Deparafinisasi dan Ekstraksi Protein dari FFPE

Permudah ekstraksi protein dari irisan jaringan yang difiksasi dengan formalin dan ditanam dalam parafin (FFPE) menggunakan kombinasi deparafinisasi, solubilisasi, dan sonikasi yang dioptimalkan dengan ultrasonikator multitabung VialTweeter. Protokol ini mendukung proteomik berbasis spektrometri massa pada tahap lanjutan dan kompatibel dengan alur kerja pemurnian SP3 serta digesti enzimatik.

SOP ini ditujukan bagi personel laboratorium yang melakukan analisis proteomik spesimen jaringan FFPE menggunakan sonikasi berkinerja tinggi. Protokol ini dioptimalkan untuk hingga sepuluh sampel FFPE yang diproses secara paralel menggunakan Sonikator Multitabung VialTweeter.

Protokol: Ekstraksi Protein dari Sampel FFPE menggunakan VialTweeter

Bahan dan Reagen

Reagen

• Xilena (mutu histologi)
• Etanol (absolut 96%)
• Buffer lisis:

6 M Guanidin hidroklorida
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (Tris(2-karboksietil)fosfina)
40 mM CAA (2-Kloroasetamida)

• Inhibitor protease (opsional; misalnya, cOmplete™ mini bebas EDTA)

Peralatan

• Ultrasonikator Multitabung VialTweeter
• Tabung mikrosentrifugasi berdaya ikat rendah berukuran 1,5 mL atau 2,0 mL
• Blok pemanas atau inkubator (pengaturan 95°C dan 80°C)
• Mikrosentrifus
• Termomikser (opsional tetapi direkomendasikan)

Jumlah Sampel Awal

• 1–2 irisan jaringan FFPE setebal 10 µm per sampel (yaitu, per vial)

ATAU

• Total ~100 µg jaringan per sampel (yaitu, per vial)

Catatan: Gunakan pisau baru untuk mikrotomi guna meminimalkan kontaminasi serpihan parafin.

Prosedur

1. Deparafinisasi
   1. Pindahkan irisan FFPE ke dalam tabung mikrosentrifugasi berdaya ikat rendah.
   2. Tambahkan 1 mL xilena, campurkan sebentar dengan vorteks.
   3. Inkubasi selama 10 menit pada suhu ruang.
   4. Sentrifugasi pada 14.000 × g selama 2 menit; buang supernatan.
   5. Ulangi pencucian dengan xilena satu kali lagi (Langkah 2–4).
   6. Cuci pelet dengan 1 mL etanol 96%, campurkan dengan vorteks, lalu sentrifugasi pada 14.000 × g selama 2 menit. Buang supernatan.
   7. Ulangi pencucian dengan etanol satu kali lagi (total 2 kali pencucian dengan etanol).
   8. Keringkan pelet di udara selama 10 menit pada suhu ruang dengan tutup terbuka untuk menguapkan sisa etanol.
2. Ekstraksi Protein dan Sonikasi
   1. Tambahkan 200 µL buffer lisis ke setiap pelet kering.

      Catatan: Meskipun sonikator dapat menampung hingga 1 mL, 200 µL merupakan volume optimal untuk pemrosesan lanjutan.

   2. Campurkan dengan vorteks atau dengan pemipetan perlahan.
3. Inkubasi Termal Pertama
   1. Inkubasi tabung pada 95 °C selama 30 min, dengan pengocokan pada 400 rpm menggunakan termomikser atau blok pemanas.
   2. Biarkan sampel mendingin pada suhu ruang selama 5 min.
4. Sonikasi Pertama dengan VialTweeter
   1. Tempatkan tabung ke dalam VialTweeter.
   2. Atur VialTweeter UP200St ke nilai di bawah ini dan lakukan sonikasi.
Pengaturan Sonikator
• Atur Amplitudo (A) ke 100%
• Atur mode pulsasi (C) ke 100%
• Pengatur Waktu Periode: Aktif
• Waktu Aktif: 60s
• Waktu Nonaktif: 30s
• Nilai Batas: 15 min (setara dengan 10 siklus)
(Catatan Perhitungan: (60 s Aktif + 30 s Nonaktif) × 10 siklus = 900 s = 15 min)
5. Inkubasi Termal Kedua
   Keluarkan tabung dan inkubasi kembali pada 95 °C selama 15 min, 400 rpm.
6. Sonikasi Kedua
   Ulangi sonikasi pada VialTweeter menggunakan pengaturan yang sama (seperti di atas) selama 10 siklus tambahan (total 15 min).
7. Klarifikasi Lisat
   1. Sentrifugasi sampel pada 13.000 × g selama 10 min pada 23°C (suhu ruang).
   2. Pindahkan supernatan dengan hati-hati ke dalam tabung Eppendorf Safe-lock 2,0 mL yang baru. Hindari mengganggu pelet.
8. Pemrosesan Lanjutan
   Lisat kini siap untuk pemurnian SP3 dan digesti enzimatik.

Catatan dan Praktik Terbaik

1. Risiko panas berlebih selama sonikasi dikurangi melalui siklus AKTIF/NONAKTIF yang diprogram.
2. Hindari pencampuran dengan vorteks setelah sonikasi untuk mencegah agregasi protein.

Pembuangan Limbah dan Keselamatan

Tabel di bawah ini memberikan gambaran perkiraan kapasitas pemrosesan ultrasonikator skala laboratorium kami: