VialTweeter Sonicatorを使用したα-シヌクレインフラグメンテーション

α-シヌクレインの線維とリボンは、科学研究で断片化されて、より小さな線維断片や個々のタンパク質分子を生成し、さまざまな実験手法を使用してより容易に分析できます。世界 VialTweeter 超音波処理機は、効率的で信頼性の高いα-シヌクレインの断片化に最も一般的に使用される超音波処理器の1つです。

研究におけるα-シヌクレイン

α-シヌクレイン線維は、パーキンソン病などの神経変性疾患や、レビー小体型認知症などの特定の形態の認知症と強く関連しているタンパク質凝集体です。α-シヌクレイン線維に焦点を当てた研究は、疾患の進行におけるそれらの役割を理解し、潜在的な治療介入を開発することを目的としています。α-シヌクレイン線維を小さな断片に分解することで、研究者はそれらの特定の構造的特徴を調べることができます。例えば、α-シヌクレイン線維を断片化することで、研究者はタンパク質、脂質、低分子などの他の分子との相互作用を調べることができます。より小さなフラグメントを作製することにより、これらの相互作用パートナーに対する結合部位と親和性をより効果的にプローブできます。より小さなα-Synフリブリルとリボンも、毒性と生化学的影響の変化を示す可能性があります。したがって、迅速かつ簡単なサンプル処理で再現性のある結果を生み出す、信頼性と効率性に優れたフラグメンテーション技術が不可欠です。
超音波α-Synフラグメンテーション: 世界 VialTweeter 超音波処理器は、まったく同じ条件下で最大10本のバイアルを同時に超音波処理する確立された超音波サンプル調製システムです。プログラム可能な設定により、同じ実験を簡単かつ迅速に再実行できるため、α-シヌクレイン線維の断片化において高い信頼性と再現性のある結果が得られます。

ソニケーターによるα-シヌクレインサンプル調製

α-シヌクレイン線維を研究するための1つのアプローチは、超音波処理などの技術を用いたそれらの抽出および断片化を含む。超音波処理は、高強度の低周波超音波を使用してタンパク質凝集体を破壊し分解し、より小さなフィブリルまたは個々のタンパク質分子を放出するプロセスです。超音波処理機VialTweeterは、この目的のためにα-シヌクレイン関連の調査研究で一般的に使用されるデバイスです。

数多くの調査研究は、効率的で信頼性の高いα-シヌクレインフィブリル断片化のためのヒールシャーVialTweeterを使用するα-シヌクレインフィブリル超音波処理の正確なサンプル調製プロトコルを記述しています。フィブリルを超音波で断片化することにより、研究者は得られた製品を分析し、それらの構造、毒性、および他の分子との相互作用を調べることができます。この研究は、神経変性の根底にあるメカニズムに関する重要な洞察を提供し、新しい治療標的を特定する可能性があります。VialTweeterソニケーターを使用した確立されたα-シヌクレイン超音波処理プロトコルにより、信頼性と再現性のある結果が得られます。

上の画像:未断片化のα-シヌクレイン線維
下の画像:超音波で断片化されたα-シヌクレイン線維と VialTweeter ソニケーター
(研究と画像:©Dieriks et al., 2022)

α-シヌクレイン線維の超音波断片化 – プロトコル

多くの研究者がVialTweeterソニケーターを好ましいフラグメンテーション技術として使用して均一なα-シヌクレインフィブリルフラグメントを生成するため、確立されたプロトコルが容易に利用できます。以下に、いくつかの例示的なフラグメンテーションプロトコルを示します。
 

 
ClearTauシードの準備: ClearTauフィブリルをdH2Oで10μMに希釈し、超音波処理器UP200StとVialTweeterを使用して、1秒オン1秒オフサイクルで50秒間70%の振幅で超音波処理しました。種子は電子顕微鏡法によって特徴付けられました。
ThS蛍光測定: ClearTauフィブリルをdH2Oで2.5μMに希釈し、UP200StとVialTweeterを使用して、1秒オン1秒オフサイクルのチューブ内サイクルで70秒の振幅で50秒間超音波処理しました。2.5 μM全長Tau 4R2Nモノマーをコントロールとして使用しました。100 μlの反応液に100 μLのThS(10 μM)を添加し、最終タンパク質濃度は1.25 μMでした。FLUOstar Omegaマイクロプレートリーダーに設置した96枚のウェルクリアボトムプレートを用いて、445 nmの励起と485 nmの発光を記録し、シングルタイムポイントThS蛍光を測定しました。
(参考:Limorenko et al., 2023)
 
超音波処理を使用した均一なα-シヌクレインの長さ: α-synフィブリルおよびリボンの長さの不均一性は、75%の振幅、0.5秒パルスに設定されたVialTweeterの2mlのEppendorfチューブで氷上で20分間超音波処理することにより減少した。
(cf. Bousset et al., 2013)
 
ヒト組換えモノマーWTまたはS129A a-Synとそれらが生成する繊維多形、およびa-Syn 1-110の品質管理を行った。続いて、原線維多形を超音波処理により20分間超音波処理により断片化した 2mLエッペンドルフチューブ VialTweeter超音波装置で、エンドサイトーシスに適した平均サイズ42〜52nmの繊維粒子を生成しました。
(cf. Shrivastava et al., 2020)
 

5つの原線維α-Syn多形の特性評価。(A)VialTweeter(下レーン)での断片化前(上側レーン)および断片化後(下側レーン)の負に染色されたα-Syn繊維多形体線維、リボン、fibrils-91、fibrils-65、およびfibrils-110の透過型電子顕微鏡写真が示されています。(B)断片化された繊維状多形の長さ分布が示されています。ヒストグラムが導出された線維アセンブリの数(n)が示されています。
(研究と画像:Shrivastava et al., 2020)

 
α-Synフィブリルを、VialTweeterの2mlエッペンドルフチューブで20分間超音波処理することにより断片化し、TEM分析によって評価された平均サイズ42〜52nmのフィブリラ粒子を生成しました。
(参照:Negrini et al., 2022)
 
再懸濁したfibrils91(PBS中)を細胞培養物に加える前に、Vial Tweeterソニケーターを使用して2mLのEppendorfチューブで20分間超音波処理し、分注し、液体窒素で瞬間凍結し、-80°Cで使用するまで保存した。
(cf. Vajhøj et al., 2021)
 

VialTweeterとラボソニケーター α-Synフラグメンテーション用

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以下の表は、ラボサイズの超音波装置のおおよその処理能力を示しています。