Սպիտակուցների ուլտրաձայնային էքստրակցիա հյուսվածքներից և բջջային կուլտուրաներից
- Սպիտակուցների էքստրակցիան պրոտեոմիկայում նմուշների պատրաստման էական փուլ է։
- Սպիտակուցները կարող են էքստրակցվել բուսական և կենդանական հյուսվածքներից, խմորասնկերից և միկրոօրգանիզմներից։
- Ուլտրաձայնային մշակումը սպիտակուցների էքստրակցիայի հուսալի, արդյունավետ մեթոդ է, որը կարճատև էքստրակցիայի ընթացքում ապահովում է սպիտակուցների բարձր ելք։
Սպիտակուցների էքստրակցիա հյուսվածքներից և բջիջներից
Հյուսվածքներից և կուլտիվացված բջիջներից սպիտակուցների էքստրակցիան նմուշների պատրաստման էական փուլ է, որն իրականացվում է բազմաթիվ կենսաքիմիական և վերլուծական մեթոդներ կիրառելիս, ինչպիսիք են ELISA, PAGE, վեստերն բլոթինգը, զանգվածային սպեկտրաչափությունը կամ սպիտակուցների մաքրումը։ Բջիջների ուլտրաձայնային քայքայումը, լիզիսը և էքստրակցիան ճշգրիտ կառավարվող, ոչ ջերմային մեթոդ են՝ սպիտակուցների բարձր ելք ապահովելու համար։
Բջիջներից սպիտակուցների էքստրակցիա՝ օգտագործելով UP200St ուլտրաձայնային զոնդը
- Արագ
- Բարձր ելք
- Բարձր արդյունավետություն
- Պարամետրերի ճշգրիտ կառավարում
- Վերարտադրելի արդյունքներ
- Դեպի ավելի մեծ մասշտաբներ գծային անցման հնարավորություն
Ուլտրաձայնային լիզիսի և սպիտակուցների էքստրակցիայի ընդհանուր ցուցումներ
- Ջերմաստիճանի կառավարում. Առանց ջերմային բնափոխման սպիտակուցների բարձր ելք ապահովելու համար էքստրակցիայի ընթացքում ջերմաստիճանը պետք է վերահսկվի։ Hielscher ընկերության գերժամանակակից ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորները, որոնք կոչվում են նաև ուլտրաձայնային դեզինտեգրատորներ կամ ուլտրաձայնային մշակման սարքեր, ճշգրիտ կառավարվող են։ Դրանք մատակարարվում են միացվող ջերմաստիճանային տվիչով։ Ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորի կարգավորումներում կարելի է սահմանել առավելագույն ջերմաստիճան։ Երբ այդ առավելագույն ջերմաստիճանը հասնում է սահմանված արժեքին, ուլտրաձայնային սարքն ինքնաբերաբար դադարում է աշխատել, մինչև նմուշը սառչի։
- Բուֆեր. Համապատասխան բուֆերի և դրա ճիշտ ծավալի ընտրությունը տարբերվում է՝ կախված հյուսվածքից, և պետք է որոշվի փորձերի ու սխալների մեթոդով։
- Անջատում / մաքրում. Սպիտակուցային լիզատները կարող են պարունակել կենսամոլեկուլների, օրինակ՝ ԴՆԹ-ի կամ ածխաջրերի ավելցուկ, որը կարող է հեռացվել սպիտակուցների նստեցմամբ (դեզօքսիխոլատ–տրիքլորքացախաթթու) կամ բուֆերի փոխանակմամբ։
Chittapalo և Noomhorm (2009) հեղինակներն իրենց հետազոտության մեջ հայտնել են, որ ուլտրաձայնային մշակման կիրառմամբ սպիտակուցների ելքն աճել է, և որ հյուսվածքների ուլտրաձայնային հոմոգենացման ու լիզիսի գործընթացը կարող է զգալիորեն բարելավել էքստրակցիայի առկա գործընթացները՝ ստեղծելով առևտրային էքստրակցիայի նոր հնարավորություններ։
Ուլտրաձայնային CupHorn համակարգը նախատեսված է միևնույն պայմաններում բազմաթիվ նմուշների միաժամանակյա, բարձր արդյունավետությամբ պատրաստման համար՝ սպիտակուցների անջատման և ԴՆԹ-ի ֆրագմենտացման նպատակով։
Սպիտակուցների էքստրակցիա կենդանական հյուսվածքներից
Ամբողջական հյուսվածքի (օրինակ՝ երիկամի, սրտի, թոքի, մկանի և այլն) պատրաստման համար հյուսվածքը պետք է մաքուր գործիքներով բաժանել շատ փոքր կտորների՝ ցանկալի է սառույցի վրա և հնարավորինս արագ՝ պրոտեազներով քայքայումը կանխելու համար (օրինակ՝ լիզիսի բուֆեր, ինչպիսին է RIPA բուֆերը կամ պրոտեազների և ֆոսֆատազների արգելակիչների խառնուրդ պարունակող հիպոտոնիկ լիզիսի բուֆերը)։ Մասնատումից հետո նմուշն ընկղմվում է հեղուկ ազոտի մեջ՝ ակնթարթային սառեցման համար։ Նմուշը կարելի է պահել -80°C ջերմաստիճանում՝ հետագա օգտագործման համար, կամ պահել սառույցի վրա՝ անմիջապես հոմոգենացնելու համար։ Ուլտրաձայնային էքստրակցիայից անմիջապես առաջ նմուշի փորձանոթի մեջ արագ ավելացվում է սառցասառը լիզիսի բուֆեր (պրոտեազների արգելակիչներով՝ DTT, լեյուպեպտին և ապրոտինին) (յուրաքանչյուր ~10 mg հյուսվածքի համար խորհուրդ է տրվում մոտ ~600 μL բուֆեր)։ Յուրաքանչյուր նմուշի փորձանոթի համար խորհուրդ է տրվում մոտ 20–60mg հյուսվածք։
Ուլտրաձայնային հոմոգենացումը, լիզիսը և էքստրակցիան իրականացվում են միկրոծայրով սոնոտրոդով հագեցած ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորով, օրինակ՝ UP100H կամ UP200Ht սարքով։ Ուլտրաձայնային մշակման տևողությունը 60–90 sec. է՝ 15 sec. ուլտրաձայնային մշակման և 10 sec. հանգստի ցիկլային ռեժիմով։ Նմուշն ամբողջ ընթացքում պետք է պահվի սառույցի մեջ։
Ուլտրաձայնային հոմոգենացումից / էքստրակցիայից հետո լիզատը ցենտրիֆուգվում է 27 000g պայմաններում՝ մոտ 20 min.։ Այնուհետև հավաքվում է վերնստվածքային հեղուկը, որպեսզի սպիտակուցի կոնցենտրացիան հնարավոր լինի որոշել սպիտակուցի քանակական որոշման մեթոդով, օրինակ՝ Pierce BCA սպիտակուցի քանակական որոշման թեստով։
Սպիտակուցների էքստրակցիա արյան շիճուկից
Շիճուկի և ֆոսֆատային բուֆերի համասեռ խառնուրդ ստանալու համար նմուշը նախ ենթարկվում է վորտեքսային խառնման՝ բջիջների ուլտրաձայնային լիզիսից առաջ։ Ուլտրաձայնային լիզիսի համար նմուշը մշակվում է ուլտրաձայնային լաբորատոր հոմոգենիզատորով, օրինակ՝ UP100H սարքով, 8 ցիկլով՝ 20% ամպլիտուդով. յուրաքանչյուր ցիկլը ներառում է 5 վայրկյան աշխատանք և 15 վայրկյան դադար։ Սպիտակուցների էքստրակցիան իրականացվում է ցիկլային ուլտրաձայնային մշակմամբ (իմպուլսային ռեժիմով) և նմուշը սառույցի վրա տեղադրելով՝ նմուշի գերտաքացումից ու ջերմային քայքայումից խուսափելու համար։ Քանի որ շիճուկը պարունակում է մեծ քանակությամբ բարձր մոլեկուլային զանգվածով սպիտակուցներ (օրինակ՝ ալբումին, α1-անտիտրիպսին, տրանսֆերին, հապտոգլոբուլին, իմունոգլոբուլին G և իմունոգլոբուլին A), որոնք IEF-ի ընթացքում խանգարում են ցածր մոլեկուլային զանգվածով սպիտակուցների տարանջատմանը, խորհուրդ է տրվում դրանք հեռացնել շիճուկից՝ օգտագործելով հեռացման սյունակ։
