UIP400MTPマイクロプレートソニケーターによるアミロイド線維形成
アミロイド線維は、結晶と同様に、核生成とそれに続く成長の過程を経て形成される。しかし、核形成の自由エネルギー障壁が高いため、自発的なアミロイド線維形成は、長期間のラグフェーズの後にしか起こらない。超音波照射は、アミロイドの核形成を誘導し、フィブリル形成を著しく促進する強力なツールとして登場した。チオフラビンT（ThT）蛍光を用いるマイクロプレートリーダーと組み合わせると、超音波処理によって複数のサンプル中のアミロイド線維を同時にハイスループットで検出することができる。
UIP400MTPマイクロプレートソニケーターによる超音波誘起アミロイド線維形成
UIP400MTP マルチウェルプレートソニケーターを用いると、研究目的で同質のアミロイド線維を大量に迅速に合成することができます。この効率的なアプローチにより、タンパク質のアミロイド原性を研究することができます。この技術は、透析関連アミロイドーシスに関連するアミロイド生成タンパク質であるβ2-ミクログロブリン（β2-m）で実証されたように、迅速かつ再現性のあるアミロイド線維形成を容易にします。
シンプルな実験的アプローチ超音波誘起アミロイド細動
フィブリル形成を誘導するため、96ウェルマイクロプレートをUIP400MTPマルチウェルプレートソニケーターの中央に置き、すべてのウェルに均一に超音波を照射した。実験条件は以下の通りである：
- 各ウェルには、5μM ThTを添加したβ2-ミクログロブリン溶液（0.3mg/ml、pH 2.5）を0.2mlずつ入れた。
- プレートは、1分間の超音波照射と9分間の休止のような超音波照射サイクルにかけられた。
- ソニケーション後、ThT蛍光をマイクロプレートリーダーで測定した。
(参照：So et al.）
UIP400MTPは超音波バスではありません。集中超音波処理用の高強度カップホーンです。この強力な非接触式ソニケーターは、標準ウェルプレートのすべてのウェルに均一な超音波照射を行います。振幅、出力、パルスを正確に制御できます。タイマーと温度プローブが内蔵されているため、安定した結果が得られます。UIP400MTPプレートソニケーターは、ウォーターバスでサンプルを冷却します（外部冷却器はオプション）。
従来の攪拌との比較
従来の撹拌方法と比較して、超音波照射はフィブリル形成のラグフェーズを劇的に減少させた。従来のマイクロプレート振盪条件下では、20時間後にThT蛍光が増加したのは10ウェル中1ウェルのみであった。対照的に、循環超音波処理（15分間の超音波処理と5分間の静止）を用いると、最初の超音波処理直後にThT蛍光の有意な増加が検出された。
細動動態の急速な加速
Soら（2011）の結果は、pH2.5におけるβ2-ミクログロブリンの自発的な線維形成が、超音波処理によって数時間からわずか10-15分にまで促進されることを示している。
原子間力顕微鏡（AFM）画像により、15分ごとに10分間の超音波照射で生成したフィブリルは、10分ごとに1分間の超音波照射で生成したフィブリルと形態学的に区別がつかないことが確認された。このことは、超音波によるアミロイド線維形成の再現性と頑健性を強調している。
10分ごとに1分間の超音波処理（i）、15分ごとに10分間の超音波処理（ii）、および超音波処理を行わない播種反応（iii）によって生成したアミロイド線維のAFM画像。白いスケールバーは1μmを表す。
研究および画像：©So et al.
中性pH条件下での細動
中性pH条件下でも、フィブリル形成は1.5時間のタイムラグの後に達成され、超音波処理によって核形成と成長に対するエネルギー障壁が著しく低下することが示された。このことは、アミロイド線維形成は主として物理的反応であり、核形成のエネルギー障壁に大きく制約されるが、超音波処理によってこの障壁が効果的に低下するという仮説をさらに支持するものである。
アミロイド関連疾患研究への影響
UIP400MTPマイクロプレートソニケーターを用いたアミロイド線維の簡便かつ確実な形成は、アルツハイマー病（AD）の研究や、パーキンソン病、II型糖尿病、全身性アミロイドーシスなどの他のアミロイド関連疾患にとって重要な意味を持つ。アルツハイマー病では、アミロイドβ（Aβ）の凝集が病理学的に重要な特徴であるが、その線維化の動態を研究することは、従来の方法ではラグフェーズが長く、ばらつきがあるため、依然として困難である。超音波照射によるフィブリル形成は、核形成を促進し、高い再現性とばらつきの低減を保証する。このことは、潜在的な阻害剤のスクリーニングやアミロイド生成メカニズムの理解に極めて重要である。さらに、UIP400MTPのハイスループット機能は、タンパク質のミスフォールディングと凝集に関する大規模な研究を可能にし、線維形成を調節し、神経変性進行を緩和する可能性のある治療薬の発見を促進する。
UIP400MTPは、信頼性の高いサンプル前処理と、既存のラボワークフローへの容易な統合を保証します。
本研究により、UIP400MTPマルチウェルプレートソニケーターを用いた超音波照射が、アミロイド線維形成を促進する非常に効率的な方法であることが立証された。この方法の主な利点は以下の通りである：
- 細動のタイムラグが劇的に短縮された。
- すべてのウェルで均一な超音波照射を行い、再現性のあるフィブリル形成を可能にする。
- 高スループットのスクリーニングが可能で、タンパク質のアミロイド原性のゲノムワイドな検索に適している。
超音波処理とThT蛍光検出を統合することで、この方法はアミロイド線維形成を研究するための迅速でスケーラブルかつ信頼性の高いプラットフォームを提供する。その効率性とハイスループットの可能性から、この方法は、生物物理学的および薬学的研究のためのアミロイド線維の簡便な合成を促進し、アミロイド関連研究や薬剤スクリーニングのための有望なツールを提供すると考えられる。
高スループットEM抽出 96ウェルプレートソニケーターUIP400MTP付き
文献・参考文献
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
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よくある質問
アミロイド一次核形成とは？
アミロイド一次核形成は、アミロイド線維形成における最初の、律速段階であり、単量体タンパク質が構造変化を起こし、重要な核へと自己集合する。この核はさらなる凝集のための鋳型となる。
アミロイドーシスではどのようにしてフィブリルが形成されるのか？
アミロイドーシスでは、ミスフォールドしたタンパク質が核形成依存的な重合によって凝集する。一旦核が形成されると、モノマーは二次核形成とテンプレート成長によってβシートに富んだフィブリルへと急速に伸長し、アミロイド沈着へと至る。
アミロイド線維多型とは？
アミロイド線維の多型性とは、同じタンパク質によって形成される線維の構造的変異のことである。フィブリルの形態、プロトフィラメントの配列、分子パッキングにおける違いは、環境条件、突然変異、あるいは異なる凝集経路によって生じる。
アミロイド線維とプラークの違いは？
アミロイド線維は線状でβシートに富んだタンパク質の凝集体であり、アミロイド斑は凝集した線維の細胞外沈着物であり、アルツハイマー病などの神経変性疾患に見られるように、脂質、金属、細胞残屑などと混在していることが多い。
アルファ-シヌクレインとアミロイドの違いとは？
α-シヌクレインはシナプス機能に関与する神経細胞タンパク質であるが、病的状態では折り畳みを誤り、アミロイド様線維を形成する。 “アミロイド” αシヌクレイン線維はパーキンソン病のような病気に特有のものである。
プロテイン・フィブリルとは何か？
タンパク質フィブリルは、高度に秩序化された、βシートに富んだ、フィラメント状の凝集体で、ミスフォールドしたタンパク質や部分的にアンフォールドしたタンパク質によって形成される。これらのフィブリルは通常不溶性で、核形成依存的な重合によって生じる。アミロイドーシスや神経変性疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病など）など、様々な病態に関連している。しかしながら、いくつかの機能的なタンパク質線維は、バクテリアのカリー線維やクモの絹線維のように、生物系に存在する。
