Ուլտրաձայնային մշակմամբ օժանդակված սպիտակուցների էքստրակցիա ուռուցքային հյուսվածքից – արձանագրություն

Այս արձանագրությունը նկարագրում է ուռուցքային հյուսվածքից սպիտակուցների էքստրակցիայի՝ ուլտրաձայնային մշակմամբ օժանդակված մեթոդ, որը կատարելագործում է միզանյութով լիզիսի ստանդարտ CPTAC աշխատանքային ընթացքը՝ հյուսվածքի քայքայման ընթացքում ավելացնելով զոնդային ուլտրաձայնային մշակման վերահսկվող փուլ։ Հիմնվելով պրոտեոմի և ֆոսֆոպրոտեոմի՝ խոր ընդգրկմամբ հետազոտման համար նախապատրաստման հաստատված CPTAC ռազմավարության վրա՝ այս փոփոխությունը բարելավում է բջիջների և ենթաբջջային կառուցվածքների քայքայումը, նվազեցնում է նմուշի մածուցիկությունը և ուժեղացնում այն սպիտակուցների ազատումը, որոնք սովորաբար ավելի դժվար է ստանալ միայն միզանյութով լիզիսի միջոցով, հատկապես՝ թաղանթներին կապված և ԴՆԹ կապող կամ կորիզի հետ ասոցացված սպիտակուցները։ Հիմքում ընկած հետազոտությունում ուլտրաձայնային մշակմամբ օժանդակված աշխատանքային ընթացքը մեծացրել է ինչպես սպիտակուցների, այնպես էլ ֆոսֆոպեպտիդների հայտնաբերումը՝ միաժամանակ պահպանելով համատեղելիությունը CPTAC մոտեցմամբ իրականացվող հետագա մարսման, TMT մակնշման, ֆրակցիոնացման, ֆոսֆոպեպտիդների հարստացման և LC-MS/MS վերլուծության շղթայի հետ։

Ուլտրաձայնային մշակմամբ օժանդակված սպիտակուցների էքստրակցիա ուռուցքային հյուսվածքից՝ խոր ընդգրկմամբ պրոտեոմային և ֆոսֆոպրոտեոմային վերլուծության համար

Հետևյալ արձանագրությունն օպտիմալացված է կրիոգեն պայմաններում փոշիացված ուռուցքային հյուսվածքից սպիտակուցների էքստրակցիայի համար՝ 8 M միզանյութ պարունակող լիզիսի բուֆերում։ Զոնդային ուլտրաձայնային մշակման ավելացված փուլը բարելավում է դժվար էքստրակցվող դասերի սպիտակուցների, հատկապես՝ թաղանթների և ԴՆԹ-ի կամ կորիզի հետ ասոցացված սպիտակուցների ստացումը՝ նախքան մարսումը և հետագա LC-MS/MS վերլուծությունը։ Հիմքում ընկած՝ Li et al. (2025) հետազոտությունում ուլտրաձայնային մշակման ավելացումը մեծացրել է թաղանթների և կորիզի հետ ասոցացված սպիտակուցների հայտնաբերումը և նրանց աշխատանքային ընթացքի շրջանակում ապահովել է >12 000 սպիտակուցների և >25 000 ֆոսֆոպեպտիդների խոր ընդգրկմամբ հետազոտում։

Արձանագրության կիրառման ոլորտը

Կիրառեք այս ընթացակարգը հետևյալի համար՝

• թարմ սառեցված, կրիոգեն պայմաններում փոշիացված ուռուցքային հյուսվածք
• բջջային նստվածքներ կամ այլ կենսաբանական նմուշներ, որոնց համար միզանյութի հիմքով էքստրակցիան արդեն հաստատված է
• գլոբալ պրոտեոմիկայի և ֆոսֆոպրոտեոմիկայի աշխատանքային ընթացքեր՝ տրիպսինային մարսմամբ և ընտրովի TMT մակնշմամբ

Li et al. (2025) հետազոտությունում նշվում է, որ աշխատանքային ընթացքը կիրառելի է նաև այլ տեսակի նմուշների, օրինակ՝ բջջային գծերի, արյան և մեզի համար, սակայն, կախված նմուշի տեսակից, կարող է պահանջվել օպտիմալացում։

Նմուշների նախապատրաստման օպտիմալացված աշխատանքային ընթացք՝ ներառված ուլտրաձայնային մշակման փուլով։ Օպտիմալացված աշխատանքային ընթացքը և փորձարարական պլանը հիմնված են գլոբալ պրոտեոմային և ֆոսֆոպրոտեոմային վերլուծության համար նմուշների նախապատրաստման CPTAC արձանագրության վրա։
Հետազոտություն և սխեմա՝ ©Li et al., 2025

Աշխատանքի սկզբունքը

Սկզբնական հետազոտությունում միզանյութով լիզիսի ստանդարտ CPTAC աշխատանքային ընթացքին ավելացվել է ուլտրաձայնային մշակում, և արձանագրվել է թաղանթների ու կորիզների հետ ասոցացված սպիտակուցների հայտնաբերման բարելավում։ Հեղինակները նշում են, որ ուլտրաձայնային մշակման պարամետրերը պետք է ճշգրիտ կարգավորվեն՝ ըստ նմուշի չափի/կոնցենտրացիայի՝ ընտրելով սոնոտրոդի չափը, ներմուծվող էներգիան և իմպուլսների ժամանակային պարամետրերը։

Օրինակ՝ Hielscher UP200Ht և UP200St մոդելների դեպքում սա նշանակում է՝

• որպես կառավարման հիմնական փոփոխականներ օգտագործել ամպլիտուդը և իմպուլսային ռեժիմը
• ամբողջ ընթացքում նմուշները պահել սառը վիճակում (այսինքն՝ սառույցի վրա)
• սկսել մեղմ կարգավորումներից
• օպտիմալացնել՝ ըստ նմուշի պարզության, ջերմաստիճանի, սպիտակուցների ելքի և հետագա փուլերում ստացվող պեպտիդների որակի

 
Hielscher ընկերության՝ 200 վատտ հզորությամբ ուլտրաձայնային մշակման երկու մոդելներն էլ՝ UP200Ht և UP200St, նախատեսված են փոքր և միջին ծավալների նմուշների համար և ունեն ամպլիտուդի ու իմպուլսների կարգավորման հնարավորություն։ Երկու ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորներն էլ ապահովում են թվային սենսորային էկրանով կառավարում՝ պարամետրերի ճշգրիտ կարգավորման համար, տվյալների ավտոմատ գրանցում, միացվող ջերմաստիճանի տվիչ, հեռակառավարում և նմուշի լուսավորում։
 

Ռեագենտներ՝ ուլտրաձայնային մշակմամբ օժանդակված սպիտակուցների էքստրակցիայի համար

Միզանյութ պարունակող լիզիսի բուֆեր

Պատրաստեք թարմ՝ օգտագործումից անմիջապես առաջ՝

• 8 M միզանյութ
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL ապրոտինին
• 10 µg/mL լեյուպեպտին
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Ֆոսֆատազների ինհիբիտորների կոկտեյլ 2, 1:100 (v/v)
• Ֆոսֆատազների ինհիբիտորների կոկտեյլ 3, 1:100 (v/v)

Միզանյութը պետք է ամբողջությամբ լուծված լինի նախքան հավելանյութերի ավելացումը։ Ինհիբիտորները պետք է ավելացվեն օգտագործումից անմիջապես առաջ, բուֆերը պետք է պահվի սառույցի վրա, իսկ հավելանյութերի ավելացումից հետո խորհուրդ է տրվում խառնել մեղմ շրջանաձև շարժումներով՝ ուժգին վորտեքսային խառնման փոխարեն։
 

Լրացուցիչ ռեագենտներ՝

• BCA մեթոդով սպիտակուցի քանակական որոշման ռեագենտներ
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Յոդացետամիդ
• LysC
• Տրիպսին
• Մրջնաթթու
• TMT ռեագենտներ, եթե կիրառվում է մուլտիպլեքսային քանակական պրոտեոմիկա
• IMAC ռեագենտներ, եթե կատարվում է ֆոսֆոպեպտիդների հարստացում

Ուլտրաձայնի օժանդակությամբ սպիտակուցների էքստրակցիայի սարքավորումներ

Պահանջվում են

Զոնդի առաջարկվող ընտրությունը

Մոտ 200–1000 µL ծավալով նմուշների համար օգտագործեք փոքր տրամագծով սոնոտրոդ, որը հարմար է փոքր ծավալների ուղղակի բարձր ինտենսիվությամբ մշակման համար։ Hielscher ընկերությունն առաջարկում է տարբեր տրամագծերի սոնոտրոդներ, իսկ ծայրակալի ավելի փոքր տրամագծերն ապահովում են ավելի բարձր ինտենսիվություն ծայրակալի մոտ։

Գործնական նշում. օգտագործեք ամենափոքր զոնդը, որն ապահովում է արդյունավետ խառնում՝ առանց չափազանց փրփրագոյացման կամ անոթի պատին հպվելու։

Եթե միաժամանակ աշխատում եք մի քանի նմուշների հետ, գուցե ցանկանաք դիտարկել հետևյալ տարբերակները՝ բազմափորձանոթային VialTweeter ուլտրաձայնային սարքը կամ միկրոպլանշետների համար նախատեսված UIP400MTP ուլտրաձայնային սարքը։

Քայլ առ քայլ հրահանգներ. ուլտրաձայնի օժանդակությամբ սպիտակուցների էքստրակցիայի ընթացակարգ

