Sonication for Cell Lysis: უჯრედების დარღვევა და ექსტრაქცია
ულტრაბგერითი უჯრედების ლიზისი არის ნიმუშის მომზადების პროცედურა ბიოტექნოლოგიურ ლაბორატორიებში. მიზანია უჯრედის კედლების ან მთლიანი უჯრედების დაშლა ბიოლოგიური მოლეკულების გასათავისუფლებლად. Sonication ჩვეულებრივ გამოიყენება უჯრედების ლიზისის, უჯრედების დაშლისა და ექსტრაქციისთვის. უჯრედების ლიზისისთვის სონიკატორების მთავარი უპირატესობა მდგომარეობს პროცესის პარამეტრების ზუსტი კონტროლით, როგორიცაა ინტენსივობა და ტემპერატურა, რაც საშუალებას იძლევა ნაზი, მაგრამ ეფექტური უჯრედების დაშლა და ექსტრაქცია.
უჯრედის ლიზისი ულტრაბგერის გამოყენებით
უჯრედების ულტრაბგერითი ლიზისი იყენებს მაღალი სიხშირის ხმის ტალღებს ღია უჯრედების გასატეხად და მათი შიგთავსის ამოსაღებად. Sonication დადგენილი და საიმედოა უჯრედშიდა მასალის დაშლისა და ექსტრაქციისთვის, როგორიცაა პლაზმიდები, რეცეპტორების ანალიზი, ცილები, დნმ და რნმ. პროცესის პარამეტრების კორექტირებით, ულტრაბგერითი ინტენსივობა შეიძლება სრულყოფილად იყოს მორგებული, რომ დააკმაყოფილოს განაცხადის სპეციფიკური მოთხოვნები, დაწყებული ნაზი ხმოვანებამდე. ლიზისის შემდგომი საფეხურები მოიცავს ფრაქციებს, ორგანელების იზოლაციას და ცილების ექსტრაქციას და გაწმენდას. მიღებული ლიზატი უნდა გამოიყოს შემდგომი გამოკვლევებისთვის ან გამოყენებისთვის, როგორიცაა პროტეომიული კვლევა.
თუ გსურთ მეტი გაიგოთ ლიზისის, უჯრედების დაშლისა და ექსტრაქციის შესახებ სონიკაციის შესახებ, გთხოვთ დაგვიკავშირდეთ. ჩვენი ტექნიკური გუნდი სიამოვნებით იმუშავებს თქვენთან ერთად თქვენი უჯრედების ლიზისის პროექტზე.
ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები UP100H (100 ვატი) და UP400St (400 ვატი): Sonication უჯრედების ლიზისისა და ექსტრაქციისთვის.
უჯრედების ლიზისისთვის სონიკაციის გამოყენების უპირატესობები
უჯრედების ლიზისა და ექსტრაქციის სხვა მეთოდებთან შედარებით, ულტრაბგერითი უჯრედების ლიზისს აქვს რამდენიმე უპირატესობა:
- სიჩქარე: ულტრაბგერითი უჯრედების ლიზისი და ექსტრაქცია არის სწრაფი მეთოდი, რომელსაც შეუძლია გახსნილი უჯრედების გატეხვა რამდენიმე წამში. ეს ბევრად უფრო სწრაფია, ვიდრე სხვა მეთოდები, როგორიცაა ჰომოგენიზაცია, გაყინვა-დათბობა ან მძივების დაფქვა.
- ეფექტურობა: უჯრედების ულტრაბგერითი ლიზისი და ექსტრაქცია შეიძლება გამოყენებულ იქნას მცირე, დიდი ან მრავალი ნიმუშის ერთდროულად დასამუშავებლად, რაც მას უფრო ეფექტურს ხდის, ვიდრე სხვა მეთოდები, რომლებიც საჭიროებენ მცირე ნიმუშების ინდივიდუალურ დამუშავებას.
- ქიმიკატების გარეშე: უჯრედების ულტრაბგერითი ლიზისი და ექსტრაქცია არის არაინვაზიური მეთოდი, რომელიც არ საჭიროებს უხეში ქიმიკატების ან ფერმენტების გამოყენებას. ეს მას იდეალურს ხდის აპლიკაციებისთვის, სადაც საჭიროა უჯრედის შიგთავსის მთლიანობის შენარჩუნება. ნიმუშების არასასურველი დაბინძურების თავიდან აცილება შესაძლებელია.
- Მაღალი სარგებელი: უჯრედების ულტრაბგერითი ლიზისა და ექსტრაქციის საშუალებით შესაძლებელია უჯრედული შიგთავსის, მათ შორის დნმ-ის, რნმ-ის და ცილების მაღალი მოსავლიანობა. ეს იმიტომ ხდება, რომ მაღალი სიხშირის ხმის ტალღები არღვევს უჯრედის კედლებს და ათავისუფლებს შიგთავსს მიმდებარე ხსნარში.
- Ტემპერატურის კონტროლი: დახვეწილი ულტრაბგერითი საშუალებას იძლევა ზუსტი ტემპერატურის კონტროლის ნიმუში. Hielscher ციფრული sonicators აღჭურვილია ჩართული ტემპერატურის სენსორი და ტემპერატურის მონიტორინგის პროგრამული უზრუნველყოფა.
- რეპროდუცირებადი: ულტრაბგერითი უჯრედების ლიზის პროტოკოლები შეიძლება ადვილად რეპროდუცირდეს და შეესაბამებოდეს ნიმუშის სხვადასხვა უფრო დიდ ან მცირე მოცულობას მარტივი ხაზოვანი მასშტაბით.
- მრავალმხრივი: ულტრაბგერითი უჯრედების ლიზისი და ექსტრაქცია შეიძლება გამოყენებულ იქნას უჯრედების ტიპების ფართო სპექტრის ამოსაღებად, მათ შორის ბაქტერიების, საფუარის, სოკოების, მცენარეებისა და ძუძუმწოვრების უჯრედების ჩათვლით. ის ასევე შეიძლება გამოყენებულ იქნას სხვადასხვა ტიპის მოლეკულების, მათ შორის ცილების, დნმ, რნმ და ლიპიდების ამოსაღებად.
- მრავალი ნიმუშის ერთდროული მომზადება: Hielscher Ultrasonics გთავაზობთ რამდენიმე გამოსავალს მრავალი ნიმუშის კომფორტულად დასამუშავებლად ზუსტად იგივე პროცესის პირობებში. ეს ხდის ნიმუშის მომზადების ეტაპს ლიზისისა და ექსტრაქციის უაღრესად ეფექტურს და დაზოგავს დროს.
- მარტივი გამოსაყენებელი: ულტრაბგერითი უჯრედების ლიზისისა და ექსტრაქციის მოწყობილობა მარტივი გამოსაყენებელია და მოითხოვს მინიმალურ მომზადებას. აღჭურვილობა ასევე ეკონომიურია, რადგან ეს არის ერთჯერადი ინვესტიცია, რომელიც არ მოითხოვს ხელახლა შესყიდვას. ეს მას მიმზიდველს ხდის მკვლევართა და ლაბორატორიების ფართო სპექტრისთვის.
მთლიანობაში, ულტრაბგერითი უჯრედების ლიზისი და ექსტრაქცია არის სწრაფი, ეფექტური, ზუსტად კონტროლირებადი და მრავალმხრივი მეთოდი უჯრედული შიგთავსის მოპოვებისთვის. მისი უპირატესობები ალტერნატიულ მეთოდებთან შედარებით მიმზიდველ არჩევანს აქცევს კვლევისა და სამრეწველო აპლიკაციების ფართო სპექტრისთვის.
ულტრაბგერითი უჯრედების ლიზისის მუშაობის პრინციპი
უჯრედების ულტრაბგერითი ლიზისი და ექსტრაქცია იყენებს მაღალი სიხშირის ხმის ტალღებს უჯრედების დასაშლელად და მათი შიგთავსის ამოღების მიზნით. ხმის ტალღები ქმნიან წნევის ცვლილებებს მიმდებარე სითხეში, რაც იწვევს პატარა ბუშტების წარმოქმნას და კოლაფსს, რომელიც ცნობილია როგორც კავიტაცია. ეს ბუშტები წარმოქმნიან ლოკალიზებულ უაღრესად ინტენსიურ მექანიკურ ძალებს, რომლებსაც შეუძლიათ ღია უჯრედების გატეხვა და მათი შიგთავსის მიმდებარე ხსნარში გაშვება.
უჯრედების ლიზისი ულტრაბგერითი აპარატის გამოყენებით ჩვეულებრივ მოიცავს შემდეგ ნაბიჯებს:
- ნიმუში მოთავსებულია მილში ან კონტეინერში თხევადი ბუფერით.
- ნიმუშში ჩასმულია ულტრაბგერითი ზონდი და მაღალი სიხშირის ხმის ტალღები დაახლ. გამოიყენება 20-30 kHz.
- ულტრაბგერითი ტალღები იწვევენ რხევას და კავიტაციას მიმდებარე სითხეში, წარმოქმნიან ლოკალიზებულ ძალებს, რომლებიც არღვევენ ღია უჯრედებს და ათავისუფლებენ მათ შიგთავსს.
- ნიმუში არის ცენტრიფუგირებული ან გაფილტრული ნებისმიერი ფიჭური ნარჩენების მოსაშორებლად, ხოლო ამოღებული შიგთავსი გროვდება ქვედა დინების ანალიზისთვის.
ძლიერი ულტრაბგერითი ტალღები არღვევს ბიოლოგიური სტრუქტურების უჯრედულ მატრიქსს და ათავისუფლებს ბიოაქტიურ ნაერთებს. გაძლიერებულია მასის გადატანა მცენარეულ მასალასა და გამხსნელს (მაგ. ბუფერს) შორის. (გრაფიკა: ©Vilkhu et al., 2006)
ლიზისის ჩვეულებრივი მეთოდების ნაკლოვანებები
ლაბორატორიებში მუშაობის დროს შესაძლოა უკვე გამოგიცდიათ უჯრედების ლიზის სირთულეები ტრადიციული მექანიკური ან ქიმიური ლიზის პროტოკოლების გამოყენებით.
- მექანიკური ლიზისი: მექანიკური ლიზისის მეთოდებს, როგორიცაა ნაღმტყორცნებით და ნაღმტყორცნებით დაფქვა ან ჰომოგენიზაცია ფრანგული პრესის, მძივის წისქვილის ან როტორ-სტატორის სისტემის გამოყენებით, ხშირად არ გააჩნიათ ზუსტი კონტროლი და კორექტირების ვარიანტები. ეს ნიშნავს, რომ დაფქვისა და დაფქვის გამოყენებამ შეიძლება სწრაფად წარმოქმნას სითბო და ათვლის ძალები, რამაც შეიძლება დააზიანოს ნიმუში და დენატურაცია მოახდინოს ცილებს. ისინი ასევე შეიძლება იყოს შრომატევადი და მოითხოვონ დიდი რაოდენობით საწყისი მასალა.
- ქიმიური ლიზისი: ქიმიური ლიზისის მეთოდებმა, როგორიცაა სარეცხი საშუალებებით დაფუძნებული ლიზი, შეიძლება დააზიანოს ნიმუში ლიპიდური ორშრის დარღვევით და ცილების დენატურირებით. მათ ასევე შეიძლება დასჭირდეთ რამდენიმე ნაბიჯი და შეიძლება დატოვონ ნარჩენი დამაბინძურებლები, რომლებიც ხელს უშლიან ქვედა დინებაში აპლიკაციებს. სარეცხი საშუალებების ოპტიმალური დოზის პოვნა დამატებითი გამოწვევაა.
- გაყინვა-დათბობის ციკლები: გაყინვა-დათბობის ციკლებმა შეიძლება გამოიწვიოს უჯრედის მემბრანების რღვევა, მაგრამ განმეორებითმა ციკლებმა ასევე შეიძლება გამოიწვიოს ცილის დენატურაცია და დეგრადაცია. ამ მეთოდს ასევე შეიძლება დასჭირდეს მრავალი ციკლი, რაც შეიძლება იყოს შრომატევადი და ხშირად იწვევს დაბალ მოსავალს.
- ფერმენტული ლიზი: ფერმენტული ლიზისის მეთოდები შეიძლება იყოს სპეციფიკური უჯრედების გარკვეული ტიპებისთვის და მოითხოვს მრავალ ნაბიჯს, რაც მათ დიდ დროს მოითხოვს. ისინი ასევე წარმოქმნიან ნარჩენებს და საჭიროებენ ფრთხილად ოპტიმიზაციას, რათა თავიდან აიცილონ ნიმუშის დეგრადაცია. ფერმენტული ლიზის კომპლექტები ხშირად ძვირია. თუ თქვენი ამჟამინდელი ფერმენტული ლიზის პროცედურა იძლევა არასაკმარის შედეგებს, სონიკა, როგორც სინერგიული მეთოდი, შეიძლება გამოყენებულ იქნას უჯრედების რღვევის გასაძლიერებლად.
უჯრედების ლიზისის ჩვეულებრივი მექანიკური და ქიმიური მეთოდებისგან განსხვავებით, სონიკა ძალიან ეფექტური და საიმედო საშუალებაა უჯრედების დაშლისთვის, რომელიც საშუალებას იძლევა სრულყოფილად აკონტროლოთ ბგერითი პარამეტრები. ეს უზრუნველყოფს მაღალი სელექციურობას მასალების გამოშვებასა და პროდუქტის სისუფთავეზე. [იხ. ბალასუნდარამი და სხვ., 2009]
ის შესაფერისია ყველა ტიპის უჯრედისთვის და ადვილად გამოსაყენებელია მცირე და დიდ მასშტაბებში – ყოველთვის კონტროლირებად პირობებში. ულტრაბგერითი აპარატები ადვილად იწმინდება. ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი ყოველთვის აღჭურვილია ადგილზე გაწმენდის (CIP) და ადგილზე სტერილიზაციის (SIP) ფუნქციით. სონოტროდი შედგება ტიტანის მასიური რქისგან, რომელიც შეიძლება წაშალოთ ან ჩამოიბანოთ წყალში ან გამხსნელში (დამოკიდებულია სამუშაო გარემოზე). ულტრაბგერითი აპარატების მოვლა განპირობებულია მათი გამძლეობით თითქმის უგულებელყოფილია.
ულტრაბგერითი ლიზისი და უჯრედების დარღვევა
ზოგადად, ლაბორატორიაში ნიმუშების ლიზისს 15 წამიდან 2 წუთამდე დასჭირდება. იმის გამო, რომ გაჟონვის ინტენსივობა ძალიან ადვილია რეგულირებადი ამპლიტუდის დაყენებით, ასევე სწორი აღჭურვილობის არჩევით, შესაძლებელია უჯრედის მემბრანების დაშლა ძალიან ნაზად ან ძალიან მკვეთრად, რაც დამოკიდებულია უჯრედის სტრუქტურასა და ლიზისის მიზანზე. მაგ. დნმ-ის ექსტრაქცია მოითხოვს უფრო რბილ სონიკას, ბაქტერიების სრული ცილის ექსტრაქცია მოითხოვს უფრო ინტენსიურ ულტრაბგერით მკურნალობას). პროცესის დროს ტემპერატურა შეიძლება კონტროლდებოდეს ინტეგრირებული ტემპერატურის სენსორით და ადვილად კონტროლდება გაგრილებით (ყინულის აბანო ან ნაკადის უჯრედები გამაგრილებელი ჟაკეტებით) ან პულსირებული რეჟიმში გაჟღერებით. პულსური რეჟიმის გაჟონვის დროს, 1-15 წამის ხანგრძლივობის ხანმოკლე სონიკაციის ადიდებული ციკლები იძლევა სითბოს გაფრქვევას და გაგრილებას უფრო ხანგრძლივ წყვეტილ პერიოდებში.
ყველა ულტრაბგერითი პროცესი სრულად განმეორებადია და ხაზოვანი მასშტაბირებადია.
VialTweeter არის ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორი მრავალი ნიმუშის ერთდროული, ერთგვაროვანი და სწრაფი სტერილური მომზადებისთვის.
ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორები უჯრედების ლიზისისა და ექსტრაქციისთვის
სხვადასხვა ტიპის ულტრაბგერითი მოწყობილობა საშუალებას იძლევა შეესაბამებოდეს ნიმუშის მომზადების მიზანს და უზრუნველყოს მომხმარებლის კეთილგანწყობა და მუშაობის კომფორტი. ზონდის ტიპის ულტრაბგერითი არის ყველაზე გავრცელებული მოწყობილობა ლაბორატორიაში. ისინი ყველაზე შესაფერისია მცირე და საშუალო ზომის ნიმუშების მოსამზადებლად 0.1მლ-დან 1000მლ-მდე მოცულობით. სხვადასხვა სიმძლავრის ზომები და სონოტროდები იძლევა ულტრაბგერითი აპარატის ადაპტირებას ნიმუშის მოცულობასთან და ჭურჭელთან ყველაზე ეფექტური და ეფექტური ზონირების შედეგებისთვის. ულტრაბგერითი ზონდის მოწყობილობა საუკეთესო არჩევანია, როდესაც საჭიროა ცალკეული ნიმუშების მომზადება.
თუ მეტი ნიმუშის მომზადებაა საჭირო, მაგ. უჯრედის ხსნარის 8-10 ფლაკონი, ინტენსიური არაპირდაპირი ბგერითი ზემოქმედება ულტრაბგერითი სისტემებით, როგორიცაა VialTweeter ან ულტრაბგერითი კუპჰორნი, არის ყველაზე შესაფერისი ჰომოგენიზაციის მეთოდი ეფექტური ლიზისისთვის. რამდენიმე ფლაკონი ერთსა და იმავე დროს, იმავე ინტენსივობით იკვებება. ეს დაზოგავს არა მხოლოდ დროს, არამედ უზრუნველყოფს ყველა ნიმუშის ერთნაირ მოპყრობას, რაც სინჯებს შორის შედეგებს საიმედო და შესადარებელს ხდის. გარდა ამისა, არაპირდაპირი გაჟღერების დროს ჯვარედინი დაბინძურება ულტრაბგერითი სონოტროდის ჩაძირვით (ასევე ცნობილია როგორც ულტრაბგერითი ზონდი, რქა, წვერი ან თითი) თავიდან აცილებულია. მას შემდეგ, რაც ინდივიდუალურად გამოიყენება ნიმუშის ზომის შესატყვისი ფლაკონები, გამოტოვებულია შრომატევადი გაწმენდა და სინჯის დაკარგვა ჭურჭლის დეკანტირების გამო. მულტიბელური ან მიკროტიტრული ფირფიტების ერთგვაროვანი გაჟღერებისთვის, Hielscher გთავაზობთ UIP400MTP.
უფრო მაღალი მოცულობისთვის, მაგ. უჯრედის ექსტრაქტების კომერციული წარმოებისთვის, ყველაზე შესაფერისია უწყვეტი ულტრაბგერითი სისტემები ნაკადის უჯრედის რეაქტორით. დამუშავებული მასალის უწყვეტი და თანაბარი ნაკადი უზრუნველყოფს თანაბარ გაჟღერებას. ულტრაბგერითი დაშლის პროცესის ყველა პარამეტრი შეიძლება იყოს ოპტიმიზირებული და მორგებული აპლიკაციისა და კონკრეტული უჯრედის მასალის მოთხოვნებზე.
ბაქტერიული უჯრედების ულტრაბგერითი ლიზის სამაგალითო პროცედურა:
- უჯრედული სუსპენზიის მომზადება: უჯრედული მარცვლები მთლიანად უნდა იყოს შეჩერებული ბუფერულ ხსნარში ჰომოგენიზაციის გზით (აირჩიეთ ბუფერული ხსნარი, რომელიც შეესაბამება შემდეგ ანალიზს, მაგ. ქრომატოგრაფიის სპეციფიკურ მეთოდს). საჭიროების შემთხვევაში დაამატეთ ლიზოზიმები და/ან სხვა დანამატები (ისინი ასევე თავსებადი უნდა იყოს სეპარაციის/განწმენდის საშუალებებთან). ხსნარი შეურიეთ/ჰომოგენიზირეთ ნაზად რბილ ხმოვანზე, სანამ არ მიიღწევა სრული სუსპენზია.
