Disagregasi Sel dengan Ultrasonik pada Sampel Bakteri

Sampel bakteri jarang tiba dalam bentuk suspensi sel tunggal yang sesungguhnya. Kultur bakteri tumbuh dalam bentuk rantai dan gumpalan, sedangkan isolat lingkungan membentuk agregat yang terikat oleh zat polimer ekstraseluler, dan endapan hasil sentrifugasi seringkali sulit disuspensikan kembali meskipun telah diaduk secara menyeluruh dengan vortex. Penghitungan sel hidup, densitas optik, sitometri aliran, dan profil mikrobioma semuanya mengasumsikan bahwa satu partikel sama dengan satu sel. Disagregasi sel dengan ultrasonik mengatasi masalah tersebut: semburan sonikasi yang singkat dan terkendali memisahkan agregat menjadi sel tunggal tanpa melisisnya.

Mengapa Agregasi Sel Dapat Mempengaruhi Hasil Anda

Agregasi merupakan ciri biologis, bukan kesalahan dalam persiapan sampel. Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces, dan banyak spesies lingkungan tumbuh dalam bentuk rantai, kelompok, atau fragmen biofilm, dan DNA ekstraseluler serta polisakarida mengikat sel-sel tersebut menjadi gumpalan dalam endapan dan larutan hasil usap. Dampaknya terhadap analisis bersifat sistematis:

• Jumlah koloni sering kali diremehkan, karena satu gumpalan menghasilkan satu koloni terlepas dari berapa banyak sel yang terkandung di dalamnya.
• Kepadatan optik dan penghitung partikel melaporkan agregat, bukan sel, sehingga menimbulkan bias pada kurva pertumbuhan.
• Sitometri aliran dan pemisahan sel salah menghitung peristiwa yang menggumpal dan mengesampingkannya dari analisis.
• Ekstraksi DNA dan protein hanya mewakili sel-sel yang terdapat pada permukaan agregat, sehingga menyebabkan data mikrobioma dan omik menjadi tidak akurat.

Metode konvensional cenderung lambat, tidak tuntas, atau menimbulkan perubahan kimiawi. Proses pipet dan vortexing yang intensif tetap meninggalkan mikro-agregat. Dispersi enzimatis atau berbasis khelator dapat mengubah permukaan sel yang mungkin ingin Anda analisis. Disagregasi mekanis melalui kavitasi terkendali bekerja dalam hitungan detik dan tidak memerlukan bahan tambahan.

Bagaimana Sonikasi Memisahkan Sel Tanpa Merusaknya

Disagregasi sel dengan ultrasonik memanfaatkan perbedaan kekuatan mekanis. Agregat bakteri disatukan oleh ikatan antar sel yang relatif lemah dan matriks ekstraseluler, sedangkan selubung sel yang utuh mampu menahan gaya geser yang jauh lebih tinggi. Saat gelombang ultrasonik yang telah dikalibrasi memasuki suspensi, kavitasi akustik menghasilkan aliran mikro, pulsa tekanan, dan gaya geser yang pertama-tama bekerja pada antarmuka agregat. Gumpalan, rantai, dan fragmen biofilm terpisah akibat gaya geser (deaglomerasi) sebelum tingkat energi yang menyebabkan pecahnya membran (lisis) tercapai.

Disagregasi Gumpalan Sel Bakteri dengan Ultrasonik

Disagregasi atau Lisis – Pentingnya Parameter Sonikasi

Konsekuensi praktisnya adalah bahwa disaggregasi dan lisis merupakan instrumen yang sama yang dioperasikan dengan parameter yang berbeda. Pada amplitudo sedang, siklus pulsa pendek, dan suhu yang terkendali, Anda akan memperoleh suspensi sel tunggal yang masih hidup. Meningkatkan amplitudo, waktu paparan, atau suhu sampel akan mengarahkan proses menuju penghancuran sel sepenuhnya untuk menargetkan komponen intraseluler. Generator Hielscher memungkinkan Anda mengatur amplitudo, daya, pulsa, dan masukan energi secara presisi serta menyimpan metode tersebut, sehingga langkah disagregasi dapat direproduksi secara konsisten di seluruh sampel, operator, dan proses pengujian.