A. Նախապես սառեցրեք և նախապատրաստեք

1. Ցենտրիֆուգը սառեցրեք մինչև 4°C։
2. Պատրաստեք միզանյութային լիզիսի թարմ բուֆեր և պահեք այն սառույցի վրա։
3. UP200Ht կամ UP200St սարքը տեղադրեք հենարանի վրա՝ ձայնամեկուսիչ պատյանի ներսում։
4. Պատրաստեք բավականաչափ մեծ սառցային բաղնիք՝ նմուշներով փորձանոթները ուղղահայաց և կայուն պահելու համար։

Բուֆերի թարմ պատրաստումը և սառը պայմաններում աշխատանքը վճռորոշ նշանակություն ունեն։

B. Սկզբնական միզանյութային էքստրակցիա

1. Կրիոգեն պայմաններում փոշիացված հյուսվածքը պահեք սառույցի վրա։
2. Յուրաքանչյուր 50 mg խոնավ հյուսվածքի հաշվով ավելացրեք 200 µL սառեցված միզանյութային լիզիսի բուֆեր։
3. Վորտեքս խառնիչով խառնեք բարձր արագությամբ՝ 5–10 s։
4. Ինկուբացրեք 15 min՝ 4°C ջերմաստիճանում։
5. Վորտեքսով խառնման և ինկուբացման համակցված քայլը կրկնեք ևս մեկ անգամ։
6. Ցենտրիֆուգեք 20 000g պայմաններում՝ 10 min, 4°C ջերմաստիճանում։
7. Լիզատը/վերնստվածքային հեղուկը տեղափոխեք ցածր կապակցման հատկությամբ մաքուր փորձանոթի մեջ։

C. Ուլտրաձայնային մշակում՝ UP200Ht կամ UP200St սարքի օգտագործմամբ

Ուլտրաձայնային մշակման մեկնարկային պայմաններ

• Ամպլիտուդ. սկսեք 20–30%-ից
• Իմպուլսի տևողություն. 5 s՝ միացված վիճակում
• Սառեցում. իմպուլսների միջև՝ 2 min սառույցի վրա
• Ցիկլերի քանակ. 4 ցիկլ
• Ակտիվ ուլտրաձայնային մշակման ընդհանուր տևողություն. 20 s
• Գործընթացի ընդհանուր տևողություն՝ ներառյալ սառեցումը. մոտ 8–10 min

Ուլտրաձայնային մշակման քայլեր

1. Լիզատը տեղափոխեք ուլտրաձայնային մշակման համար հարմար փորձանոթի մեջ։ Օգտագործեք նեղ, բարակապատ փորձանոթ, որն ապահովում է լավ ջերմափոխանակություն և զոնդի անվտանգ ընկղմում։
2. Փորձանոթը տեղադրեք սառցային բաղնիքի մեջ։ Հոդվածում ուլտրաձայնային մշակման ընթացքում սառեցումը նշվում է որպես ջերմային վնասումը կանխելու համար վճռորոշ պայման։
3. Զոնդի ծայրակալն ընկղմեք նմուշի մեջ։ Ծայրակալը պահեք բավականաչափ ընկղմված՝ կայուն կավիտացիա ապահովելու համար, սակայն թույլ մի տվեք, որ այն հպվի փորձանոթի պատին կամ հատակին։
4. Մեկնարկային ամպլիտուդով կիրառեք մեկ 5 s տևողությամբ իմպուլս։
5. Նմուշն անմիջապես ամբողջությամբ վերադարձրեք սառույցի վրա՝ 2 min տևողությամբ։
6. Կրկնեք, մինչև ավարտվեն 4 ցիկլերը։
7. Ցիկլից հետո ստուգեք լիզատը։
8. Շարունակեք միայն անհրաժեշտության դեպքում՝ ամեն անգամ կիրառելով մեկ լրացուցիչ 5 s տևողությամբ իմպուլս, որին միշտ պետք է հաջորդի լիարժեք սառեցումը։
9. Դադարեցրեք, երբ լիզատը դառնա ավելի համասեռ և պակաս թելաձգվող/մածուցիկ։
   Վերջնակետն ավելի կիսաթափանցիկ լիզատն է, որը կաթիլներ է առաջացնում՝ շարունակական մածուցիկ հոսքի փոխարեն։
10. Ցենտրիֆուգեք մոտ 16 000g պայմաններում՝ 15 min, 4°C ջերմաստիճանում։
11. Պարզեցված վերնստվածքային հեղուկը տեղափոխեք նոր փորձանոթի մեջ և չափեք սպիտակուցի կոնցենտրացիան։

