Deparafinisasi dan Ekstraksi Protein dari FFPE

Fasilitasi ekstraksi protein dari bagian jaringan tertanam parafin (FFPE) yang ditetapkan formalin menggunakan kombinasi deparaffinisasi, pelarutan, dan sonikasi yang dioptimalkan dengan ultrasonik multi-tabung VialTweeter. Protokol ini mendukung proteomik berbasis spektrometri massa hilir dan kompatibel dengan pembersihan SP3 dan alur kerja pencernaan enzimatik.

SOP ini ditujukan untuk tenaga laboratorium yang terlibat dalam analisis proteomik spesimen jaringan FFPE menggunakan sonication berkinerja tinggi. Ini dioptimalkan untuk hingga sepuluh sampel FFPE yang diproses secara paralel menggunakan VialTweeter Multi-Tube Sonicator.

Protokol: Ekstraksi Protein dari Sampel FFPE menggunakan VialTweeter

Bahan dan Reagen

Reagen

• Xilena (tingkat histologi)
• Etanol (absolut 96%)
• Penyangga lisis:

6 M Guanidine hidroklorida
50 mM Tris-HCl, pH 8.5
10 mM TCEP (Tris (2-karboksietil) fosfin)
40 mM CAA (2-kloroasetamida)

• Inhibitor protease (opsional; misalnya, cOmplete™ mini bebas EDTA)

Peralatan

• VialTweeter Multi-Tube Ultrasonik
• Tabung mikrosentrifugal pengikatan rendah 1,5 mL atau 2,0 mL
• Blok panas atau inkubator (pengaturan 95 °C dan 80 °C)
• Mikrosentrifugal
• Thermomixer (opsional tetapi direkomendasikan)

Masukan Sampel

• 1–2 bagian jaringan FFPE setebal 10 μm per sampel (yaitu, per botol)

atau

• Total ~100 μg jaringan per sampel (yaitu, per botol)

Catatan: Gunakan pisau baru untuk mikrotomi untuk meminimalkan kontaminasi kotoran parafin.

Prosedur

1. deparafinisasi
   1. Transfer bagian FFPE ke dalam tabung microcentrifuge pengikatan rendah.
   2. Tambahkan 1 mL xilena, pusaran sebentar.
   3. Inkubasi 10 menit pada suhu kamar.
   4. Centrifuge pada 14.000 × g selama 2 menit; buang supernatan.
   5. Ulangi pencucian xylene sekali lagi (Langkah 2–4).
   6. Cuci pelet dengan 1 mL etanol 96%, pusaran, lalu sentrifugal pada suhu 14.000 × g selama 2 menit. Buang supernatan.
   7. Ulangi pencucian etanol sekali lagi (total 2 pencucian etanol).
   8. Keringkan pelet selama 10 menit pada suhu kamar dengan tutup terbuka untuk menguapkan sisa etanol.
2. Ekstraksi Protein dan Sonikasi
   1. Tambahkan 200 μL buffer lisis ke setiap pelet kering.
      Catatan: Meskipun sonicator menampung hingga 1 mL, 200 μL optimal untuk pemrosesan hilir.

   2. Campur dengan pusaran atau pemipetan lembut.
3. Inkubasi Termal Pertama
   1. Inkubasi tabung pada suhu 95 °C selama 30 menit, dengan agitasi pada 400 rpm menggunakan thermomixer atau blok panas.
   2. Biarkan sampel dingin pada suhu kamar selama 5 menit.
4. Sonication Pertama dengan VialTweeter
   1. Tempatkan tabung ke dalam VialTweeter.
   2. Atur VialTweeter UP200St ke nilai di bawah ini dan sonicate.
Pengaturan Sonicator
• Atur Amplitudo (A) ke 100%
• Atur mode pulsasi (C) ke 100%
• Jam Periode: Aktif
• Tepat waktu: 60 detik
• Waktu Mati: 30 detik
• Nilai Batas: 15 menit (sesuai dengan 10 siklus)
(Catatan Perhitungan: (60 detik Aktif + 30 detik Mati) × 10 siklus = 900 detik = 15 menit)
5. Inkubasi Termal Kedua
   Lepaskan tabung dan inkubasi lagi pada suhu 95 °C selama 15 menit, 400 rpm.
6. Sonikasi Kedua
   Ulangi sonikasi pada VialTweeter menggunakan pengaturan yang sama (seperti di atas) untuk 10 siklus tambahan (total 15 menit).
7. Klarifikasi Lisat
   1. Sentrifugasi sampel pada suhu 13.000 × g selama 10 menit pada suhu 23°C (suhu kamar).
   2. Kumpulkan supernatan dengan hati-hati ke dalam tabung Eppendorf Safe-lock 2.0 mL baru. Hindari mengganggu pelet.
8. Pemrosesan Hilir
   Lisate sekarang siap untuk pembersihan SP3 dan pencernaan enzimatik.

Catatan dan Praktik Terbaik

1. Risiko panas berlebih selama sonikasi dikurangi dengan siklus ON/OFF yang diprogram.
2. Hindari pusaran pasca-sonikasi untuk mencegah agregasi protein.

Pembuangan dan Keamanan Limbah

Tabel di bawah ini memberi Anda indikasi perkiraan kapasitas pemrosesan ultrasonicator ukuran lab kami: