Sonication for Lysis: უჯრედების დარღვევა და ექსტრაქცია

უჯრედების დაშლა ან ლიზისი ყოველდღიური ნიმუშის მომზადების ჩვეულებრივი ნაწილია ბიოტექნოლოგიურ ლაბორატორიებში. ლიზისის მიზანია უჯრედის კედლის ნაწილების ან მთლიანი უჯრედის დაშლა ბიოლოგიური მოლეკულების გასათავისუფლებლად. ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები ფართოდ გამოიყენება უჯრედების წარმატებული ლიზისისთვის. დახვეწილი ულტრაბგერითი აპარატების მთავარი უპირატესობა არის ზუსტი კონტროლი პროცესის პარამეტრებზე, როგორიცაა ინტენსივობა და ტემპერატურა, რაც საშუალებას იძლევა ნაზი, მაგრამ ძალიან ეფექტური უჯრედების დაშლა და მოპოვება.

უჯრედის ლიზისი ულტრაბგერის გამოყენებით

უჯრედების ულტრაბგერითი ლიზისი და ექსტრაქცია არის მეთოდი, რომელიც გამოიყენება ღია უჯრედების გასატეხად და შიგთავსის ამოღების მიზნით მაღალი სიხშირის ხმის ტალღების, ანუ ულტრაბგერის გამოყენებით. Sonication არის ლიზისის ტექნიკა, რომელიც ფართოდ გამოიყენება, როგორც უჯრედშიდა მასალის დაშლისა და ექსტრაქციის დამკვიდრებული და საიმედო მეთოდი. ულტრაბგერითი ლიზისი არის საიმედო ტექნიკა, რომ მოამზადოს ლიზატი, რომელიც შეიცავს, მაგალითად, პლაზმიდს, რეცეპტორების ანალიზს, ცილებს, დნმ, რნმ-ს და ა. თითოეული ნივთიერება და საშუალება დააკმაყოფილოს განაცხადის სპეციფიკური მოთხოვნები. ლიზისის შემდეგი საფეხურებია ფრაქცია, ორგანელების იზოლაცია ან/და ცილის ექსტრაქცია და გაწმენდა. მოპოვებული მასალა (= ლიზატი) უნდა გამოიყოს და ექვემდებარება შემდგომ გამოკვლევებს ან გამოყენებას, მაგ., პროტეომიული კვლევისთვის.

უჯრედების ლიზისა და ექსტრაქციის სხვა მეთოდებთან შედარებით, ულტრაბგერითი უჯრედების ლიზისს აქვს რამდენიმე უპირატესობა:

1. სიჩქარე: ულტრაბგერითი უჯრედების ლიზისი და ექსტრაქცია არის სწრაფი მეთოდი, რომელსაც შეუძლია გახსნილი უჯრედების გატეხვა რამდენიმე წამში. ეს ბევრად უფრო სწრაფია, ვიდრე სხვა მეთოდები, როგორიცაა ჰომოგენიზაცია, გაყინვა-დათბობა ან მძივების დაფქვა.
2. ეფექტურობა: უჯრედების ულტრაბგერითი ლიზისი და ექსტრაქცია შეიძლება გამოყენებულ იქნას მცირე, დიდი ან მრავალი ნიმუშის ერთდროულად დასამუშავებლად, რაც მას უფრო ეფექტურს ხდის, ვიდრე სხვა მეთოდები, რომლებიც საჭიროებენ მცირე ნიმუშების ინდივიდუალურ დამუშავებას.
3. ქიმიკატების გარეშე: უჯრედების ულტრაბგერითი ლიზისი და ექსტრაქცია არის არაინვაზიური მეთოდი, რომელიც არ საჭიროებს უხეში ქიმიკატების ან ფერმენტების გამოყენებას. ეს მას იდეალურს ხდის აპლიკაციებისთვის, სადაც საჭიროა უჯრედის შიგთავსის მთლიანობის შენარჩუნება. ნიმუშების არასასურველი დაბინძურების თავიდან აცილება შესაძლებელია.
4. Მაღალი სარგებელი: უჯრედების ულტრაბგერითი ლიზისა და ექსტრაქციის საშუალებით შესაძლებელია უჯრედული შიგთავსის, მათ შორის დნმ-ის, რნმ-ის და ცილების მაღალი მოსავლიანობა. ეს იმიტომ ხდება, რომ მაღალი სიხშირის ხმის ტალღები არღვევს უჯრედის კედლებს და ათავისუფლებს შიგთავსს მიმდებარე ხსნარში.
5. ტემპერატურის კონტროლი: დახვეწილი ულტრაბგერითი საშუალებას იძლევა ზუსტი ტემპერატურის კონტროლის ნიმუში. Hielscher ციფრული ულტრაბგერითი აღჭურვილია ჩართული ტემპერატურის სენსორით და ტემპერატურის მონიტორინგის პროგრამული უზრუნველყოფით.
6. რეპროდუცირებადი: ულტრაბგერითი უჯრედების ლიზის პროტოკოლები შეიძლება ადვილად რეპროდუცირდეს და შეესაბამებოდეს ნიმუშის სხვადასხვა უფრო დიდ ან მცირე მოცულობას მარტივი ხაზოვანი მასშტაბით.
7. მრავალმხრივი: ულტრაბგერითი უჯრედების ლიზისი და ექსტრაქცია შეიძლება გამოყენებულ იქნას უჯრედების ტიპების ფართო სპექტრის ამოსაღებად, მათ შორის ბაქტერიების, საფუარის, სოკოების, მცენარეებისა და ძუძუმწოვრების უჯრედების ჩათვლით. ის ასევე შეიძლება გამოყენებულ იქნას სხვადასხვა ტიპის მოლეკულების, მათ შორის ცილების, დნმ, რნმ და ლიპიდების ამოსაღებად.
8. მრავალი ნიმუშის ერთდროული მომზადება: Hielscher Ultrasonics გთავაზობთ რამდენიმე გამოსავალს მრავალი ნიმუშის კომფორტულად დასამუშავებლად ზუსტად იმავე პროცესის პირობებში. ეს ხდის ნიმუშის მომზადების ეტაპს ლიზისისა და ექსტრაქციის უაღრესად ეფექტურს და დაზოგავს დროს.
9. მარტივი გამოსაყენებელი: ულტრაბგერითი უჯრედების ლიზისისა და ექსტრაქციის მოწყობილობა მარტივი გამოსაყენებელია და მოითხოვს მინიმალურ მომზადებას. აღჭურვილობა ასევე ეკონომიურია, რადგან ეს არის ერთჯერადი ინვესტიცია, რომელიც არ მოითხოვს ხელახლა შესყიდვას. ეს მას მიმზიდველს ხდის მკვლევართა და ლაბორატორიების ფართო სპექტრისთვის.

მთლიანობაში, ულტრაბგერითი უჯრედების ლიზისი და ექსტრაქცია არის სწრაფი, ეფექტური, ზუსტად კონტროლირებადი და მრავალმხრივი მეთოდი უჯრედული შიგთავსის მოპოვებისთვის. მისი უპირატესობები ალტერნატიულ მეთოდებთან შედარებით მიმზიდველ არჩევანს აქცევს კვლევისა და სამრეწველო აპლიკაციების ფართო სპექტრისთვის.

ულტრაბგერითი უჯრედების ლიზისის მუშაობის პრინციპი

უჯრედების ულტრაბგერითი ლიზისი და ექსტრაქცია იყენებს მაღალი სიხშირის ხმის ტალღებს უჯრედების დასაშლელად და მათი შიგთავსის ამოღების მიზნით. ხმის ტალღები ქმნიან წნევის ცვლილებებს მიმდებარე სითხეში, რაც იწვევს პატარა ბუშტების წარმოქმნას და კოლაფსს, რომელიც ცნობილია როგორც კავიტაცია. ეს ბუშტები წარმოქმნიან ლოკალიზებულ უაღრესად ინტენსიურ მექანიკურ ძალებს, რომლებსაც შეუძლიათ ღია უჯრედების გატეხვა და მათი შიგთავსის მიმდებარე ხსნარში გაშვება.