Սպիտակուցների էքստրակցիա բուսական հյուսվածքից
Թարմ, փափուկ բուսական հյուսվածքը, օրինակ՝ մամուռը և այլն, կարելի է հեշտությամբ քայքայել՝ պարզապես մանրատված նմուշանյութը տեղադրելով լիզիսի բուֆերի մեջ՝ ուլտրաձայնային մշակման համար։ Կոշտ, փայտացած բուսական հյուսվածքները, օրինակ՝ սերմերը, եղևինի ասեղնատերևները և այլն, պետք է աղալ չոր վիճակում։ Որոշ կարծր, փայտային բուսանյութեր պետք է սառեցնել և աղալ հեղուկ ազոտի մեջ՝ ուլտրաձայնային մշակմամբ էքստրակցիայից առաջ։ Բուսական բջջային կուլտուրաների կախույթների համար լիզիսի բուֆերում 30–150 վայրկյան տևողությամբ ուլտրաձայնային մշակումը հիմնականում բավարար է։ Ավելի կոշտ նյութերը, օրինակ՝ դդմի սերմերը, պահանջում են ավելի ինտենսիվ ուլտրաձայնային մշակում, ինչպես նկարագրված է ստորև։
Դդմի սերմերից ալբումինի ուլտրաձայնային էքստրակցիայի արձանագրություն
Դդմի սերմերի մանր աղացած փոշուց ալբումինի ուլտրաձայնային սպիտակուցային էքստրակցիայի համար 250mL ապակե բաժակի մեջ ավելացվում են դդմի սերմերի 10 g ճարպազերծված փոշի և որպես լուծիչ՝ 100 mL դեիոնացված ջուր։ Սպիտակուցների էքստրակցիան բաղկացած է երկու փուլից։ Նախ նմուշը ենթարկվում է ուլտրաձայնային մշակման՝ օգտագործելով S24d7 սոնոտրոդով հագեցած UP400St (400W, 24kHz) զոնդային տիպի ուլտրաձայնային սարքը։ Ուլտրաձայնային հոմոգենացման ընթացքում ապակե բաժակը տեղադրվում է սառը ջրային բաղնիքում։ UP400St ուլտրաձայնային սարքի միացվող ջերմաստիճանային սենսորը և ջերմաստիճանի կառավարման կարգավորումները ապահովում են, որ նմուշի ջերմաստիճանը միշտ պահպանվի 30°C-ից ցածր։ Ուլտրաձայնային մշակման ընթացքում ջերմաստիճանի ճշգրիտ վերահսկմամբ կանխվում է ալբումինի բնափոխումը։ Երկրորդ փուլում էքստրակցիան իրականացվել է խառնիչով՝ 200 rpm արագությամբ և 30°C ջերմաստիճանում։ Այնուհետև բաժակը տեղափոխվում է ջերմակարգավորվող թափահարիչի մեջ։ Գլոբուլինը հեռացվում է թորած ջրով դիալիզի միջոցով։ Գլոբուլինի հեռացումից հետո սպիտակուցային էքստրակտից կարելի է նմուշ վերցնել՝ ալբումինի պրոֆիլը որոշելու համար, որից հետո ալբումինի կոագուլացման նպատակով էքստրակտը կարգավորվում է մինչև pI=3,0՝ օգտագործելով 0,1 M HCl։ Պինդ ֆազը տարանջատվում է ցենտրիֆուգմամբ՝ 5000g պայմաններում, 20°C ջերմաստիճանում, և կրկին լուծվում դեիոնացված ջրում։ Ալբումինի կոագուլացումը կատարվում է երկու անգամ՝ ալբումինի խտանյութում սպիտակուցի մասնաբաժինը մեծացնելու համար։
Բրնձի թեփից սպիտակուցային խտանյութ ստանալու նպատակով իրականացվող սպիտակուցների ուլտրաձայնային հիմնային էքստրակցիան ցույց է տալիս, որ ուլտրաձայնային մշակումը ապահովում է սպիտակուցի ավելի բարձր ելք՝ էքստրակցիայի զգալիորեն ավելի կարճ ժամանակում՝ համեմատած էքստրակցիայի ավանդական մեթոդների հետ։
Ֆունկցիոնալ iNOS ֆերմենտի համար նմուշի նախապատրաստման արձանագրություն
Լիովին ֆունկցիոնալ iNOS ֆերմենտ ստանալու համար (օրինակ՝ դեղամիջոցների սկրինինգի նպատակով) խորհուրդ է տրվում հետևյալ արձանագրությունը։ Բջջային կախույթը պետք է տեղադրել սառույցի վրա և ենթարկել ուլտրաձայնային մշակման UP100H սարքով՝ 10µm ամպլիտուդով, ցիկլային ռեժիմով՝ 5 sec. ուլտրաձայնային մշակում և 25 sec. դադար սառույցի վրա։ Գործընթացը պետք է կրկնել մոտավորապես 3 անգամ։ Ուլտրաձայնային մշակման ցիկլերի միջև դադարը նվազեցնում է ջերմաստիճանի բարձրացումը և, հետևաբար, կնվազեցնի բնափոխման վտանգը։
Սպիտակուցների ուլտրաձայնային լուծելիացում
Ուլտրաձայնային մշակումը կարող է արագացնել սպիտակուցների լուծելիացման գործընթացը, որը սովորաբար պահանջում է մի քանի ժամ։ Նմուշը չգերտաքացնելու և միզանյութ պարունակող լուծույթներում սպիտակուցների քայքայումն ու փոփոխությունները կանխելու համար ուլտրաձայնային իմպուլսները չպետք է տևեն մի քանի վայրկյանից ավելի։
UP200Ht ուլտրաձայնային սարք՝ 2mm չափի S26d2 միկրոծայրակալով՝ փոքր նմուշների ուլտրաձայնային մշակման համար։
Ուլտրաձայնային սարքավորումներ սպիտակուցների էքստրակցիայի համար
Hielscher Ultrasonics ընկերությունն առաջարկում է ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորների լայն տեսականի՝ բջիջների, հյուսվածքների, բակտերիաների, միկրոօրգանիզմների, խմորասնկերի և սպորների քայքայման համար։
Hielscher լաբորատոր ուլտրաձայնային սարքերը հզոր են և հեշտ շահագործվող։ Դրանք նախատեսված են 24/7 աշխատանքի համար և նախագծված են որպես ամուր ու արդյունավետ լաբորատոր և սեղանի սարքեր։ Բոլոր սարքերում էներգիայի ելքն ու ամպլիտուդը կարելի է ճշգրիտ կառավարել։ Լրացուցիչ պարագաների լայն տեսականին ապահովում է սարքակազմի կազմաձևման լրացուցիչ հնարավորություններ։ Թվային ուլտրաձայնային սարքերը, ինչպիսիք են VialTweeter, UP200Ht, UP200St և UP400St մոդելները, ունեն ջերմաստիճանի կառավարման ինտեգրված համակարգ և ներկառուցված SD քարտ՝ տվյալների ավտոմատ գրանցման համար։
Բազմաթիվ նմուշների անուղղակի, առանց խաչաձև աղտոտման և միաժամանակյա ուլտրաձայնային մշակման համար առաջարկում ենք VialTweeter սարքը կամ ուլտրաձայնային CupHorn սարքը։
Ստորև բերված աղյուսակը ներկայացնում է նմուշների նախապատրաստման, բջիջների քայքայման և էքստրակցիայի համար նախատեսված մեր ուլտրաձայնային սարքերի ընդհանուր պատկերը։ Յուրաքանչյուր ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորի մասին լրացուցիչ տեղեկություններ ստանալու համար սեղմեք սարքի տեսակի վրա։ Մեր լավ պատրաստված և երկարամյա փորձ ունեցող տեխնիկական անձնակազմը սիրով կօգնի ձեզ ընտրել ձեր նմուշների նախապատրաստման համար ամենահարմար ուլտրաձայնային սարքը։