- ულტრაბგერითი ლიზისი: მოათავსეთ ნიმუში ყინულის აბაზანაში. უჯრედის დაშლისთვის, სუსპენზიის გაჟონვა 60-90 წამის სიხშირით (თქვენი სონიკატორის პულსის რეჟიმის გამოყენებით).
- გამოყოფა: ლიზატის ცენტრიფუგა (მაგ. 10 წთ. 10000 xg-ზე; 4°C-ზე). ფრთხილად გამოაცალეთ სუპერნატანი უჯრედის მარცვლიდან. სუპერნატანტი არის მთლიანი უჯრედის ლიზატი. სუპერნატანტის ფილტრაციის შემდეგ, თქვენ მიიღებთ ხსნადი უჯრედის ცილის გამწმენდ სითხეს.
ულტრაბგერითი აპარატების ყველაზე გავრცელებული აპლიკაციები ბიოლოგიასა და ბიოტექნოლოგიაში არის:
- უჯრედის ექსტრაქტის მომზადება
- საფუარის, ბაქტერიების, მცენარეული უჯრედების, რბილი ან მყარი უჯრედული ქსოვილის, ნუკლეინის მასალის დარღვევა
- ცილის მოპოვება
- ფერმენტების მომზადება და იზოლაცია
- ანტიგენების წარმოება
- დნმ-ის ექსტრაქცია და/ან მიზნობრივი ფრაგმენტაცია
- ლიპოსომის მომზადება
უჯრედის რღვევა ზონდის ტიპის ულტრაბგერითი ნიმუშის მომზადების ეფექტური მეთოდია.
ქვემოთ მოყვანილი ცხრილი გაძლევთ მიმოხილვას ჩვენი ულტრაბგერითი უჯრედების დაშლისა და ექსტრაქციისთვის. დააწკაპუნეთ მოწყობილობის ტიპზე, რომ მიიღოთ მეტი ინფორმაცია თითოეული ულტრაბგერითი ჰომოგენიზატორის შესახებ. ჩვენი კარგად გაწვრთნილი და დიდი ხნის გამოცდილების მქონე ტექნიკური პერსონალი სიამოვნებით დაგეხმარებით თქვენი ნიმუშებისთვის ყველაზე შესაფერისი ულტრაბგერითი აპარატის არჩევაში!
| სურათების მოცულობა | Დინების სიჩქარე | რეკომენდებული მოწყობილობები |
|---|---|---|
| 10-მდე ფლაკონი ან ტუბი | na | VialTweeter |
| მულტიბელ / მიკროტიტრული ფირფიტები | na | UIP400MTP |
| მრავალი მილები / ჭურჭელი | na | ჭიქის რქა |
| 1-დან 500 მლ-მდე | 10-დან 200 მლ/წთ-მდე | UP100H |
| 10-დან 1000 მლ-მდე | 20-დან 200 მლ/წთ-მდე | UP200Ht, UP200 ქ |
| 10-დან 2000 მლ-მდე | 20-დან 400 მლ/წთ-მდე | UP400 ქ |
ულტრაბგერის მრავალმხრივი გამოყენება განშტოებულია ბიოტექნოლოგიის, ბიოინჟინერიის, მიკრობიოლოგიის, მოლეკულური ბიოლოგიის, ბიოქიმიის, იმუნოლოგიის, ბაქტერიოლოგიის, ვირუსოლოგიის, პროტეომიკა, გენეტიკა, ფიზიოლოგია, უჯრედული ბიოლოგია, ჰემატოლოგია და ბოტანიკის სექტორებში.
ლიზისი: უჯრედის სტრუქტურების დარღვევა
უჯრედები დაცულია ნახევრად გამტარი პლაზმური მემბრანით, რომელიც შედგება ფოსფო-ლიპიდური ორშრისგან (ასევე ცილა-ლიპიდური ორშერით; წარმოიქმნება ჰიდროფობიური ლიპიდებითა და ჰიდროფილური ფოსფორის მოლეკულებით ჩაშენებული ცილის მოლეკულებით) და ქმნის ბარიერს უჯრედის ინტერიერს (ციტოპლაზმა) შორის. უჯრედგარე გარემო. მცენარეთა უჯრედები და პროკარიოტული უჯრედები გარშემორტყმულია უჯრედის კედლით. ცელულოზის მრავალ ფენის სქელი უჯრედის კედლის გამო, მცენარეთა უჯრედები უფრო რთულია ლიზინგი, ვიდრე ცხოველური უჯრედები. უჯრედის შინაგანი ნაწილი, როგორიცაა ორგანელები, ბირთვი, მიტოქონდრიონი, სტაბილიზირებულია ციტოჩონჩხის მიერ.
უჯრედების ლიზირებით, ის მიზნად ისახავს ორგანელების, ცილების, დნმ-ის, mRNA ან სხვა ბიომოლეკულების ამოღებას და განცალკევებას.
უჯრედების ლიზისის ჩვეულებრივი მეთოდები და მათი ნაკლოვანებები
უჯრედების ლიზატის რამდენიმე მეთოდი არსებობს, რომლებიც შეიძლება დაიყოს მექანიკურ და ქიმიურ მეთოდებად, რომლებიც მოიცავს სარეცხი საშუალებების ან გამხსნელების გამოყენებას, მაღალი წნევის გამოყენებას ან მძივის წისქვილის ან ფრანგული პრესის გამოყენებას. ამ მეთოდების ყველაზე პრობლემური მინუსი არის პროცესის პარამეტრების რთული კონტროლი და კორექტირება და, შესაბამისად, ზემოქმედება.
ქვემოთ მოყვანილი ცხრილი გვიჩვენებს ლიზისის ჩვეულებრივი მეთოდების ძირითად ნაკლოვანებებს:
ცხრილი: უჯრედების ლიზისის ჩვეულებრივ მეთოდებს აქვს ძირითადი უარყოფითი მხარეები
ლიზისის პროცედურა
ლიზისი მგრძნობიარე პროცესია. ლიზისის დროს ნადგურდება უჯრედის მემბრანის დაცვა, თუმცა მოპოვებული ცილების ინაქტივაცია, დენატურაცია და დეგრადაცია არაფიზიოლოგიური გარემოს მიერ (pH-ის მნიშვნელობიდან გადახრა) თავიდან უნდა იქნას აცილებული. ამიტომ, ზოგადად ლიზისი ტარდება ბუფერულ ხსნარში. სირთულეების უმეტესობა წარმოიქმნება უჯრედების უკონტროლო დაშლის შედეგად, რაც იწვევს მთელი უჯრედშიდა მასალის არამიზნობრივ განთავისუფლებას ან/და სამიზნე პროდუქტის დენატურაციას.
ხშირად დასმული კითხვები Sonication და Cell Lysis-ის შესახებ
- შეგიძლიათ თუ არა უჯრედების ლიზინგი სონიკით? დიახ, sonication ეფექტურად ასუფთავებს უჯრედებს მაღალი სიხშირის ულტრაბგერითი ტალღების გამოყენებით, რომლებიც იწვევს კავიტაციას, ფენომენს, როდესაც ორთქლის პაწაწინა ბუშტები წარმოიქმნება და ძლიერად იშლება უჯრედის სუსპენზიაში. შედეგად მიღებული მექანიკური ძალები არღვევს უჯრედის მემბრანას და ხელს უწყობს უჯრედშიდა კომპონენტების სითხეში გამოყოფას.
- როგორ გამოვიყენოთ სონიკატორი უჯრედების ლიზისისთვის? სონიკატორის გამოყენება უჯრედის ლიზისისთვის გულისხმობს სონიკატორის ზონდის ჩაძირვას უჯრედულ სუსპენზიაში და ისეთი პარამეტრების რეგულირებას, როგორიცაა ამპლიტუდა და პულსის ხანგრძლივობა. პროცესი უნდა იყოს მჭიდროდ მონიტორინგი, რათა მოხდეს უჯრედების დაშლის ოპტიმიზაცია, პროტეინის დენატურაციისა და ფერმენტების ინაქტივაციის მინიმუმამდე შემცირება.
