Protokol Budidaya dan Detasemen Biofilm Staphylococcus

Metode standar sangat penting untuk hasil penelitian yang andal. Di sini Anda dapat menemukan protokol budidaya dan detasemen untuk biofilm stafilokokus. Protokol ini berfokus pada persiapan sampel throughput tinggi yang disederhanakan menggunakan sonicator pelat multi-sumur UIP400MTP untuk detasemen biofilm throughput tinggi yang efisien dalam pelat 96 sumur. Protokol ini juga berisi langkah-langkah kunci untuk budidaya, pencucian, dan visualisasi biofilm, dengan fokus pada meminimalkan variabilitas dan memastikan reproduktifitas.

Penelitian Biofilm Staphylococcus dan Antibiotik

Biofilm staphylococcus memainkan peran penting dalam infeksi persisten karena resistensinya terhadap antibiotik dan respons imun. Pembentukan biofilm menyediakan lingkungan pelindung bagi bakteri, membuat infeksi sulit diobati. Penelitian biofilm sering berfokus pada pemahaman pembentukan, perilaku, dan kerentanannya terhadap antimikroba, dengan penekanan pada metode throughput tinggi untuk merampingkan alur kerja eksperimental.
Sonicator pelat multi-sumur UIP400MTP menawarkan keuntungan yang signifikan dalam penelitian biofilm dengan memungkinkan pelepasan biofilm yang cepat dan efisien dari pelat 96 sumur. Perangkat ini memberikan energi ultrasonik yang seragam ke semua sumur, memastikan hasil yang konsisten sekaligus meminimalkan variabilitas.

Protokol Budidaya dan Detasemen Biofilm Staphylococcus

Di bawah ini, kami memandu Anda dengan instruksi langkah demi langkah melalui proses budidaya dan pelepasan biofilm staphylococcus. Sebagai langkah analitik teladan, kami menunjukkan kepada Anda cara mengukur secara spektrofotometri biomassa yang dibudidayakan dengan pewarnaan kristal ungu.

Budidaya Biofilm Staphylococcus

Bahan yang Dibutuhkan:

• Pelat mikrotiter yang diolah kultur jaringan polistirena 96 sumur beralas datar steril dengan tutup
• Kaldu Kedelai Triptik (TSB) dengan glukosa 0,25%
• Kabinet keamanan biologis

Langkah:

1. Siapkan lingkungan kerja yang steril di lemari pengaman biologis untuk meminimalkan kontaminasi.
2. Tambahkan TSB yang mengandung 0,25% glukosa ke sumur pelat mikrotiter. TSB tanpa glukosa umumnya tidak mendukung pembentukan biofilm dan hanya boleh digunakan sebagai kontrol jika diperlukan.
3. Inokulasi sumur dengan strain bakteri yang disiapkan seperti yang dijelaskan di bawah ini:
4. Siapkan suspensi bakteri, pastikan tidak ada kelompok sel yang sudah ada sebelumnya dengan menghomogenkan suspensi menggunakan sonikasi atau dengan memecah kelompok dengan jarum 23-gauge dan pusaran singkat.
5. Tutup piring dengan tutupnya dan inkubasi dalam kondisi optimal untuk pembentukan biofilm (misalnya, 37°C selama 24 jam).
6. Lakukan percobaan tiga kali lipat untuk setiap strain bakteri (tiga sumur per strain) untuk memastikan keandalan.
7. Alokasikan enam sumur per piring untuk kontrol negatif. Hingga 30 strain dapat diuji per pelat 96 sumur.

Visualisasi dan Pencucian Biofilm

1. Setelah inkubasi, buang media dengan hati-hati agar tidak mengganggu biofilm.
2. Cuci masing-masing sumur empat kali dengan garam fisiologis untuk menghilangkan bakteri planktonik.
3. Periksa bagian bawah sumur untuk bercak putih yang menunjukkan keberadaan biofilm.