| Մեկ խմբաքանակի ծավալը | Հոսքի ծավալային արագությունը | Առաջարկվող սարքերը |
|---|---|---|
| մինչև 10 սրվակ կամ փորձանոթ | n.a. | VialTweeter |
| բազմահորիկ / միկրոտիտրային թիթեղներ | n.a. | UIP400MTP |
| բազմաթիվ փորձանոթներ / անոթներ | n.a. | CupHorn |
| 1-ից մինչև 500mL | 10-ից մինչև 200mL/min | UP100H |
| 10-ից մինչև 1000mL | 20-ից մինչև 200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| 10-ից մինչև 2000mL | 20-ից մինչև 400mL/min | UP400St |
Կախված ձեր կիրառությունից, նյութից և նմուշի ծավալից՝ մենք կառաջարկենք ձեր նմուշների նախապատրաստման համար ամենահարմար սարքակազմը։ Կապվեք մեզ հետ այսօր։
Կապվեք մեզ հետ։ / Հարցրեք մեզ։
Hielscher թվային ուլտրաձայնային սարքերն ունեն դիտարկիչի միջոցով հեռակառավարման և ինտեգրված SD քարտի վրա տվյալների ավտոմատ արձանագրման գործառույթներ։
VialTweeter անուղղակի ուլտրաձայնային մշակման համար։
Փաստեր, որոնք արժե իմանալ
Պրոտեոմիկա
Պրոտեոմիկան հետազոտական ոլորտ է, որն ուսումնասիրում է սպիտակուցներն ու պրոտեոմը։ Սպիտակուցներն օրգանիզմներում կատարում են կենսական նշանակություն ունեցող գործառույթների հսկայական բազմազանություն։ Պրոտեոմը տվյալ պահին գենոմի, բջջի, հյուսվածքի կամ օրգանիզմի կողմից էքսպրեսվող սպիտակուցների ամբողջական հավաքածուն է։ Պրոտեոմը փոփոխվում է ժամանակի ընթացքում և կախված այն առանձնահատուկ պահանջներից կամ սթրեսներից, որոնց ենթարկվում է բջիջը կամ օրգանիզմը։ Ավելի որոշակի՝ այն տվյալ տեսակի բջջում կամ օրգանիզմում տվյալ պահին և սահմանված պայմաններում էքսպրեսվող սպիտակուցների հավաքածուն է։ Եզրույթը կազմված է «սպիտակուցներ» և «գենոմ» բառերի համադրությունից։ Պրոտեոմիկան պրոտեոմի ուսումնասիրությունն է։
Սպիտակուց
Սպիտակուցները խոշոր կենսամոլեկուլներ են՝ այսպես կոչված մակրոմոլեկուլներ, որոնք կազմված են ամինաթթվային մնացորդների մեկ կամ մի քանի երկար շղթաներից։ Սպիտակուցներն առկա են ինչպես բուսական, այնպես էլ կենդանական ծագման բոլոր օրգանիզմներում և առանցքային նշանակություն ունեն կենսաբանական գործառույթների մեծ մասի համար։ Քանի որ սպիտակուցները պարունակում են մեծ քանակությամբ կենսաբանական տեղեկություն, դրանք էքստրակցիայի են ենթարկվում վերլուծական նպատակներով, օրինակ՝ պրոտեոմիկ հետազոտությունների համար։ Սպիտակուցների կատարած ամենակարևոր գործառույթները ներառում են նյութափոխանակային ռեակցիաների կատալիզը, ԴՆԹ-ի կրկնապատկումը, գրգիռներին արձագանքելը և մոլեկուլների տեղափոխումը մի տեղից մյուսը։ Սպիտակուցները միմյանցից տարբերվում են հիմնականում իրենց ամինաթթվային հաջորդականությամբ, որը թելադրվում է դրանց գեների նուկլեոտիդային հաջորդականությամբ և սովորաբար հանգեցնում է սպիտակուցի ծալավորմանը որոշակի եռաչափ կառուցվածքի, որը որոշում է դրա ակտիվությունը։ Սպիտակուցները՝ պեպտիդների հետ մեկտեղ, սննդի հիմնական բաղադրիչներից են։ Հետևաբար, պրոտեոմիկան սննդագիտության հզոր գործիք է՝ գործընթացները, սննդի անվտանգությունը և սննդային արժեքի գնահատումը օպտիմալացնելու համար։
