Ուռուցքային հյուսվածքից ուլոնիկացմամբ օժանդակվող սպիտակուցի արդյունահանում – արձանագրություն
Այս արձանագրությունը նկարագրում է ուռուցքային հյուսվածքի համար ուլտրաձայնային օժանդակությամբ սպիտակուցի արդյունահանման մեթոդ, որը առաջ է մղում CPTAC միզանյութի լիզիսի ստանդարտ աշխատանքային հոսքը՝ հյուսվածքի քայքայման ընթացքում ավելացնելով վերահսկվող զոնդ-ուլտրաձայնային քայլ: Հիմնվելով CPTAC պրոտեոմի և ֆոսֆոպրոտեոմի խորը մասշտաբի պատրաստման հաստատված ռազմավարության վրա՝ այս փոփոխությունը բարելավում է բջջային և ենթաբջջային կառուցվածքի քայքայումը, նվազեցնում է նմուշի մածուցիկությունը և ուժեղացնում է սպիտակուցների արտազատումը, որոնք սովորաբար ավելի դժվար է վերականգնել միայն միզանյութի լիզիզով, հատկապես թաղանթին կապված և ԴՆԹ-ին կապող կամ միջուկին կապված սպիտակուցների: Հիմնական ուսումնասիրության մեջ ուլտրաձայնային օժանդակությամբ աշխատանքային հոսքը մեծացրել է ինչպես սպիտակուցների, այնպես էլ ֆոսֆոպեպտիդների հայտնաբերումը՝ միաժամանակ պահպանելով համատեղելիությունը CPTAC ոճով մարսման, TMT պիտակավորման, ֆրակցիաների, ֆոսֆոպեպտիդների հարստացման և LC-MS/MS վերլուծության խողովակաշարի հետ:
Ուլտրաձայնային եղանակով սպիտակուցի արդյունահանում ուռուցքային հյուսվածքից՝ խորը պրոտեոմիկ և ֆոսֆոպրոտեոմիկ վերլուծության համար
The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.
ուլտրաձայնային զոնդ UP200St սպիտակուցի արդյունահանման համար պրոտեոմիկայի մեջ
Արձանագրության կիրառման ոլորտը
Օգտագործեք այս ընթացակարգը հետևյալի համար՝
- թարմ սառեցված, կրիոփոշիացված ուռուցքային հյուսվածք
- բջջային գնդիկներ կամ այլ կենսաբանական նմուշներ, որտեղ միզանյութի վրա հիմնված արդյունահանումն արդեն հաստատված է
- գլոբալ պրոտեոմիկայի և ֆոսֆոպրոտեոմիկայի աշխատանքային հոսքեր՝ օգտագործելով տրիպտիկ մարսողություն և լրացուցիչ TMT պիտակավորում
Լիի և այլոց (2025) ուսումնասիրությունը նշում է, որ աշխատանքային հոսքը կիրառելի է նաև այլ տեսակի նմուշների համար, ինչպիսիք են բջջային գծերը, արյունը և մեզը, սակայն նմուշի տեսակի համաձայն կարող է պահանջվել օպտիմալացում։
Օպտիմալացված նմուշի պատրաստման աշխատանքային հոսք՝ ներդրված ուլտրաձայնային քայլով: Օպտիմալացված աշխատանքային հոսքը և փորձարարական դիզայնը հիմնված են CPTAC նմուշի պատրաստման արձանագրության վրա՝ գլոբալ պրոտեոմիկ և ֆոսֆոպրոտեոմիկ վերլուծության համար:
Ուսումնասիրություն և սխեմա՝ ©Լի և այլք, 2025
Աշխատանքային սկզբունք
Սկզբնական ուսումնասիրությունը CPTAC միզանյութի լիզիսի ստանդարտ աշխատանքային հոսքին ավելացրել է ուլտրաձայնային մեթոդ և հայտնաբերել է թաղանթների և կորիզների հետ կապված սպիտակուցների հայտնաբերման բարելավում: Հեղինակները նշում են, որ ուլտրաձայնային մեթոդի պարամետրերը պետք է ճշգրտվեն նմուշի չափի/կոնցենտրացիայի առումով: – ընտրելով սոնոտրոդի չափը, էներգիայի մուտքը և զարկերակային ժամանակացույցը։
Օրինակ, Hielscher UP200Ht-ի և UP200St-ի համար սա նշանակում է.
