α-シヌクレインのフィブリルとリボンは、科学的研究で断片化され、より小さなフィブリルスニペットまたは個々のタンパク質分子を生成し、さまざまな実験技術を使用してより簡単に分析できます。VialTweeter超音波処理器は、効率的で信頼性の高いアルファシヌクレイン断片化のために最も一般的に使用される超音波装置の一つです。

研究におけるα-シヌクレイン

α-シヌクレイン線維は、パーキンソン病などの神経変性疾患や、レビー小体型認知症を含む特定の形態の認知症と強く関連するタンパク質凝集体です。α-シヌクレイン線維に焦点を当てた研究は、疾患の進行におけるそれらの役割を理解し、潜在的な治療的介入を開発することを目的としています。α-シヌクレイン線維をより小さな断片に分解することにより、研究者はそれらの特定の構造的特徴を調べることができます。たとえば、α-シヌクレイン線維を断片化することで、研究者はタンパク質、脂質、低分子などの他の分子との相互作用を調べることができます。より小さなフラグメントを生成することにより、これらの相互作用するパートナーに対する結合部位および親和性をより効果的にプローブすることができる。より小さなα-Synフリブリルおよびリボンも、毒性および生化学的効果の変化を示す可能性がある。したがって、迅速かつ簡単なサンプル処理で再現性のある結果を生み出す、信頼性が高く効率的なフラグメンテーション技術が不可欠です。
超音波アルファ - シンフラグメンテーション: VialTweeter超音波処理器は、まったく同じ条件下で同時に最大10本のバイアルを超音波処理する確立された超音波サンプル調製システムです。プログラム可能な設定により、同じ実験を簡単かつ迅速に再実行でき、α-シヌクレインフィブリルフラグメンテーションにおいて信頼性の高い再現性の高い結果が得られます。

超音波処理器によるα-シヌクレインサンプル調製

アルファシヌクレイン線維を研究するための1つのアプローチは、超音波処理などの技術を使用してそれらの抽出および断片化を含む。超音波処理は、高強度、低周波超音波を使用してタンパク質凝集体を破壊し、分解し、より小さなフィブリルまたは個々のタンパク質分子の放出につながるプロセスです。超音波処理器VialTweeterは、この目的のためにαシヌクレイン関連の調査研究で一般的に使用されるデバイスです。

多くの調査研究は、効率的で信頼性の高いα-シヌクレイン線維断片化のためのヒールシャーVialTweeterを使用するアルファ-シヌクレイン線維超音波処理の正確なサンプル調製プロトコルを記載しています。フィブリルを超音波で断片化することにより、研究者は得られた製品を分析し、それらの構造、毒性、および他の分子との相互作用を調べることができます。この研究は、神経変性の根底にあるメカニズムに関する重要な洞察を提供し、新しい治療標的を特定する可能性があります。VialTweeter超音波処理器を使用した確立されたαシヌクレイン超音波処理プロトコルは、信頼性が高く再現性のある結果を可能にします。

上の画像:断片化されていないα-シヌクレイン線維
下の画像:超音波断片化アルファシヌクレイン線維バイアルツイーター超音波処理器
(研究と画像:©Dieriksら、2022年)

α-シヌクレインフィブリルの超音波断片化 – プロトコル

多くの研究者が均一なα-シヌクレイン線維フラグメントを生成するための好ましいフラグメンテーション技術としてVialTweeter超音波処理器を使用するので、確立されたプロトコルは容易に利用可能である。以下に、いくつかの例示的なフラグメンテーションプロトコルを示します。
 

 
クリアタウ種子の準備: ClearTauフィブリルをdH2Oで10μMに希釈し、バイアルツイーター付き超音波処理器UP200Stを使用して、チューブ内の1秒オン1秒オフサイクルで50秒間70%振幅で超音波処理した。種子は電子顕微鏡によって特徴付けられた。
ThS蛍光測定: クリアタウフィブリルをdH2Oで2.5μMに希釈し、バイアルツイーター付きUP200Stを使用してチューブ内で1秒オン1秒オフサイクルで50秒間70%振幅で超音波処理した。2.5 μM全長Tau 4R2Nモノマーをコントロールとして用いた。100 μlの反応に100 μlのThS(10 μM)を加え、最終タンパク質濃度は1.25 μMでした。シングルタイムポイントThS蛍光は、FLUOstar Omegaマイクロプレートリーダーにセットアップされた96枚のウェルクリアボトムプレートを使用して測定され、445 nmでの励起と485 nmでの発光が記録されました。
(cf. リモレンコら, 2023)
 
超音波処理を使用した均一なα-シヌクレイン長: α-synフィブリルおよびリボンの長さの不均一性は、75%振幅、0.5秒パルスに設定されたVialTweeter内の2mlエッペンドルフチューブ中の氷上で20分間超音波処理によって減少した。
(cf. ブセら, 2013)
 
ヒト組換えモノマーWTまたはS129A a-Synおよびそれらが生成する繊維状多形体ならびにa-Syn 1–110の品質管理を行った。続いて、原線維多形をVialTweeter超音波処理器内の2mLエッペンドルフチューブ中で20分間超音波処理によって断片化し、エンドサイトーシスに適した平均サイズ42〜52nmの繊維状粒子を生成する。
(cf. シュリバスタヴァら、2020年)
 

5つのフィブリルα-Syn多形のキャラクタリゼーション。(A)VialTweeterによるフラグメンテーション前(上レーン)およびフラグメンテーション後(下レーン)の負染色されたα-Synフィブリル多形のフィブリル、リボン、フィブリル-91、フィブリル-65、およびフィブリル-110の透過型電子顕微鏡写真を示す。(B)断片化されたフィブリル多形体の長さ分布を示す。ヒストグラムが導出されたフィブリルアセンブリの数(n)が示されている。
(研究と画像:シュリバスタヴァら、2020年)

 
α-Synフィブリルは、TEM分析によって評価された平均サイズ42〜52nmのフィブリル粒子を生成するために、VialTweeter内の2mlエッペンドルフチューブ中で20分間超音波処理によって断片化された。
(ネグリーニら、2022年参照)
 
再懸濁されたフィブリル91(PBS中)を、バイアルツイーター超音波処理器を使用して2mLエッペンドルフチューブ中で20分間超音波処理することにより細胞培養物に添加する前に断片化し、分注し、液体窒素中で瞬間凍結し、-80°Cで使用するまで保存した。
(参照:ヴァイホイら、2021年)
 

バイアルツイーターとα-シンフラグメンテーションのためのラボ超音波処理器

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以下の表は、ラボサイズの超音波処理器のおおよその処理能力を示しています。