უჯრედების ლიზისი ულტრაბგერითი აპარატის გამოყენებით ჩვეულებრივ მოიცავს შემდეგ ნაბიჯებს:

• ნიმუში მოთავსებულია მილში ან კონტეინერში თხევადი ბუფერით.
• ნიმუშში ჩასმულია ულტრაბგერითი ზონდი და მაღალი სიხშირის ხმის ტალღები დაახლ. გამოიყენება 20-30 kHz.
• ულტრაბგერითი ტალღები იწვევენ რხევას და კავიტაციას მიმდებარე სითხეში, წარმოქმნიან ლოკალიზებულ ძალებს, რომლებიც არღვევენ ღია უჯრედებს და ათავისუფლებენ მათ შიგთავსს.
• ნიმუში არის ცენტრიფუგირებული ან გაფილტრული ნებისმიერი ფიჭური ნარჩენების მოსაშორებლად, ხოლო ამოღებული შიგთავსი გროვდება ქვედა დინების ანალიზისთვის.

ძლიერი ულტრაბგერითი ტალღები არღვევს ბიოლოგიური სტრუქტურების უჯრედულ მატრიქსს და ათავისუფლებს ბიოაქტიურ ნაერთებს. გაძლიერებულია მასის გადატანა მცენარეულ მასალასა და გამხსნელს (მაგ. ბუფერს) შორის. (გრაფიკა: ©Vilkhu et al., 2006)

ლიზისის ჩვეულებრივი მეთოდების ნაკლოვანებები

ლაბორატორიებში მუშაობის დროს, შესაძლოა უკვე გამოგიცდიათ უჯრედების ლიზისის პრობლემა ტრადიციული მექანიკური ან ქიმიური ლიზის პროტოკოლების გამოყენებით.

• მექანიკური ლიზისი: მექანიკური ლიზისის მეთოდებს, როგორიცაა ნაღმტყორცნებით და ნაღმტყორცნებით დაფქვა ან ჰომოგენიზაცია ფრანგული პრესის, მძივების წისქვილის ან როტორ-სტატორის სისტემის გამოყენებით, ხშირად არ გააჩნიათ ზუსტი კონტროლი და კორექტირების ვარიანტები. ეს ნიშნავს, რომ დაფქვისა და დაფქვის გამოყენებამ შეიძლება სწრაფად წარმოქმნას სითბო და ათვლის ძალები, რამაც შეიძლება დააზიანოს ნიმუში და დენატურაცია მოახდინოს ცილებს. ისინი ასევე შეიძლება იყოს შრომატევადი და მოითხოვონ დიდი რაოდენობით საწყისი მასალა.
• ქიმიური ლიზისი: ქიმიური ლიზისის მეთოდებმა, როგორიცაა სარეცხი საშუალებებით დაფუძნებული ლიზი, შეიძლება დააზიანოს ნიმუში ლიპიდური ორშრის დარღვევით და ცილების დენატურირებით. მათ ასევე შეიძლება დასჭირდეთ რამდენიმე ნაბიჯი და შეიძლება დატოვონ ნარჩენი დამაბინძურებლები, რომლებიც ხელს უშლიან ქვედა დინებაში აპლიკაციებს. სარეცხი საშუალებების ოპტიმალური დოზის პოვნა დამატებითი გამოწვევაა.
• გაყინვა-დათბობის ციკლები: გაყინვა-დათბობის ციკლებმა შეიძლება გამოიწვიოს უჯრედის მემბრანების რღვევა, მაგრამ განმეორებითმა ციკლებმა ასევე შეიძლება გამოიწვიოს ცილის დენატურაცია და დეგრადაცია. ამ მეთოდს ასევე შეიძლება დასჭირდეს მრავალი ციკლი, რაც შეიძლება იყოს შრომატევადი და ხშირად იწვევს დაბალ მოსავალს.
• ფერმენტული ლიზი: ფერმენტული ლიზისის მეთოდები შეიძლება იყოს სპეციფიკური უჯრედების გარკვეული ტიპებისთვის და მოითხოვს მრავალ ნაბიჯს, რაც მათ დიდ დროს მოითხოვს. ისინი ასევე წარმოქმნიან ნარჩენებს და საჭიროებენ ფრთხილად ოპტიმიზაციას, რათა თავიდან აიცილონ ნიმუშის დეგრადაცია. ფერმენტული ლიზის კომპლექტები ხშირად ძვირია. თუ თქვენი ამჟამინდელი ფერმენტული ლიზის პროცედურა იძლევა არასაკმარის შედეგებს, სონიკა, როგორც სინერგიული მეთოდი, შეიძლება გამოყენებულ იქნას უჯრედების რღვევის გასაძლიერებლად.

უჯრედების ლიზისის ჩვეულებრივი მექანიკური და ქიმიური მეთოდებისგან განსხვავებით, სონიკა ძალიან ეფექტური და საიმედო საშუალებაა უჯრედების დაშლისთვის, რომელიც საშუალებას იძლევა სრულყოფილად აკონტროლოთ ბგერითი პარამეტრები. ეს უზრუნველყოფს მაღალი სელექციურობას მასალების გამოშვებასა და პროდუქტის სისუფთავეზე. [იხ. ბალასუნდარამი და სხვ., 2009]
ის შესაფერისია ყველა ტიპის უჯრედისთვის და ადვილად გამოსაყენებელია მცირე და დიდ მასშტაბებში – ყოველთვის კონტროლირებად პირობებში. ულტრაბგერითი აპარატები ადვილად იწმინდება. ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი ყოველთვის აღჭურვილია ადგილზე გაწმენდის (CIP) და ადგილზე სტერილიზაციის (SIP) ფუნქციით. სონოტროდი შედგება ტიტანის მასიური რქისგან, რომელიც შეიძლება წაშალოთ ან ჩამოიბანოთ წყალში ან გამხსნელში (დამოკიდებულია სამუშაო გარემოზე). ულტრაბგერითი აპარატების მოვლა განპირობებულია მათი გამძლეობით თითქმის უგულებელყოფილია.

ულტრაბგერითი ლიზი და უჯრედის მოშლა

ზოგადად, ლაბორატორიებში ნიმუშების სიდიდე 15 წამსა და 2 წუთს შორისაა. როგორც sonication- ის ინტენსივობა ძალიან ადვილად გამოსაყენებლად გამოიმუშავებს sonication- ის დროის ამოქმედებას, ასევე სწორი აღჭურვილობის არჩევის გზით, უჯრედის სტრუქტურისა და ლიზისის გათვალისწინებით უჯრედის მემბრანის დარღვევაა შესაძლებელი. მაგ. დნმ-ის ექსტრაქცია მოითხოვს რბილი ჩანაცვლებას, ბაქტერიების სრული ცილის მოპოვებას მოითხოვს უფრო ინტენსიური ულტრაბგერითი მკურნალობა. პროცესის დროს ტემპერატურა შეიძლება მონიტორინგი ინტეგრირებული ტემპერატურის სენსორით და ადვილად აკონტროლებს გაგრილების (ყინულის აბანოს ან გადინების უჯრედების გაგრილებისგან) ან პალიკადის რეჟიმში. პულსის რეჟიმში sonication, მოკლე sonication ადიდებული ციკლები 1-15 წამში ხანგრძლივობა საშუალებას სითბოს გაფრქვევა და გაგრილების დროს აღარ წყვეტილი პერიოდები.
ყველა ულტრაბგერითი ორიენტირებული პროცესი სრულიად რეპროდუქციული და ხაზოვანია.

ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები უჯრედების ლიზისისა და ექსტრაქციისთვის

სხვადასხვა ტიპის ულტრაბგერითი მოწყობილობა საშუალებას იძლევა შეესაბამებოდეს ნიმუშის მომზადების მიზანს და უზრუნველყოს მომხმარებლის კეთილგანწყობა და მუშაობის კომფორტი. ზონდის ტიპის ულტრაბგერითი არის ყველაზე გავრცელებული მოწყობილობა ლაბორატორიაში. ისინი ყველაზე შესაფერისია მცირე და საშუალო ზომის ნიმუშების მოსამზადებლად 0.1მლ-დან 1000მლ-მდე მოცულობით. სხვადასხვა სიმძლავრის ზომები და სონოტროდები იძლევა ულტრაბგერითი აპარატის ადაპტირებას ნიმუშის მოცულობასთან და ჭურჭელთან ყველაზე ეფექტური და ეფექტური გაჟონვის შედეგებისთვის. ულტრაბგერითი ზონდის მოწყობილობა საუკეთესო არჩევანია, როდესაც საჭიროა ცალკეული ნიმუშების მომზადება.

თუ მეტი ნიმუშის მომზადებაა საჭირო, მაგ. უჯრედის ხსნარის 8-10 ფლაკონი, ინტენსიური არაპირდაპირი ბგერითი ზემოქმედება ულტრაბგერითი სისტემებით, როგორიცაა VialTweeter ან ულტრაბგერითი კუპჰორნი, არის ყველაზე შესაფერისი ჰომოგენიზაციის მეთოდი ეფექტური ლიზისთვის. რამდენიმე ფლაკონი ერთსა და იმავე დროს, იმავე ინტენსივობით ხმება. ეს დაზოგავს არა მხოლოდ დროს, არამედ უზრუნველყოფს ყველა ნიმუშის ერთნაირ მოპყრობას, რაც შედეგებს ნიმუშებს შორის საიმედო და შესადარებელს ხდის. გარდა ამისა, არაპირდაპირი გაჟღერების დროს ჯვარედინი დაბინძურება ულტრაბგერითი სონოტროდის ჩაძირვით (ასევე ცნობილია როგორც ულტრაბგერითი ზონდი, რქა, წვერი ან თითი) თავიდან აცილებულია. იმის გამო, რომ ინდივიდუალურად გამოიყენება ნიმუშის ზომის შესატყვისი ფლაკონები, გამოტოვებულია შრომატევადი გაწმენდა და ნიმუშის დაკარგვა ჭურჭლის დეკანტირების გამო. მულტიბელური ან მიკროტიტრული ფირფიტების ერთგვაროვანი გაჟღერებისთვის, Hielscher გთავაზობთ UIP400MTP.
უფრო მაღალი მოცულობისთვის, მაგალითად, საკანში ექსტრაქტები, უწყვეტი ულტრაბგერითი სისტემები ნაკადის საკანში რეაქტორით. დამუშავებული მასალის უწყვეტი და კიდევ ნაკადი უზრუნველყოფს თუნდაც sonication. ულტრაბგერითი დეზინტეგრაციის პროცესის ყველა პარამეტრი ოპტიმიზირებულია და შეესაბამება განაცხადის მოთხოვნებს და სპეციფიკურ უჯრედს.
 
 
ბაქტერიული უჯრედების ულტრაბგერითი ლიზინგის სამაგალითო პროცედურა:

• უჯრედის შეჩერების მომზადება: უჯრედის მარცვლები უნდა მთლიანად შეჩერდეს ბუფერული ხსნარით ჰომოგენიზით (აირჩიე ბუფერული ხსნარი შემდეგი ანალიზით, მაგ. კონკრეტული ქრომატოგრაფიული მეთოდი). საჭიროების შემთხვევაში, საჭიროა ლიზოსმენების და სხვა დანამატების დამატება (მათ ასევე უნდა შეესაბამებოდეს გამყოფი / გამწმენდი საშუალებებით). შერბილება / ჰომოგენიზაცია ხსნარით ნაზად სენსიციურად, სანამ არ დასრულდება სრული შეჩერება.
• ულტრაბგერითი ლიზი: მოათავსეთ ნიმუში ყინულის აბანოში. უჯრედის დარღვევისთვის, 60-90 წამში შეჩერებული შეჩერება (თქვენი ულტრასონისტორის პულსის რეჟიმში).
• დაშორიშორება: ცენტრიფუგა lysate (მაგ. 10 წთ at 10,000 xg; 4degC). გამოყოფა ზეპირად მენჯის საკანში. სუპერვატანიტი არის მთლიანი უჯრედის ლაზერი. ზედაპირის ფილტრაციის შემდეგ, ხსნადი უჯრედის ცილის ნათელი სითხე მიიღე.

 
 
ყველაზე გავრცელებული განაცხადების ultrasonicators ბიოლოგიისა და ბიოტექნოლოგიის არიან:

• საკანი ამონაწერი მომზადება
• საფუარის, ბაქტერიების, მცენარეული უჯრედების, რბილი ან მყარი უჯრედული ქსოვილის, ნუკლეინის მასალის დარღვევა
• ცილის მოპოვება
• ფერმენტების მომზადება და იზოლაცია
• ანტიგენების წარმოება
• დნმ მოპოვება და / ან მიზნობრივი ფრაგმენტაცია
• ლიპოზომის მომზადება