Sonikasi Tanpa Kontak yang Efisien

Pembersihan dengan sonikasi dalam bak tidak dapat menandingi tingkat kontrol ini. Bak dan tangki pembersih ultrasonik hanya menghasilkan energi ultrasonik yang rendah, sehingga persiapan sampel menjadi tidak sempurna, dan kavitasi terjadi secara tidak merata; akibatnya, setiap tabung diproses sesuai dengan posisinya di dalam bak. VialTweeter memancarkan gaya ultrasonik yang intens dan terfokus langsung melalui dinding wadah ke dalam hingga 10 sampel tertutup secara bersamaan. Perawatan yang memerlukan paparan lama dan bervariasi dalam bak dapat diselesaikan dengan pola pulsa yang terstandarisasi.
Alat sonikasi tanpa kontak Hielscher menerapkan gelombang ultrasonik yang intens dan terfokus melalui dinding botol tertutup. VialTweeter dapat memproses hingga 10 botol secara bersamaan dengan intensitas yang sama, tanpa probe di dalam sampel, tanpa kontaminasi silang, dan tanpa pelepasan aerosol. Apabila diperlukan kapasitas produksi yang tinggi, sonikator pelat mikro UIP400MTP dan UIP550MTP menerapkan transfer energi terkontrol yang sama pada pelat multi-sumur.

Keunggulan Disagregasi Ultrasonik Tanpa Kontak

• Tidak ada kontaminasi silang: Karena botol-botol tersebut tetap tertutup rapat dan tidak ada probe yang dicelupkan ke dalam sampel, kontaminasi silang dan kehilangan sampel dapat dihindari sepenuhnya. Tidak ada yang perlu disterilkan di antara pengujian sampel, dan satu siklus pengujian tidak akan memengaruhi siklus berikutnya.
• Perlindungan terhadap aerosol: Sonikasi dengan probe terbuka menghasilkan aerosol yang menular dan mencemari permukaan instrumen. Sonikasi dengan tabung tertutup menahan sampel di dalam tabungnya sendiri, yang menjadi hal penting saat menangani bakteri patogen seperti Mycobacterium tuberculosis dan agen BSL-2 atau BSL-3 lainnya.
• Tidak ada pengikisan tip: Sonda titanium dapat melepaskan sejumlah kecil partikel mikro ke dalam sampel selama pengoperasian. Partikel-partikel tersebut mengubah kepadatan optik dan jumlah partikel pada tahap selanjutnya. Sonikasi tidak langsung melalui dinding wadah dapat menghilangkan sumber partikel padat ini sepenuhnya.
• Laju aliran yang seragam: VialTweeter memberikan intensitas ultrasonik yang sama ke masing-masing dari hingga 10 vial, sehingga hasil sonikasi menjadi merata dan dapat direproduksi. Efek posisi yang sering menjadi masalah pada bak sonikasi dan pengujian sampel tunggal pun hilang, dan garis dasar Anda tetap dapat dibandingkan di antara replikasi.
• Integritas sampel: Tabung tetap tertutup selama seluruh proses, sehingga sampel tidak dapat terkontaminasi, rusak, atau menguap. Sampel dengan volume kecil dapat diproses tanpa perlu diencerkan, termasuk pellet klinis yang sangat berharga yang tidak memungkinkan adanya langkah pemindahan tambahan.
• Kontrol Proses: Amplitudo dapat disesuaikan dari 20 hingga 100%, mode pulsa dari 0 hingga 100%, dan sistem ini mendukung pemantauan suhu sehingga strain dan protein yang sensitif terhadap suhu tetap berada di bawah ambang batas yang dapat menyebabkan kerusakan.

Aplikasi Khas

• Analisis mikrobioma dan isi usus: mendispersikan Lactobacillus, Bifidobacterium, dan sampel feses sebelum ditanam pada media atau dilakukan sekuensing, agar jumlahnya tidak berkurang akibat penggumpalan.
• Mikrobiologi pangan dan air: pemisahan gumpalan pada sampel usap, larutan bilasan, dan kaldu pengayaan untuk penentuan koloni dan viabilitas yang akurat.
• Penelitian biofilm: memisahkan sel-sel dari pembawa dan permukaan dalam bentuk suspensi sel tunggal, tanpa perlakuan enzimatik yang dapat menghilangkan protein permukaan.
• Diagnostik klinis: pengenceran kembali dahak, nanah, dan larutan hasil usap dalam kondisi pengendalian.
• Kultur sel: memisahkan gumpalan sel mamalia, serangga, dan CHO sebelum dilakukan penghitungan dan pemindahan kultur.
• Persiapan alur kerja secara menyeluruh: instrumen yang sama yang dapat melakukan pemisahan pada amplitudo rendah juga mampu melakukan penghancuran sel secara menyeluruh pada pengaturan yang lebih tinggi, sehingga proses lisis, ekstraksi protein, dan fragmentasi DNA dapat dilanjutkan tanpa perlu memindahkan sampel antar tabung.

Literatur / Referensi