბუფერთან ერთად.
- ულტრაბგერითი ზონდი თავსდება ნიმუშში და გამოიყენება დაახლოებით 20-30 kHz სიხშირის ბგერითი ტალღები.
- ულტრაბგერითი ტალღები იწვევს ოსცილაციას და კავიტაციას გარემომცველ სითხეში, რაც ქმნის ლოკალიზებულ ძალებს, რომლებიც არღვევენ უჯრედებს და გამოუშვებენ მათ შიგთავსს.
- ნიმუში ცენტრიფუგირდება ან ფილტრდება უჯრედული ნაშთების მოსაშორებლად, და ექსტრაქტირებული შიგთავსი იკრიბება შემდგომი ანალიზისთვის.
გავრცელებული ლიზის მეთოდების უარყოფითი მხარეები
ლაბორატორიებში მუშაობისას შესაძლოა უკვე შეგხვედრიათ უჯრედების ლიზის სირთულეები ტრადიციული მექანიკური ან ქიმიური ლიზის პროტოკოლების გამოყენებისას.
- მექანიკური ლიზი: მექანიკური ლიზის მეთოდებს, როგორიცაა როდინში სანაყით დაფქვა ან ფრანგული პრესის, ბურთულებიანი წისქვილის ან როტორ-სტატორის სისტემის გამოყენებით ჰომოგენიზაცია, ხშირად აკლია ზუსტი კონტროლისა და რეგულირების შესაძლებლობები. ეს ნიშნავს, რომ წისქვილით დაფქვამ და დანაყვამ შეიძლება სწრაფად წარმოქმნას სითბო და ძვრის ძალები, რომლებმაც შეიძლება დააზიანოს ნიმუში და გამოიწვიოს ცილების დენატურაცია. ეს მეთოდები ასევე შეიძლება დიდ დროს მოითხოვდეს და საჭიროებდეს საწყისი მასალის დიდ რაოდენობას.
- ქიმიური ლიზი: ქიმიური ლიზის მეთოდებმა, როგორიცაა დეტერგენტზე დაფუძნებული ლიზი, შეიძლება დააზიანოს ნიმუში ლიპიდური ორშრის დარღვევითა და ცილების დენატურაციით. ეს მეთოდები ასევე შეიძლება მოითხოვდეს მრავალ ეტაპს და ტოვებდეს ნარჩენ კონტამინანტებს, რომლებიც ხელს უშლის შემდგომ გამოყენებას. დეტერგენტის ოპტიმალური დოზის პოვნა დამატებითი სირთულეა.
- გაყინვა-გალღობის ციკლები: გაყინვა-გალღობის ციკლებმა შეიძლება გამოიწვიოს უჯრედული მემბრანების გახეთქვა, მაგრამ განმეორებითმა ციკლებმა ასევე შეიძლება გამოიწვიოს ცილების დენატურაცია და დეგრადაცია. ეს მეთოდი ასევე შეიძლება მოითხოვდეს მრავალ ციკლს, რასაც დიდი დრო სჭირდება და რაც ხშირად იწვევს უფრო დაბალ გამოსავლიანობას.
- ფერმენტული ლიზი: ფერმენტული ლიზის მეთოდები შეიძლება იყოს სპეციფიკური უჯრედების ზოგიერთი ტიპისთვის და მოითხოვდეს რამდენიმე ეტაპს, რაც მათ შრომატევადს ხდის და დიდ დროს მოითხოვს. ისინი ასევე წარმოქმნიან ნარჩენებს და მოითხოვენ ფრთხილ ოპტიმიზაციას ნიმუშის დეგრადაციის თავიდან ასაცილებლად. ფერმენტული ლიზის ნაკრებები ხშირად ძვირია. თუ თქვენს მიერ გამოყენებული ფერმენტული ლიზის პროცედურა არასაკმარის შედეგებს იძლევა, ულტრაბგერითი დამუშავება, როგორც სინერგისტული მეთოდი, შეიძლება იქნას გამოყენებული უჯრედული დესტრუქციის გასაძლიერებლად.