Ուլտրաձայնով մշակված և չմշակված նմուշների համընդհանուր պրոտեոմիկայի և ֆոսֆոպրոտեոմիկայի համեմատություն։
a. Նույնականացված սպիտակուցների քանակը (համընդհանուր պրոտեոմիկա) բոլոր PDX ուռուցքային հյուսվածքներում՝ ուլտրաձայնային մշակմամբ կամ առանց դրա։ b. Նույնականացված ֆոսֆոպեպտիդների քանակը (IMAC հարստացում) բոլոր PDX ուռուցքային հյուսվածքներում՝ ուլտրաձայնային մշակմամբ կամ առանց դրա։ Հաշվվել են միայն այն սպիտակուցներն ու ֆոսֆոպեպտիդները, որոնց առատության հարաբերակցությունը մեծ կամ հավասար էր 25-րդ պերսենտիլին։ Առատության հարաբերակցությունը հաշվարկվել է նույն տեսակի նմուշների միջև։
Հետազոտություն և գրաֆիկներ՝ ©Li et al., 2025

Հետագա ֆերմենտային ճեղքում և վերլուծություն

Ուլտրաձայնային մշակումից և պարզեցումից հետո շարունակեք այնպես, ինչպես նկարագրված է CPTAC ոճի սկզբնական աշխատանքային ընթացակարգում՝

1. Լիզատը նոսրացրեք 1:3 (v/v) հարաբերակցությամբ՝ օգտագործելով 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, որպեսզի միզանյութի կոնցենտրացիան նվազեցնեք մինչև <2 M։
2. Ավելացրեք LysC՝ յուրաքանչյուր 50 µg սպիտակուցի հաշվով 1 mAU քանակությամբ, և ինկուբացրեք 2 h՝ 25°C ջերմաստիճանում։
3. Ավելացրեք տրիպսին՝ ֆերմենտ:սուբստրատ 1:49 (w/w) հարաբերակցությամբ, և ֆերմենտային ճեղքումը կատարեք գիշերվա ընթացքում՝ 25°C ջերմաստիճանում։
4. Ռեակցիան դադարեցրեք մրջնաթթվով՝ հասցնելով դրա վերջնական կոնցենտրացիան 1%-ի։
5. Ըստ անհրաժեշտության՝ շարունակեք աղազերծումը, TMT պիտակավորումը, ֆրակցիոնացումը, ֆոսֆոպեպտիդների հարստացումը և LC-MS/MS վերլուծությունը։

Ֆոսֆոպեպտիդների դիֆերենցիալ արտահայտվածությունը՝ ըստ TMT պիտակավորմամբ MS վերլուծության։
a. Բազալ ենթատիպը՝ առանձնացնելով մարդու որոշ ֆոսֆոպեպտիդներ (protein-sequence հաջորդականության սկիզբը և վերջը), որոնց արտահայտվածությունն ուլտրաձայնով մշակված նմուշներում բարձրացել է՝ չմշակված նմուշների համեմատ։ b. Լյումինալ ենթատիպը՝ առանձնացնելով մարդու որոշ ֆոսֆոպեպտիդներ (protein_sequence հաջորդականության սկիզբը և վերջը), որոնց արտահայտվածությունն ուլտրաձայնով մշակված նմուշներում բարձրացել է՝ չմշակված նմուշների համեմատ։ c. Հարստացված KEGG ուղիները՝ հիմնված ուլտրաձայնով մշակված բազալ ենթատիպի ուռուցքներում բարձրացած արտահայտվածությամբ ֆոսֆոպեպտիդների համապատասխան սպիտակուցների վրա։ d. Հարստացված KEGG ուղիները՝ հիմնված ուլտրաձայնով մշակված լյումինալ ենթատիպի ուռուցքներում բարձրացած արտահայտվածությամբ ֆոսֆոպեպտիդների համապատասխան սպիտակուցների վրա։
Հետազոտությունը և գրաֆիկները՝ ©Li et al., 2025

Նախագծում, արտադրություն և խորհրդատվություն – Գերմանիայում ստեղծված որակ

Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը հայտնի են որակի և նախագծման իրենց ամենաբարձր չափանիշներով։ Ամրությունը և շահագործման դյուրինությունը թույլ են տալիս մեր ուլտրաձայնային սարքերը սահուն ինտեգրել արդյունաբերական կայանքներում։ Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը հեշտությամբ են աշխատում ծանր պայմաններում և խստապահանջ միջավայրերում։

Hielscher Ultrasonics ընկերությունն ունի ISO հավաստագրում և հատուկ ուշադրություն է դարձնում բարձր արտադրողականությամբ ուլտրաձայնային սարքերին, որոնք առանձնանում են գերժամանակակից տեխնոլոգիայով և օգտագործման հարմարավետությամբ։ Իհարկե, Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը համապատասխանում են CE պահանջներին և բավարարում են UL, CSA և RoHs պահանջները։

Գրականություն / Հղումներ

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.