- რა არის უჯრედების ლიზისის ზონირების პრინციპი? Sonication მუშაობს აკუსტიკური კავიტაციის პრინციპით. ულტრაბგერითი ენერგია გადადის თხევად გარემოში, რაც იწვევს წნევის სწრაფ რყევებს, რაც იწვევს მიკრობუშტების წარმოქმნას და აფეთქებას. ეს აფეთქებები წარმოქმნის ინტენსიურ ათვლის ძალებს და ლოკალიზებულ მაღალ ტემპერატურას, არღვევს უჯრედულ სტრუქტურებს და აძლიერებს ლიზატის ერთგვაროვნებას.
- რამდენი ხანი სჭირდება უჯრედების ლიზისის გაჟონვას? უჯრედების ლიზისისთვის გახმოვანების ხანგრძლივობა შეიძლება მნიშვნელოვნად განსხვავდებოდეს ფაქტორების მიხედვით, როგორიცაა უჯრედის ტიპი, უჯრედის სიმკვრივე, სონიკატორის სიმძლავრე და გამოყენებული სპეციფიკური პროტოკოლი. ტიპიური პროცედურები შეიძლება მერყეობდეს რამდენიმე წამიდან რამდენიმე წუთამდე, ხშირად შესრულებული ციკლურად სითბოს წარმოქმნის მართვისა და უჯრედების ერთგვაროვანი დარღვევის უზრუნველსაყოფად.
- რა არის ცილის ექსტრაქციის დროს სონიკაციის მიზანი? ცილის ექსტრაქციისას, სონიკა ემსახურება უჯრედის მემბრანების ეფექტურად გაფუჭებას და ცილების ხსნადობას. ეს მეთოდი განსაკუთრებით სასარგებლოა ცილების უჯრედული განყოფილებებიდან გასათავისუფლებლად, რაც მას აუცილებელს ხდის ლიზატების მოსამზადებლად, საიდანაც ცილები უნდა გაიწმინდოს ან გაანალიზდეს.
- რატომ გამოიყენება სონიკაცია ექსტრაქციისთვის? Sonication უპირატესობას ანიჭებს ექსტრაქციას მისი სწრაფი მოქმედებისა და მიზანმიმართული ენერგიის გამოყენების უნარის გამო, არღვევს უჯრედულ სტრუქტურებს ბიოაქტიური მოლეკულების გასათავისუფლებლად მკაცრი ქიმიური საშუალებების გამოყენების გარეშე, რითაც ინარჩუნებს მოპოვებული ნაერთების ფუნქციურ მთლიანობას.
- არღვევს თუ არა სონიკაცია ცილა-ცილის ურთიერთქმედებას? მიუხედავად იმისა, რომ გაჟღერებას შეუძლია ეფექტურად დაარღვიოს უჯრედის მემბრანები, მას ასევე შეუძლია დაარღვიოს ცილა-ცილის ურთიერთქმედება. დარღვევის დონე დამოკიდებულია ბგერითი გამოსხივების ინტენსივობაზე და ექსპოზიციის ხანგრძლივობაზე, რაც პოტენციურად გამოიწვევს ცილის კომპლექსების დენატურაციას ან დისოციაციას, რამაც შეიძლება გავლენა მოახდინოს შემდგომ ანალიტიკურ ან ფუნქციურ კვლევებზე.
- შეიძლება თუ არა სონიკაციის გამოყენება E. coli-ს ლიზისთვის? Hielscher sonicators განსაკუთრებით ეფექტურია ბაქტერიული უჯრედების ლიზირებისთვის, როგორიცაა E. coli, რომლებსაც აქვთ ძლიერი უჯრედის კედლები. ტექნიკა უზრუნველყოფს ფიზიკურ მეთოდს უჯრედის კედლისა და მემბრანის გაკვეთისთვის, რაც მას უპირატეს მეთოდად აქცევს მოლეკულურ ბიოლოგიისა და ბიოქიმიის ლაბორატორიებში ბაქტერიული ლიზატების მოსამზადებლად.
ლიტერატურა/ცნობარი
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.