კონვენციური მექანიკური და ქიმიური უჯრედული ლიზის მეთოდებისგან განსხვავებით, ულტრაბგერითი დამუშავება არის უჯრედული დესინტეგრაციის უკიდურესად ეფექტური და საიმედო ინსტრუმენტი, რომელიც საშუალებას იძლევა სრული კონტროლი განხორციელდეს ულტრაბგერითი დამუშავების პარამეტრებზე. ეს უზრუნველყოფს მასალის გამოყოფისა და პროდუქტის სიწმინდის მაღალ სელექციურობას. [იხ. Balasundaram et al., 2009]
ის შესაფერისია ყველა ტიპის უჯრედისთვის და მარტივად გამოიყენება როგორც მცირე, ისე დიდი მასშტაბით – ყოველთვის კონტროლირებად პირობებში. ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები მარტივად იწმინდება. ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი ყოველთვის ფლობს ადგილზე გასუფთავების (CIP) და ადგილზე სტერილიზაციის (SIP) ფუნქციას. სონოტროდი შედგება მასიური ტიტანის რქისგან, რომელიც შეიძლება გაიწმინდოს ან გაირეცხოს წყლით ან გამხსნელით (დამუშავების გარემოდან გამომდინარე). ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორების მომსახურება მათი გამძლეობის გამო თითქმის არ საჭიროებს ყურადღებას.
ულტრაბგერითი ლიზი და უჯრედული დესტრუქცია
ზოგადად, ნიმუშების ლიზისს ლაბორატორიაში 15 წამიდან 2 წუთამდე სჭირდება. ვინაიდან ულტრაბგერითი დამუშავების ინტენსივობა ძალიან მარტივად რეგულირდება ამპლიტუდისა და დამუშავების დროის დაყენებით, ასევე შესაბამისი აღჭურვილობის შერჩევით, შესაძლებელია უჯრედული მემბრანების ძალიან ნაზი ან ძალიან მკვეთრი დესტრუქცია, უჯრედული სტრუქტურისა და ლიზისის მიზნის შესაბამისად (მაგ. დნმ-ის ექსტრაქცია მოითხოვს უფრო რბილ ულტრაბგერით დამუშავებას, ბაქტერიებიდან ცილების სრული ექსტრაქცია კი მოითხოვს უფრო ინტენსიურ ულტრაბგერით დამუშავებას). პროცესის დროს ტემპერატურის მონიტორინგი შესაძლებელია ინტეგრირებული ტემპერატურის სენსორით, ხოლო მისი კონტროლი – გაგრილებით (ყინულის აბაზანის ან გამაგრილებელი გარსების მქონე გამდინარე უჯრედების გამოყენებით) ან იმპულსურ რეჟიმში ულტრაბგერითი დამუშავებით. იმპულსურ რეჟიმში 1–15 წამის ხანგრძლივობის მოკლე ულტრაბგერითი ციკლები უზრუნველყოფს სითბოს გაფანტვასა და გაგრილებას ციკლებს შორის უფრო ხანგრძლივი პაუზების დროს.
ყველა ულტრაბგერითი პროცესი სრულად რეპროდუცირებადია და წრფივად მასშტაბირებადი.
VialTweeter არის ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი მრავალი ნიმუშის ერთდროული, ერთგვაროვანი და სწრაფი სტერილური მომზადებისთვის.
- უჯრედული სუსპენზიის მომზადება: უჯრედული ნალექი სრულად უნდა იყოს სუსპენდირებული ბუფერულ ხსნარში ჰომოგენიზაციის გზით (აირჩიეთ ბუფერული ხსნარი, რომელიც თავსებადია შემდგომ ანალიზთან, მაგ. კონკრეტულ ქრომატოგრაფიულ მეთოდთან). დაამატეთ ლიზოციმები და/ან სხვა დანამატები, საჭიროების შემთხვევაში (ისინიც უნდა იყოს თავსებადი გამიჯვნის/გაწმენდის საშუალებებთან). ნაზად აურიეთ ხსნარი ან მოახდინეთ მისი ჰომოგენიზაცია მსუბუქი ულტრაბგერითი დამუშავების პირობებში სრული სუსპენზიის მიღებამდე.
გაიგეთ მეტი ლიზოციმებისა და ულტრაბგერითი დამუშავების სინერგიის შესახებ! - ულტრაბგერითი ლიზა: მოათავსეთ ნიმუში ყინულის აბაზანაში. უჯრედული დესტრუქციისთვის, დაამუშავეთ სუსპენზია ულტრაბგერით 60-90 წამიანი იმპულსებით (გამოიყენეთ თქვენი ულტრაბგერითი დამუშავების აპარატის იმპულსური რეჟიმი).
- გამიჯვნა: ცენტრიფუგირეთ ლიზატი (მაგ. 10 წთ. 10 000 x g-ზე; 4degC-ზე). ფრთხილად გამოყავით სუპერნატანტი უჯრედული ნალექისგან. სუპერნატანტი არის მთლიანი უჯრედული ლიზატი. სუპერნატანტის ფილტრაციის შემდეგ მიიღებთ ხსნადი უჯრედული ცილების შემცველ გამჭვირვალე სითხეს.
ულტრაბგერითი დამუშავების ყველაზე გავრცელებული გამოყენებები ბიოლოგიასა და ბიოტექნოლოგიაში არის:
- უჯრედული ექსტრაქტის მომზადება
- საფუარის, ბაქტერიების, მცენარეული უჯრედების, რბილი ან მკვრივი უჯრედული ქსოვილის, ნუკლეინის მასალის დესტრუქცია
- ცილების ექსტრაქცია
- ფერმენტების მომზადება და იზოლაცია
- ანტიგენების წარმოება
- დნმ-ის ექსტრაქცია და/ან მიზნობრივი ფრაგმენტაცია
- ლიპოსომების მომზადება
უჯრედული დესტრუქცია ზონდური ტიპის ულტრაბგერითი დამუშავების აპარატით არის ნიმუშების მომზადების ეფექტური მეთოდი.
ულტრაბგერის მრავალფეროვანი გამოყენებები ვრცელდება ბიოტექნოლოგიის, ბიოინჟინერიის, მიკრობიოლოგიის, მოლეკულური ბიოლოგიის, ბიოქიმიის, იმუნოლოგიის, ბაქტერიოლოგიის, ვირუსოლოგიის, პროტეომიკის, გენეტიკის, ფიზიოლოგიის, უჯრედული ბიოლოგიის, ჰემატოლოგიის და ბოტანიკის სექტორებში.
ლიზა: უჯრედული სტრუქტურების დანგრევა
უჯრედები დაცულია ნახევრად გამტარი პლაზმური მემბრანით, რომელიც შედგება ფოსფოლიპიდური ორმაგი შრისგან (ასევე ცილა-ლიპიდური ორმაგი შრე; წარმოიქმნება ჰიდროფობური ლიპიდებისა და ჰიდროფილური ფოსფორის მოლეკულებისგან, რომლებშიც ჩაშენებულია ცილის მოლეკულები) და ქმნის ბარიერს უჯრედის შიდა სივრცესა (ციტოპლაზმასა) და უჯრედგარე გარემოს შორის. მცენარეული უჯრედები და პროკარიოტული უჯრედები გარშემორტყმულია უჯრედის კედლით. მრავალშრიანი, ცელულოზისგან შედგენილი სქელი უჯრედის კედლის გამო, მცენარეული უჯრედები უფრო რთულად ლიზდება, ვიდრე ცხოველური უჯრედები. უჯრედის შიდა კომპონენტებს, როგორიცაა ორგანელები, ბირთვი და მიტოქონდრია, ციტოსკელეტი სტაბილურობას ანიჭებს.
უჯრედების ლიზისას მიზანია ორგანელების, ცილების, დნმ-ის, მრნმ-ის ან სხვა ბიომოლეკულების ამოღება და გამოყოფა.
უჯრედების ლიზის ტრადიციული მეთოდები და მათი ნაკლებობები
არსებობს უჯრედების ლიზის რამდენიმე მეთოდი, რომლებიც იყოფა მექანიკურ და ქიმიურ მეთოდებად, მათ შორისაა დეტერგენტების ან გამხსნელების გამოყენება, მაღალი წნევის ზემოქმედება ან მარცვლოვანი წისქვილის ან ფრანგული პრესის გამოყენება. ამ მეთოდების ყველაზე პრობლემური ნაკლებობაა პროცესის პარამეტრებისა და შესაბამისად, ზემოქმედების კონტროლისა და რეგულირების სირთულე.
ქვემოთ მოცემული ცხრილი აჩვენებს ლიზის გავრცელებული მეთოდების მთავარ ნაკლებობებს:
ცხრილი: უჯრედების ლიზის ტრადიციულ მეთოდებს აქვთ მნიშვნელოვანი ნაკლებობები
ლიზის პროცედურა
ლიზისი მგრძნობიარე პროცესია. ლიზისის დროს უჯრედის მემბრანის დამცავი ფუნქცია ირღვევა, თუმცა თავიდან უნდა იქნას აცილებული გამოყოფილი ცილების ინაქტივაცია, დენატურაცია და დეგრადაცია არაფიზიოლოგიური გარემოს (pH-ის მნიშვნელობის გადახრის) გამო. ამიტომ, ზოგადად, ლიზისი ხორციელდება ბუფერულ ხსნარში. უმეტესი სირთულეები გამოწვეულია უჯრედების არაკონტროლირებადი დანგრევით, რაც იწვევს ყველა უჯრედშიდა მასალის არამიზნობრივ გამოთავისუფლებას და/ან სამიზნე პროდუქტის დენატურაციას.
ხშირად დასმული კითხვები ულტრაბგერითი დამუშავებისა და უჯრედების ლიზის შესახებ
- შესაძლებელია თუ არა უჯრედების ლიზა ულტრაბგერითი დამუშავებით? დიახ, ულტრაბგერითი დამუშავება ეფექტურად ახდენს უჯრედების ლიზისს მაღალი სიხშირის ულტრაბგერითი ტალღების გამოყენებით, რომლებიც იწვევს კავიტაციას – მოვლენას, რომლის დროსაც უჯრედულ სუსპენზიაში ორთქლის პატარა ბუშტუკები წარმოიქმნება და მკვეთრად კოლაფსირდება. შედეგად წარმოქმნილი მექანიკური ძალები არღვევს უჯრედის მემბრანებს და ხელს უწყობს უჯრედშიდა კომპონენტების გამოთავისუფლებას სითხეში.
- როგორ გამოვიყენოთ სონიკატორი უჯრედების ლიზისთვის? სონიკატორის გამოყენება უჯრედების ლიზისისთვის მოიცავს სონიკატორის ზონდის ჩაძირვას უჯრედულ სუსპენზიაში და ისეთი პარამეტრების რეგულირებას, როგორიცაა ამპლიტუდა და იმპულსის ხანგრძლივობა. პროცესს ყურადღებით უნდა ადევნოთ თვალყური, რათა ოპტიმალურად მოხდეს უჯრედების დაშლა და ამავდროულად მინიმუმამდე შემცირდეს ცილების დენატურაცია და ფერმენტების ინაქტივაცია.
- რა არის უჯრედების ლიზისთვის ულტრაბგერითი დამუშავების პრინციპი? ულტრაბგერითი დამუშავება მოქმედებს აკუსტიკური კავიტაციის პრინციპზე. ულტრაბგერითი ენერგია გადაეცემა თხევად გარემოს, რაც იწვევს წნევის სწრაფ რყევებს, რომლებიც მიკრობუშტუკების წარმოქმნასა და იმპლოზიას განაპირობებს. ეს იმპლოზიები წარმოქმნის ინტენსიურ ძვრის ძალებსა და ლოკალურ მაღალ ტემპერატურებს, რაც არღვევს უჯრედულ სტრუქტურებს და ზრდის ლიზატის ერთგვაროვნებას.