- օգտագործել ամպլիտուդը և իմպուլսային ռեժիմը որպես հիմնական կառավարման փոփոխականներ
- նմուշները պահեք սառը վիճակում (օրինակ՝ սառույցի վրա)
- սկսեք պահպանողական կարգավորումներով
- օպտիմալացնել նմուշի պարզության, ջերմաստիճանի, սպիտակուցի բերքատվության և պեպտիդի որակի համեմատ
Hielscher 200 վատտ հզորությամբ ուլտրաձայնային UP200Ht և UP200St մոդելները նախատեսված են փոքր և միջին նմուշների ծավալների համար՝ կարգավորելի ամպլիտուդով և իմպուլսային կարգավորումներով։ Երկու ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորներն էլ ապահովում են թվային սենսորային էկրանի կառավարում՝ ճշգրիտ պարամետրերի կարգավորման, ավտոմատացված տվյալների գրանցման, միացվող ջերմաստիճանի սենսորների, հեռակառավարման, նմուշի լուսավորության համար։
Ռեակտիվներ ուլտրաձայնային սպիտակուցի արդյունահանման համար
Միզանյութի լիզիսի բուֆեր
Պատրաստեք թարմը օգտագործելուց անմիջապես առաջ.
- 8 Մ միզանյութ
- 75 մՄ NaCl
- 50 մՄ Տրիս, pH 8.0
- 1 մՄ EDTA
- 2 մկգ/մլ ապրոտինին
- 10 մկգ/մլ լեյպեպտին
- 1 մՄ ՊՄՍՖ
- 10 մՄ NaF
- 20 մկՄ PUGNAc
- Ֆոսֆատազի ինհիբիտորային կոկտեյլ 2, 1:100 (v/v)
- Ֆոսֆատազի ինհիբիտորային կոկտեյլ 3, 1:100 (v/v)
Միզանյութը պետք է լիովին լուծարվի հավելանյութեր ավելացնելուց առաջ, ինհիբիտորները պետք է ավելացնել օգտագործելուց անմիջապես առաջ, բուֆերը պետք է պահել սառույցի վրա, և հավելանյութեր ավելացնելուց հետո խորհուրդ է տրվում պտտեցնել, այլ ոչ թե ուժեղ խառնել։
Լրացուցիչ ռեակտիվներ՝
- BCA սպիտակուցային վերլուծության ռեակտիվներ
- 50 մՄ տրիս-HCl, pH 8.0
- DTT
- Յոդոացետամիդ
- ԼիսԿ
- տրիպսին
- մրջնաթթու
- TMT ռեակտիվներ, եթե օգտագործվում են բազմակի քանակական պրոտեոմիկա
- IMAC ռեակտիվներ, եթե իրականացվում է ֆոսֆոպեպտիդային հարստացում
Ուլտրաձայնային սարք UP200Ht microtip S26d2 նմուշի պատրաստման համար
Սարքավորումներ ուլտրաձայնային սպիտակուցի արդյունահանման համար
Պարտադիր
Առաջարկվող զոնդի ընտրություն
Մոտ 200-1000 մկլ նմուշների համար օգտագործեք փոքր տրամագծով սոնոտրոդ, որը հարմար է փոքր ծավալների ուղղակի բարձր ինտենսիվությամբ մշակման համար: Hielscher-ը առաջարկում է սոնոտրոդների բազմաթիվ տրամագծեր, և փոքր ծայրերի տրամագծերը ապահովում են ավելի բարձր ինտենսիվություն ծայրում:
Գործնական նշում. Օգտագործեք ամենափոքր զոնդը, որը ապահովում է արդյունավետ խառնում՝ առանց չափազանց փրփուրի կամ անոթի պատին շփման:
Եթե միաժամանակ աշխատում եք մի քանի նմուշների հետ, կարող եք հաշվի առնել բազմա-խողովակային սոնիկատոր VialTweeter կամ միկրոպլատային սոնիկատոր UIP400MTP!
