VialTweeterソニケーターによるαシヌクレイン断片化

α-シヌクレイン線維やリボンは、科学研究において、より小さな線維断片や個々のタンパク質分子を生成するために断片化されます。VialTweeter Sonicatorは、効率的で信頼性の高いαシヌクレイン断片化に最もよく使用される超音波破砕機の1つです。

研究におけるα-シヌクレイン

αシヌクレイン線維は、パーキンソン病やレビー小体型認知症などの神経変性疾患と強く関連するタンパク質凝集体である。α-シヌクレイン線維に焦点を当てた研究は、疾患進行におけるその役割を理解し、治療的介入の可能性を開発することを目的としている。α-シヌクレイン線維をより小さな断片に分解することによって、研究者はその特異的な構造的特徴を調べることができる。例えば、α-シヌクレイン線維を断片化することで、タンパク質、脂質、低分子などの他の分子との相互作用を調べることができる。より小さな断片を作ることで、これらの相互作用相手に対する結合部位や親和性をより効果的に調べることができる。より小さなα-Synフリブリルやリボンは、毒性や生化学的効果も変化させる可能性がある。従って、迅速で簡単なサンプル処理で再現性のある結果が得られる、信頼性が高く効率的な断片化技術が重要である。
超音波によるアルファシン・フラグメンテーション： VialTweeterソニケーターは、最大10本のバイアルを全く同じ条件で同時に超音波処理する、定評ある超音波サンプル前処理システムです。プログラム可能な設定により、同じ実験を簡単かつ迅速に再実行できるため、αシヌクレイン線維断片化において高い信頼性と再現性のある結果が得られます。

ソニケーターによるα-シヌクレインサンプル調製

α-シヌクレイン線維を研究する一つのアプローチとして、超音波処理などの技術を用いた線維の抽出と断片化がある。ソニケーションとは、高強度、低周波の超音波を用いてタンパク質の凝集体を破壊、分解し、より小さな線維や個々のタンパク質分子を放出させるプロセスである。ソニケーターVialTweeterは、この目的のためにα-シヌクレイン関連の研究において一般的に使用されている装置である。

数多くの研究において、α-シヌクレイン線維の超音波破砕の正確なサンプル調製プロトコールが記載されており、効率的で信頼性の高いα-シヌクレイン線維の破砕のためにHielscher VialTweeterが使用されています。フィブリルを超音波で断片化することにより、研究者は得られた生成物を分析し、その構造、毒性、他の分子との相互作用を調べることができる。この研究は、神経変性の基礎となるメカニズムに関する重要な洞察を提供し、新たな治療標的を特定する可能性がある。VialTweeterソニケーターを用いた確立されたα-シヌクレイン超音波処理プロトコールにより、信頼性と再現性の高い結果が得られます。

上図：断片化されていないαシヌクレイン線維
下の画像：VialTweeterソニケーターで超音波破砕したαシヌクレイン線維
(研究および画像：©Dieriks et al, 2022）

α-シヌクレイン線維の超音波フラグメンテーション – プロトコル

多くの研究者が、均一なα-シヌクレイン線維断片を生成するための好ましいフラグメンテーション技術としてVialTweeterソニケーターを使用しているため、確立されたプロトコールが容易に利用できます。以下に、いくつかの例示的なフラグメンテーションプロトコルを示します。
 

 
クリアタウ種子の準備： クリアタウ線維をdH2Oで10μMに希釈し、VialTweeter付きソニケーターUP200Stを用い、チューブ内で1秒ON 1秒OFFのサイクルで、振幅70 %で50秒間超音波処理した。種子を電子顕微鏡で観察した。
ThS蛍光測定： クリアタウ線維をdH2Oで2.5μMに希釈し、UP200StとVialTweeterを用い、チューブ内で1秒ON 1秒OFFのサイクルで、振幅70%で50秒間超音波処理した。2.5μMの全長タウ4R2Nモノマーをコントロールとして用いた。100μlの反応液に100μlのThS（10μM）を加え、最終タンパク質濃度を1.25μMとした。96ウェルクリアボトムプレートをFLUOstar Omegaマイクロプレートリーダーにセットし、励起波長445 nm、発光波長485 nmでThS蛍光を測定した。
(リモレンコ他、2023年参照）。
 
超音波処理によるα-シヌクレインの長さの均一化： α-synフィブリルとリボンの長さの不均一性は、75%の振幅、0.5秒パルスに設定したVialTweeterで、2mlエッペンドルフチューブ中、氷上で20分間超音波処理することにより減少させた。
(Bousset et al.）
 
ヒト組換え単量体WTまたはS129A a-Synとそれらが生成するフィブリル多形体およびa-Syn 1-110の品質管理を行った。その後、エンドサイトーシスに適した平均サイズ42-52 nmのフィブリル状粒子を生成するために、フィブリル状多形体をVialTweeter超音波発生装置で2mLエッペンドルフチューブ中で20分間超音波処理することにより断片化した。
(シュリバスタヴァら、2020参照）。
 

5種類のフィブリルα-Syn多形の特性。(A）VialTweeterによる断片化前（上のレーン）と断片化後（下のレーン）の、ネガティブ染色したα-Synのフィブリル、リボン、フィブリル-91、フィブリル-65、フィブリル-110の透過型電子顕微鏡写真を示す。(B）断片化されたフィブリル多形の長さ分布を示す。ヒストグラムが得られた線維集合体の数（n）を示す。
(研究および画像：Shrivastava他、2020年）

 
α-SynフィブリルをVialTweeterで2mlエッペンドルフチューブ中で20分間超音波処理することにより断片化し、TEM分析で評価した平均サイズ42-52nmのフィブリル粒子を生成した。
(ネグリーニら、2022年参照）。
 
再懸濁したフィブリル91（PBS中）は、細胞培養に加える前に、Vial Tweeterソニケーターを用いて2mLのエッペンドルフチューブで20分間超音波処理することで断片化し、分注した後、液体窒素で瞬間凍結し、使用するまで-80 ̊Cで保存した。
(ヴァイホイら、2021年参照）。
 

α-SynフラグメンテーションのためのVialTweeterとラボ用ソニケーター

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下の表は、ラボ用超音波処理装置の処理能力の目安です：