Disagregasi Sel Ultrasonik pada Sampel Bakteri

Sampel bakteri jarang tersedia sebagai suspensi sel tunggal yang sesungguhnya. Kultur tumbuh dalam bentuk rantai dan flok, isolat lingkungan membentuk agregat yang terikat oleh zat polimer ekstraseluler, dan pelet hasil sentrifugasi sering sulit disuspensikan kembali meskipun telah dicampur dengan vorteks secara menyeluruh. Penghitungan sel hidup, densitas optik, sitometri alir, dan pemrofilan mikrobioma semuanya mengasumsikan bahwa satu partikel setara dengan satu sel. Disagregasi sel ultrasonik mengatasi ketidaksesuaian tersebut: paparan sonikasi singkat yang terkontrol memisahkan agregat menjadi sel-sel tunggal tanpa melisiskannya.

Mengapa Agregasi Sel Mengganggu Hasil Anda

Agregasi merupakan karakteristik biologis, bukan kesalahan preparasi. Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces, dan banyak spesies lingkungan tumbuh dalam bentuk rantai, gugus, atau fragmen biofilm, sementara DNA ekstraseluler dan polisakarida merekatkan sel-sel dalam pelet dan eluat usap. Konsekuensi analitisnya bersifat sistematis:

• Jumlah koloni terhitung terlalu rendah karena satu gumpalan menghasilkan satu koloni, berapa pun jumlah sel yang dikandungnya.
• Pengukuran densitas optik dan penghitung partikel melaporkan agregat alih-alih sel, sehingga menimbulkan bias pada kurva pertumbuhan.
• Sitometri alir dan penyortiran sel salah menghitung kejadian yang melibatkan gumpalan sel dan mengecualikannya dari analisis.
• Ekstraksi DNA dan protein hanya merepresentasikan sel-sel pada permukaan agregat, sehingga mendistorsi data mikrobioma dan omik.

Metode penanganan konvensional lambat, tidak tuntas, atau menyebabkan perubahan kimiawi. Pemipetan dan pencampuran dengan vorteks secara kuat masih menyisakan mikroagregat. Dispersi berbasis enzim atau pengkelat memodifikasi permukaan sel yang mungkin ingin Anda analisis. Disagregasi mekanis melalui kavitasi terkontrol bekerja dalam hitungan detik dan tidak memerlukan bahan tambahan.

Bagaimana Sonikasi Menguraikan Agregat Sel Tanpa Melisiskannya

Disagregasi sel ultrasonik memanfaatkan perbedaan kekuatan mekanis. Agregat bakteri disatukan oleh ikatan antarsel yang relatif lemah dan matriks ekstraseluler, sedangkan selubung sel yang utuh mampu menahan gaya geser yang jauh lebih tinggi. Ketika ultrasonik yang terkalibrasi memasuki suspensi, kavitasi akustik menghasilkan aliran mikro, pulsa tekanan, dan gaya geser yang mula-mula bekerja pada antarmuka agregat. Gumpalan, rantai, dan fragmen biofilm dipisahkan oleh gaya geser (deaglomerasi) sebelum tercapai tingkat energi yang menyebabkan membran pecah (lisis).

Disagregasi Ultrasonik Gumpalan Sel Bakteri

Disagregasi atau Lisis – Peran Parameter Sonikasi

Konsekuensi praktisnya adalah bahwa disagregasi dan lisis dilakukan dengan instrumen yang sama, yang dioperasikan pada parameter berbeda. Dengan amplitudo sedang, siklus pulsa singkat, dan suhu terkontrol, Anda memperoleh suspensi sel tunggal yang tetap hidup. Peningkatan amplitudo, waktu paparan, atau suhu sampel mengarahkan proses menuju disrupsi sel menyeluruh untuk memperoleh target intraseluler. Generator Hielscher memungkinkan Anda mengatur amplitudo, daya, pulsa, dan masukan energi secara presisi serta menyimpan metode, sehingga tahap disagregasi dapat direproduksi pada berbagai sampel, operator, dan proses.

Sonikasi Tanpa Kontak yang Efisien

Sonikasi dalam bak tidak dapat menandingi tingkat kontrol ini. Bak dan tangki pembersih ultrasonik hanya menyediakan energi ultrasonik yang rendah, sehingga preparasi tidak tuntas, dan kavitasi terjadi secara tidak merata, sehingga perlakuan setiap tabung bergantung pada posisinya di dalam bak. VialTweeter mentransmisikan gaya ultrasonik yang kuat dan terfokus langsung melalui dinding wadah ke hingga 10 sampel tertutup rapat secara bersamaan. Perlakuan yang memerlukan paparan lama dan bervariasi dalam bak dapat diselesaikan dengan pola pulsa yang terstandarisasi.
Sonikator tanpa kontak Hielscher menerapkan ultrasonik yang kuat dan terfokus melalui dinding vial tertutup. VialTweeter memproses hingga 10 vial secara bersamaan pada intensitas yang identik, tanpa probe di dalam sampel, tanpa kontaminasi silang, dan tanpa pelepasan aerosol. Ketika kebutuhan kapasitas pemrosesan sampel meningkat, sonikator mikroplat UIP400MTP dan UIP550MTP memperluas transfer energi terkontrol yang sama ke plat multisumur.

Keunggulan Disagregasi Ultrasonik Tanpa Kontak

• Tanpa kontaminasi silang: Karena vial tetap tertutup sepanjang waktu dan tidak ada probe yang dicelupkan ke dalam sampel, kontaminasi silang dan kehilangan sampel sepenuhnya dihindari. Tidak ada yang perlu disterilkan di antara sampel, dan satu proses tidak dapat memengaruhi proses berikutnya.
• Perlindungan terhadap aerosol: Sonikasi dengan probe terbuka menghasilkan aerosol infeksius dan mencemari permukaan instrumen. Sonikasi dalam vial tertutup rapat menahan sampel di dalam tabungnya sendiri, yang penting saat menangani bakteri patogen seperti Mycobacterium tuberculosis dan agen BSL-2 atau BSL-3 lainnya.
• Tanpa erosi ujung probe: Probe titanium dapat melepaskan sejumlah kecil mikropartikel ke dalam sampel selama pengoperasian. Partikel tersebut mengubah densitas optik dan hasil penghitungan partikel pada tahap berikutnya. Sonikasi tidak langsung melalui dinding wadah menghilangkan sumber zat padat ini sepenuhnya.
• Pemrosesan sampel yang seragam: VialTweeter memberikan intensitas ultrasonik yang sama pada setiap vial dari hingga 10 vial, sehingga hasil sonikasi merata dan dapat direproduksi. Efek posisi yang mengganggu bak sonikasi dan penggunaan probe pada sampel tunggal hilang, dan nilai dasar Anda tetap dapat dibandingkan antarulangan.
• Integritas sampel: Tabung tetap tertutup sepanjang pemrosesan, sehingga sampel tidak dapat terkontaminasi, rusak, atau menguap. Volume kecil dapat diproses tanpa pengenceran, termasuk pelet klinis berharga yang tidak memungkinkan adanya tahap pemindahan tambahan.
• Kontrol proses: Amplitudo dapat diatur dari 20 hingga 100%, mode pulsa dari 0 hingga 100%, dan sistem mendukung pemantauan suhu agar galur dan protein yang sensitif terhadap panas tetap berada di bawah ambang suhu yang menyebabkan kerusakan.

Aplikasi Umum

• Analisis mikrobioma dan isi usus: mendispersikan Lactobacillus, Bifidobacterium, dan sampel feses sebelum penanaman pada plat atau sekuensing, sehingga hasil penghitungan tidak menjadi terlalu rendah akibat gumpalan.
• Mikrobiologi pangan dan air: menguraikan flok dalam sampel usap, cairan bilasan, dan kaldu pengayaan untuk penentuan jumlah koloni dan viabilitas yang akurat.
• Penelitian biofilm: memperoleh kembali sel dari bahan pembawa dan permukaan sebagai suspensi sel tunggal, tanpa perlakuan enzimatis yang akan menghilangkan protein permukaan.
• Diagnostik klinis: menyuspensikan kembali sputum, nanah, dan eluat usap dalam kondisi penahanan biologis.
• Kultur sel: memisahkan agregat sel mamalia, serangga, dan CHO yang menggumpal sebelum penghitungan dan pasase.
• Preparasi untuk seluruh alur kerja: instrumen yang sama yang melakukan disagregasi pada amplitudo rendah melakukan disrupsi sel menyeluruh pada pengaturan lebih tinggi, sehingga lisis, ekstraksi protein, dan fragmentasi DNA dapat dilanjutkan tanpa memindahkan sampel ke tabung lain.

Literatur / Referensi

• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
• Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.