Protokol menggunakan Hielscher Multi-Sample Sonicators dalam Biofilm dan Analisis Proteomik

Penggunaan sonicator multi-sampel, seperti VialTweeter Multi-Tube Sonicator dan UIP400MTP Microplate Sonicator, merampingkan alur kerja laboratorium untuk aplikasi throughput tinggi. Kedua perangkat memungkinkan pemrosesan ultrasonik yang tepat dan seragam di beberapa sampel, meminimalkan variabilitas dan meningkatkan reproduktifitas. Hal ini sangat menguntungkan dalam percobaan yang membutuhkan lisis sampel yang konsisten, detasemen biofilm, ekstraksi protein, atau pencernaan proteolitik, di mana metode manual atau sampel tunggal kurang efisien dan rentan terhadap inkonsistensi.

Sederhanakan Alur Kerja dengan Sonicator Multi-Sampel

UIP400MTP, misalnya, memungkinkan perawatan ultrasonik simultan dari sumur pelat mikro, memastikan pelepasan biofilm atau bahan seluler yang seragam. Sementara itu, VialTweeter menawarkan lisis dan homogenisasi yang tepat dari beberapa sampel tabung tanpa kontaminasi silang. Sonikator ini secara signifikan mengurangi waktu pemrosesan, meningkatkan reproduktifitas eksperimental, dan mempertahankan integritas sampel yang tinggi, menjadikannya alat yang sangat diperlukan dalam penelitian mikrobiologi, proteomik, dan biologi molekuler.
Di bawah ini adalah protokol terperinci yang mencontohkan penggunaan model sonicator multi-sampel Hielscher, VialTweeter Multi-Tube Sonicator dan Microplate Sonicator UIP400MTP, dalam sebuah penelitian yang melibatkan pembentukan biofilm E. dan analisis proteomik selanjutnya.

Protokol: Pembentukan Biofilm, Detasemen, dan Analisis Proteomik Menggunakan Sonicator Multi-Sampel Hielscher

1. Persiapan Kultur Bakteri

• Kultur bakteri E. (strain W3110) pada suhu 30°C, suhu yang menguntungkan untuk pembentukan biofilm E., dalam media kaldu tripton (TB) yang mengandung:
  – 10 g/L tripton
  – 5 g/L NaCl
• Suplemen dengan antibiotik sesuai kebutuhan untuk memastikan retensi plasmid.
• Untuk studi mikroskop dan aktivitas promotor, gunakan strain W3110 E. dengan reporter genomic enhanced GFP (eGFP) di bawah kendali promotor rplL.
• Manfaatkan plasmid reporter GFP untuk berbagai promotor (misalnya, csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) untuk mengukur aktivitas promotor.

2. Budidaya dan Detasemen Biofilm

• Benih 1,5 mL kultur bakteri encer per sumur ke dalam piring 12 sumur (pelat 12 sumur CellStar, Greiner Bio-One).
• Inkubasi untuk memungkinkan pembentukan biofilm.
• Hapus kultur planktonik (non-melekat) dengan hati-hati.

– Cuci setiap sumur dengan 500 μL PBS.
– Lepaskan sel yang melekat dengan sonikasi pelat 12 sumur di UIP400MTP microplate sonicator. UIP400MTP memastikan detasemen yang seragam dengan memberikan energi ultrasonik yang konsisten di semua sumur.
– Pengaturan sonikasi: 60% amplitudo, mode siklus: 60 detik ON / 30 detik OFF.

3. Pemanenan dan Lisis Sel

• Centrifuge sel biofilm yang terlepas pada 4.500 g selama 5 menit.
• Cuci sel pelet dengan PBS.
• Suspensi kembali sel dalam 100 μL natrium lauroyl sarcosinate (SLS) 2% dan inkubasi pada suhu 95°C selama 15 menit.
• Sonicate menggunakan VialTweeter Multi-Tube Sonicator untuk memastikan lisis sel lengkap.
  – Pengaturan sonikasi: 100% amplitudo, 50 detik ON / 10 s OFF selama total waktu berjalan 10 menit; simpan sampel di atas es.

4. Reduksi dan Alkilasi

• Tambahkan 5 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) untuk mengurangi ikatan disulfida dan inkubasi pada suhu 95°C selama 15 menit.
• Protein alkilat dengan 10 mM iodoacetamide selama 30 menit pada suhu 25°C.

5. Kuantifikasi dan Pencernaan Protein

• Centrifuge lisate untuk membersihkan puing-puing.
• Ukur kandungan protein total menggunakan Kit Uji Protein Pierce BCA.
• Cerna 50 μg total protein dengan 1 μg tripsin dalam larutan yang mengandung 2% SLS dan 100 mM amonium bikarbonat.
• Inkubasi reaksi pencernaan semalaman pada suhu 30°C.

6. Pemurnian Peptida

• Endapkan SLS dengan menambahkan 1,5% asam trifluoroasetat (TFA), lalu centrifuge.
• Memurnikan peptida menggunakan kolom microspin C18.
• Keringkan peptida yang dimurnikan dan suspensi kembali dalam TFA 0,1%.

7. Kromatografi Cair-Spektrometri Massa (LC-MS/MS)

• Analisis peptida pada spektrometer massa Q-Exactive Plus yang digabungkan dengan sistem nano Ultimate 3000 RSLC.
• Pisahkan peptida menggunakan kolom HPLC fase terbalik (75 μm × 42 cm) yang dikemas dengan resin C18 (2,4 μm).
• Oleskan gradien dari 2% hingga 35% pelarut B (asetonitril dengan asam format 0,15%) selama 140 menit.
• Dapatkan data menggunakan pemindaian MS resolusi tinggi diikuti dengan pemindaian MS/MS tandem dari 10 ion paling intens.

8. Analisis Data

• Memproses data LC-MS mentah menggunakan perangkat lunak Progenesis.
• Ekspor file .mgf dan analisis dengan MASCOT.
• Lakukan kuantifikasi peptida menggunakan SafeQuant untuk kontrol kualitas dan penyesuaian penemuan palsu.
• Lakukan semua percobaan dalam duplikat atau tiga kali lipat untuk memastikan reproduktifitas.

Sonicator Multi-Sampel untuk Persiapan Sampel Throughput Tinggi

Model sonicator multi-sampel VialTweeter dan UIP400MTP secara signifikan meningkatkan presisi dan efisiensi alur kerja eksperimental, terutama dalam penelitian biofilm dan proteomik. Kemampuannya untuk memproses beberapa sampel secara seragam memastikan kapasitas throughput tinggi tanpa mengorbankan kualitas data. Manfaat ini, dikombinasikan dengan alur kerja yang disederhanakan yang diuraikan di atas, menjadikan Hielscher multi-sampel sonicators alat penting untuk penelitian biologi modern.

Desain, Manufaktur, dan Konsultasi – Kualitas Buatan Jerman

Ultrasonicators Hielscher terkenal dengan kualitas dan standar desainnya yang tertinggi. Ketahanan dan pengoperasian yang mudah memungkinkan integrasi ultrasonicator kami ke dalam fasilitas industri. Kondisi kasar dan lingkungan yang menuntut mudah ditangani oleh ultrasonicator Hielscher.

Hielscher Ultrasonics adalah perusahaan bersertifikat ISO dan memberikan penekanan khusus pada ultrasonicators berkinerja tinggi yang menampilkan teknologi canggih dan keramahan pengguna. Tentu saja, ultrasonicators Hielscher sesuai dengan CE dan memenuhi persyaratan UL, CSA dan RoHs.