- რამდენი ხანი სჭირდება უჯრედების ლიზის ულტრაბგერით დამუშავებას? უჯრედების ლიზისთვის ულტრაბგერითი დამუშავების ხანგრძლივობა შეიძლება მნიშვნელოვნად განსხვავდებოდეს ისეთი ფაქტორების მიხედვით, როგორიცაა უჯრედის ტიპი, უჯრედების სიმკვრივე, სონიკატორის სიმძლავრე და გამოყენებული კონკრეტული პროტოკოლი. ტიპიკური პროცედურები შეიძლება მერყეობდეს რამდენიმე წამიდან რამდენიმე წუთამდე, ხშირად შესრულდება ციკლებში სითბოს წარმოქმნის მართვისა და უჯრედების ერთგვაროვანი დანგრევის უზრუნველსაყოფად.
- რა არის ულტრაბგერითი დამუშავების მიზანი ცილების ექსტრაქციისას? ცილების ექსტრაქციისას ულტრაბგერითი დამუშავება ემსახურება უჯრედის მემბრანების ეფექტურ დაშლასა და ცილების სოლუბილიზაციას. ეს მეთოდი განსაკუთრებით სასარგებლოა უჯრედული კომპარტმენტებიდან ცილების გამოთავისუფლებისთვის, რაც მას აუცილებელს ხდის იმ ლიზატების მოსამზადებლად, რომლებიდანაც ცილები შემდგომ უნდა გამოიყოს გასაწმენდად ან გასაანალიზებლად.
- რატომ გამოიყენება ულტრაბგერითი დამუშავება ექსტრაქციისთვის? ულტრაბგერითი დამუშავება პრიორიტეტულია ექსტრაქციისთვის მისი სწრაფი მოქმედებისა და მიზნობრივი ენერგიის გამოყენების შესაძლებლობის გამო, რაც არღვევს უჯრედულ სტრუქტურებს ბიოაქტიური მოლეკულების გამოთავისუფლებისთვის მკაცრი ქიმიური დამუშავების გამოყენების გარეშე, რითაც ინარჩუნებს ამოღებული ნაერთების ფუნქციურ მთლიანობას.
- არღვევს თუ არა ულტრაბგერითი დამუშავება ცილა-ცილა ურთიერთქმედებებს? მიუხედავად იმისა, რომ ულტრაბგერითი დამუშავება ეფექტურად არღვევს უჯრედის მემბრანებს, მან შეიძლება ასევე დაარღვიოს ცილა-ცილა ურთიერთქმედებები. დარღვევის დონე დამოკიდებულია ულტრაბგერითი დამუშავების ინტენსივობასა და ექსპოზიციის ხანგრძლივობაზე, რამაც შესაძლოა გამოიწვიოს ცილათა კომპლექსების დენატურაცია ან დისოციაცია, რაც გავლენას მოახდენს შემდგომ ანალიტიკურ ან ფუნქციურ კვლევებზე.
- შესაძლებელია თუ არა E. coli-ის ლიზისთვის ულტრაბგერითი დამუშავების გამოყენება? Hielscher-ის ულტრაბგერითი დამამუშავებლები განსაკუთრებით ეფექტურია ბაქტერიული უჯრედების, როგორიცაა E. coli, ლიზისთვის, რომლებსაც მყარი უჯრედის კედლები აქვთ. ეს ტექნიკა უზრუნველყოფს უჯრედის კედლისა და მემბრანის დასაშლელად ფიზიკურ მეთოდს, რაც მას პრეფერირებულ მეთოდად აქცევს ბაქტერიული ლიზატების მომზადებისთვის მოლეკულური ბიოლოგიისა და ბიოქიმიის ლაბორატორიებში.
- რა პროცესები მოსდევს ულტრაბგერითი დამუშავების ეტაპს?
ულტრაბგერითი ლიზის შემდეგ შემდგომი ეტაპები ჩვეულებრივ მოიცავს ლიზატის ფრაქციონირებას, ორგანელების მიზანმიმართულ იზოლაციას და ცილების შემდგომ ექსტრაქციას ან გასუფთავებას.
შემდეგ დამუშავებულ ლიზატს აცალკევებენ და ამზადებენ ანალიტიკური ან ფუნქციური გამოყენებისთვის, როგორიცაა მაღალი გარჩევადობის პროტეომიკა, ტრანსკრიპტომიკა ან რეცეპტორთან შეკავშირების კვლევები.
ლიტერატურა/გამოყენებული წყაროები
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.