Detasemen Biofilm Menggunakan Sonicator Pelat Multi-Sumur UIP400MTP

Pengaturan dan Parameter Perangkat:

• UIP400MTP sonicator pelat multi-sumur
• Pengaturan pengoperasian: 60% amplitudo, mode siklus dengan 60 detik ON / 30 detik OFF

Langkah:

1. Tempatkan pelat mikrotiter yang sudah dicuci ke platform UIP400MTP.
2. Sonicate sampel pada pengaturan yang disarankan (60% amplitudo, 60 detik ON, 30 detik OFF). Sesuaikan pengaturan dengan strain bakteri.
3. Memulai proses sonikasi untuk melepaskan biofilm. Gelombang ultrasonik mengganggu matriks biofilm, melepaskan bakteri yang melekat.
4. UIP400MTP memastikan paparan yang seragam di semua sumur untuk hasil detasemen yang konsisten.

Langkah Analitik: Kuantifikasi Biomassa Biofilm Staphylococcus yang Terlepas Menggunakan Crystal Violet (CV)

Bahan yang Dibutuhkan:

• 0.1% larutan kristal violet (CV)
• 95% etanol atau 30% asam asetat (untuk pelarutan)
• Pembaca pelat mikro mampu membaca pada 570 nm
• Pelat mikrotiter steril untuk pewarnaan

Langkah:

1. Persiapan Pelat Pewarnaan: Transfer 100 μL suspensi biofilm yang terlepas dari setiap sumur pelat sonikasi ke sumur yang sesuai dari pelat mikrotiter 96 sumur yang bersih dan steril. Ini memastikan lingkungan yang jelas dan seragam untuk pewarnaan.
2. Pewarnaan Biofilm yang Terpisah: Tambahkan 150 μL larutan kristal ungu 0,1% ke setiap sumur yang mengandung suspensi biofilm yang terlepas. Pipet dengan lembut untuk memastikan pencampuran suspensi biofilm dan kristal violet merata.
3. Inkubasi: Biarkan pelat mengerami pada suhu kamar selama 15 menit untuk memungkinkan kristal violet menodai biomassa secara efektif.
4. Mencuci: Setelah inkubasi, buang larutan kristal violet dengan hati-hati dari sumur tanpa mengganggu biomassa. Cuci setiap sumur tiga kali dengan garam fisiologis steril untuk menghilangkan noda yang tidak terikat.
5. Pengeringan: Biarkan pelat mengering pada suhu kamar atau di bawah tudung aliran udara steril. Hindari pemanasan, karena ini dapat mengubah hasil.
6. Pelarutan: Tambahkan 200 μL etanol 95% (atau 30% asam asetat, tergantung pada praktik laboratorium standar) ke setiap sumur untuk melarutkan kristal violet yang terikat. Aduk perlahan dengan cara memipet atau mengocok piring selama 10 menit pada suhu kamar.
7. Pengukuran: Ukur kerapatan optik (OD) dari larutan kristal ungu yang terlarut pada 570 nm menggunakan pembaca pelat mikro.
8. Analisis Data: Kurangi nilai OD570 rata-rata kontrol negatif (sumur dengan TSB tetapi tidak ada inokulum bakteri) dari sumur percobaan untuk memperhitungkan pewarnaan latar belakang. Catat dan analisis data.

Catatan: Lakukan percobaan dalam tiga kali lipat untuk setiap kondisi untuk memastikan reproduktifitas. Pastikan penanganan kristal violet dan etanol yang tepat, mematuhi protokol keselamatan dan pembuangan.
 

Sekilas manfaat utama dari UIP400MTP:

• Pemrosesan Throughput Tinggi: Dirancang khusus untuk pelat multi-sumur, memungkinkan Anda memproses beberapa sampel secara bersamaan.
• Distribusi Ultrasonik Seragam: Memastikan intensitas ultrasonik yang sama di seluruh sumur, memberikan hasil yang konsisten di semua sampel.
• Gunakan pelat standar apa pun: UIP400MTP dapat menangani pelat multi-sumur standar, cawan Petri, dan rak tabung. Tidak diperlukan pelat kepemilikan yang mahal!
• Antarmuka yang ramah pengguna: Mudah diatur dan dikendalikan, menjadikannya alat yang sangat baik untuk meningkatkan produktivitas lab. Pengaturan yang dapat diprogram dan otomatisasi memfasilitasi standarisasi proses!