Քայլ առ քայլ հրահանգներ. Sonication-Assisted սպիտակուցի արդյունահանման ընթացակարգը
Ա. Նախապես սառեցնել և պատրաստել
- Սառեցրեք ցենտրիֆուգը մինչև 4°C:
- Պատրաստեք թարմ միզանյութի լիզիսի բուֆեր և պահեք այն սառույցի վրա։
- Տեղադրեք UP200Ht-ն կամ UP200St-ը ձայնային պատյանի ներսում գտնվող հենարանի վրա:
- Պատրաստեք սառցե լոգարան, որը բավականաչափ մեծ է նմուշային խողովակները ուղղահայաց և կայուն պահելու համար։
Թարմ բուֆերի պատրաստումը և սառը մշակումը կարևոր են։
Բ. Սկզբնական միզանյութի արդյունահանում
- Պահեք կրիոպոլվերիզացված հյուսվածքը սառույցի վրա։
- Ավելացրեք 200 մկլ սառեցված միզանյութի լիզիսի բուֆեր յուրաքանչյուր 50 մգ թաց հյուսվածքի համար։
- Մրորոց 5–10 վրկ բարձր արագությամբ։
- Ինկուբացեք 15 րոպե 4°C ջերմաստիճանում։
- Կրկնեք vortex-plus-ինկուբացիայի քայլը ևս մեկ անգամ։
- Ցենտրիֆուգացրեք 20,000 գ զանգվածով 10 րոպե 4°C ջերմաստիճանում։
- Լիզատը/վերին շերտը տեղափոխեք մաքուր ցածր կապման ունակություն ունեցող խողովակի մեջ։
Գ. Sonication օգտագործելով UP200Ht կամ UP200St
Sonication-ի մեկնարկային պայմանները
- Ամպլիտուդ՝ սկսեք 20-30%-ից
- Իմպուլսի երկարություն՝ 5 վրկ ՄԻԱՑՎԱԾ
- Սառեցում՝ 2 րոպե սառույցի վրա իմպուլսների միջև
- Ցիկլերի քանակը՝ 4 ցիկլ
- Ընդհանուր ակտիվ sonication ժամանակը: 20 վրկ
- Ընդհանուր գործընթացի տևողությունը՝ ներառյալ սառեցումը, մոտ 8-10 րոպե
Ուլտրաձայնային թերապիայի քայլեր
- Լիզատը տեղափոխեք ուլտրաձայնային մշակման համար հարմար խողովակի մեջ։ Օգտագործեք նեղ, բարակ պատերով խողովակ, որը թույլ է տալիս լավ ջերմափոխանակում և զոնդի անվտանգ ընկղմում։
- Տեղադրեք խողովակը սառցե լոգանքի մեջ: Թուղթը նշում է, որ ուլտրաձայնային մշակման ընթացքում սառեցումը կարևոր է ջերմային վնասը կանխելու համար:
- Զոնդի ծայրը ընկղմեք նմուշի մեջ։ Պահեք ծայրը բավականաչափ ընկղմված՝ կայուն կավիտացիայի համար, բայց թույլ մի տվեք, որ այն դիպչի խողովակի պատին կամ հատակին։
- Սկսած ամպլիտուդով գործարկեք մեկ 5 վայրկյան տևողությամբ իմպուլս։
- Անմիջապես նմուշն ամբողջությամբ վերադարձրեք սառույցի մեջ 2 րոպեով։
- Կրկնել մինչև 4 ցիկլի ավարտը։
- Ստուգեք լիզատը ցիկլից հետո։
- Շարունակեք միայն անհրաժեշտության դեպքում՝ միաժամանակ կիրառելով մեկ լրացուցիչ 5 վայրկյան տևողությամբ իմպուլս, որին միշտ կհաջորդի լրիվ սառեցում։
- Դադարեցրեք, երբ լիզատը դառնա ավելի միատարր և պակաս թելանման/մածուցիկ։
Վերջնակետը ավելի թափանցիկ լիզատ է, որը առաջացնում է կաթիլներ, այլ ոչ թե անընդհատ մածուցիկ հոսք։ - Ցենտրիֆուգացրեք մոտ 16,000 գ զանգվածով 15 րոպե 4°C ջերմաստիճանում։
- Մաքրված վերին շերտը տեղափոխեք թարմ խողովակի մեջ և չափեք սպիտակուցի կոնցենտրացիան։
Համեմատություն գլոբալ պրոտեոմիկայի և ֆոսֆոպրոտեոմիկայի միջև ուլտրաձայնային և ոչ ուլտրաձայնային նմուշների միջև։
ա. Բոլոր PDX ուռուցքային հյուսվածքներում նույնականացված սպիտակուցների քանակը (գլոբալ պրոտեոմիկա)՝ ուլտրաձայնային մշակմամբ կամ առանց դրա։ բ. Բոլոր PDX ուռուցքային հյուսվածքներում նույնականացված ֆոսֆոպեպտիդների քանակը (IMAC հարստացում)՝ ուլտրաձայնային մշակմամբ կամ առանց դրա։ Հաշվարկվել են միայն այն սպիտակուցներն ու ֆոսֆոպեպտիդները, որոնց առատության հարաբերակցությունը մեծ է կամ հավասար է 25-րդ պերսենտիլին։ Առատության հարաբերակցությունը հաշվարկվել է նույն տեսակի նմուշների միջև։
Ուսումնասիրություն և գրաֆիկներ՝ ©Լի և այլք, 2025
Ստորին հոսանքի մարսողություն և վերլուծություն
Ուլտրաձայնային մշակումից և պարզեցումից հետո շարունակեք, ինչպես նկարագրված է CPTAC ոճի աշխատանքային հոսքում.
- Լիզատը նոսրացրեք 1:3 (v/v) 50 մՄ Tris-HCl-ով pH 8.0՝ միզանյութը վերականգնելու համար մինչև <2 M.
- Ավելացրեք LysC 1 մԱՄ կոնցենտրացիայով 50 մկգ սպիտակուցի համար և ինկուբացրեք 2 ժամ 25°C ջերմաստիճանում։
- Ավելացնել տրիպսին 1:49 ֆերմենտ:սուբստրատ (ք/ք) հարաբերակցությամբ և մարսել գիշերը 25°C ջերմաստիճանում։
- Հանգստացրեք մրջնաթթվով մինչև 1% վերջնական խտություն։
- Շարունակեք աղազրկումը, TMT պիտակավորումը, ֆրակցիոնացումը, ֆոսֆոպեպտիդային հարստացումը և LC-MS/MS-ը՝ ըստ անհրաժեշտության։
TMT-նշագրված MS-ից ֆոսֆոպեպտիդների դիֆերենցիալ էքսպրեսիա։
ա. Բազային ենթատիպը, որը ընդգծում է որոշ մարդկային ֆոսֆոպեպտիդներ (սպիտակուցային հաջորդականության սկիզբ և ավարտ), որոնք բարձրացված են ուլտրաձայնային նմուշներում՝ համեմատած ոչ ուլտրաձայնային նմուշների հետ։ բ. Լուսային ենթատիպը, որը ընդգծում է որոշ մարդկային ֆոսֆոպեպտիդներ (սպիտակուցային հաջորդականության սկիզբ և ավարտ), որոնք բարձրացված են ուլտրաձայնային նմուշներում՝ համեմատած ոչ ուլտրաձայնային նմուշների հետ։ գ. Ուռուցքների ուլտրաձայնային բազալ ենթատիպում բարձրացված ֆոսֆոպեպտիդների սպիտակուցների վրա հիմնված հարստացված KEGG ուղիներ։ դ. Ուռուցքների ուլտրաձայնային լուսային ենթատիպում բարձրացված ֆոսֆոպեպտիդների սպիտակուցների վրա հիմնված հարստացված KEGG ուղիներ։
Ուսումնասիրություն և գրաֆիկներ՝ ©Լի և այլք, 2025
Դիզայն, արտադրություն և խորհրդատվություն – Որակյալ Արտադրված է Գերմանիայում
Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը հայտնի են իրենց բարձր որակի և դիզայնի չափանիշներով: Հզորությունը և հեշտ շահագործումը թույլ են տալիս մեր ուլտրաձայնային սարքերի սահուն ինտեգրումը արդյունաբերական օբյեկտներում: Կոպիտ պայմանները և պահանջկոտ միջավայրերը հեշտությամբ կառավարվում են Hielscher ուլտրաձայնային սարքերի կողմից:
Hielscher Ultrasonics-ը ISO սերտիֆիկացված ընկերություն է և հատուկ շեշտադրում է կատարում բարձր արդյունավետության ուլտրաձայնային սարքերի վրա, որոնք բնութագրվում են ժամանակակից տեխնոլոգիաներով և օգտագործողների համար հարմարավետությամբ: Իհարկե, Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը համապատասխանում են ԵԽ-ին և համապատասխանում են UL, CSA և RoH-ների պահանջներին:
Բազմաբխային ափսեի ձայնային սարք UIP400MTP նմուշներից բարձր արտադրողականության սպիտակուցի արդյունահանման համար
Գրականություն / Հղումներ
- Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
- Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
- Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
- Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
- Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.
Հաճախակի տրվող հարցեր
Ո՞րն է տարբերությունը բուսական հյուսվածքից սպիտակուցի արդյունահանման և կաթնասունների հյուսվածքից սպիտակուցի արդյունահանման միջև:
Սպիտակուցի արդյունահանումը բուսական հյուսվածքից սովորաբար ավելի դժվար է, քան կաթնասունների հյուսվածքից, քանի որ բուսական բջիջներն ունեն կոշտ ցելյուլոզով հարուստ բջջային պատ, առատ պոլիսախարիդներ, ֆենոլային միացություններ, գունանյութեր և ակտիվ էնդոգեն ֆերմենտներ, որոնք կարող են խանգարել սպիտակուցի լուծելիությանը, աղտոտել քաղվածքները կամ նպաստել սպիտակուցի քայքայմանը: Ի տարբերություն դրա, կաթնասունների հյուսվածքը բջջային պատ չունի և ընդհանուր առմամբ ավելի հեշտ է քիմիապես քայքայել, չնայած այն հաճախ պարունակում է ավելի շատ լիպիդներ, արտաբջջային մատրից և պրոտեազներ, որոնք դեռ կարող են բարդացնել արդյունահանումը: Արդյունքում, բույսերի արձանագրությունները սովորաբար պահանջում են ավելի ուժեղ մեխանիկական քայքայում, ցածր ջերմաստիճանի մանրացում և հավելումներ, ինչպիսիք են PVPP-ն, վերականգնիչները կամ ֆենոլի վրա հիմնված մաքրումը, մինչդեռ կաթնասունների հյուսվածքն ավելի հաճախ հաջողությամբ մշակվում է լվացող միջոցների վրա հիմնված բուֆերներով, ինչպիսիք են RIPA-ն կամ միզանյութի վրա հիմնված լիզիսի համակարգերը: Ե՛վ բուսական, և՛ կաթնասունների հյուսվածքը կարող է արդյունավետորեն լիզի ենթարկվել ուլտրաձայնային թերապիայի միջոցով:
Ինչպե՞ս բարելավել սպիտակուցի արդյունահանումը հյուսվածքից՝ օգտագործելով RIPA բուֆերը։
RIPA բուֆերով հյուսվածքից սպիտակուցի արդյունահանումը կարող է բարելավվել՝ օպտիմալացնելով նմուշի ինչպես քայքայումը, այնպես էլ պաշտպանությունը: Ամենակարևոր միջոցառումներն են՝ հյուսվածքը և բուֆերը սառը պահելը, թարմ պատրաստված պրոտեազի և ֆոսֆատազի ինհիբիտորների օգտագործումը, հյուսվածքը մանրակրկիտ մանրացնելը կամ փոշիացնելը լիզիսից առաջ, բուֆերի և հյուսվածքի համապատասխան հարաբերակցության պահպանումը և մեխանիկական քայքայման քայլի ավելացումը, ինչպիսիք են հոմոգենացումը կամ կարճատև զոնդային ուլտրաձայնային մշակումը՝ խիտ հյուսվածքը քայքայելու և մածուցիկությունը նվազեցնելու համար: Էքստրակցիայի արդյունավետությունը նաև բարելավվում է, երբ լիզատները ինկուբացվում են սառույցի վրա՝ ընդհատվող խառնմամբ, որին հաջորդում է բարձր արագությամբ սառնարանային ցենտրիֆուգացում՝ անլուծելի մնացորդները հեռացնելու համար: Թելքավոր, լիպիդներով հարուստ կամ բարձր կառուցվածք ունեցող հյուսվածքների համար արդյունահանման մեկ անգամ կրկնելը կամ լվացող միջոցի ազդեցության ժամանակը մեծացնելը կարող է բարելավել վերականգնումը, բայց պետք է խուսափել չափազանց ուլտրաձայնային մշակումից կամ սենյակային ջերմաստիճանում երկարատև մշակումից, քանի որ դրանք կարող են դենատուրացնել սպիտակուցները կամ մեծացնել պրոտեոլիզը:
Ուլտրաձայնային սպիտակուցի արդյունահանման ժամանակ ի՞նչ անվտանգության պահանջներ պետք է պահպանվեն։
Զոնդի ուլտրաձայնային մշակումը կատարեք ձայնապաշտպան տուփի մեջ կամ լսողության համապատասխան պաշտպանիչ միջոցներով: Աղբյուրի արձանագրությունը հատուկ զգուշացնում է ուլտրաձայնային մշակման ընթացքում առաջացող վնասակար լսելի աղմուկի մասին:
Կրեք աչքերի պաշտպանիչ միջոցներ, լաբորատոր խալաթ և ձեռնոցներ։
Պահեք զոնդը մաշկից հեռու և երբեք մի՛ ուլտրաձայնային եղանակով մշակեք բաց անոթը՝ առանց ցողումից պաշտպանվելու։
PMSF-ի և այլ ինհիբիտորների հետ վարվեք տեղական քիմիական անվտանգության կանոններին համապատասխան։
Պահեք նմուշները սառույցի վրա՝ ջերմությունից առաջացած սպիտակուցի վնասը նվազեցնելու համար։ Հոդվածում բազմիցս ջերմաստիճանի վերահսկումը նշվում է որպես կարևորագույն գործոն։
VialTweeter սոնիկատորը արագացնում և բարելավում է սպիտակուցի արդյունահանումը պրոտեոմիկայում
Hielscher Ultrasonics-ը արտադրում է բարձր արդյունավետության ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորներ լաբորատորիա դեպի արդյունաբերական չափս.