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction անալիտների առանձնացման և նախնական խտացման նախավերլուծական ընթացակարգ է։ Ուլտրաձայնային մշակման հետ համատեղ պղտորման կետում էքստրակցիան կարելի է ինտենսիվացնել՝ գործընթացը դարձնելով ավելի արդյունավետ, արագ և շրջակա միջավայրի համար ավելի բարենպաստ։ Ուլտրաձայնային մշակման կիրառմամբ պղտորման կետում էքստրակցիան անալիտների նախապատրաստման զգալիորեն ավելի արդյունավետ մեթոդ է։ Կարդացեք ավելին ուլտրաձայնի օժանդակությամբ պղտորման կետում էքստրակցիայի մասին։
Գելային էլեկտրոֆորեզ
Գելային էլեկտրոֆորեզը մակրոմոլեկուլների, ինչպիսիք են DNA, RNA և սպիտակուցները, ինչպես նաև դրանց ֆրագմենտների բաժանման և վերլուծության հիմնական մեթոդն է՝ հիմնված դրանց չափի և լիցքի վրա։ Այն կիրառվում է կլինիկական քիմիայում՝ սպիտակուցներն ըստ լիցքի և/կամ չափի բաժանելու համար (IEF ագարոզա՝ ըստ էության չափից անկախ), իսկ կենսաքիմիայում, մոլեկուլային կենսաբանությունում և պրոտեոմիկայում՝ DNA և RNA ֆրագմենտների խառը պոպուլյացիան ըստ երկարության բաժանելու, DNA և RNA ֆրագմենտների չափը գնահատելու կամ սպիտակուցներն ըստ լիցքի բաժանելու համար։
Բջջային կուլտուրաներ
Բջջային կուլտուրան աճեցման վերահսկվող գործընթաց է, որի ընթացքում բջիջներն աճեցվում են վերահսկվող պայմաններում։ Բջջային կուլտուրայի պայմանները տարբերվում են բջիջների յուրաքանչյուր տեսակի համար։ Ընդհանուր առմամբ, բջջային կուլտուրայի միջավայրը բաղկացած է համապատասխան անոթից (օրինակ՝ Պետրիի թասից)՝ սուբստրատով կամ սննդամիջավայրով, որը մատակարարում է անհրաժեշտ սննդանյութերը (ամինաթթուներ, ածխաջրեր, վիտամիններ, հանքանյութեր), աճի գործոնները, հորմոնները և գազերը (CO2, O2), ինչպես նաև կարգավորում է ֆիզիկաքիմիական միջավայրը (pH բուֆեր, օսմոտիկ ճնշում, ջերմաստիճան)։ Բջիջների մեծ մասին անհրաժեշտ է մակերես կամ արհեստական սուբստրատ, մինչդեռ այլ բջջային կուլտուրաներ կարող են աճեցվել սննդամիջավայրում ազատ լողացող վիճակում (սուսպենզիոն կուլտուրա, բջջային սուսպենզիա)։
Կենդանական բջջային գծերի զանգվածային կուլտուրաներն օգտագործվում են վիրուսային պատվաստանյութերի և կենսատեխնոլոգիական եղանակով ստացվող այլ արտադրանքների արդյունաբերական արտադրությունում։ Մարդու ցողունային բջիջներն աճեցվում են՝ բջիջների թիվն ավելացնելու և փոխպատվաստման նպատակով դրանք տարբեր տեսակի սոմատիկ բջիջների տարբերակելու համար։
Հյուսվածքային նմուշներ
«Հյուսվածք» եզրույթը նկարագրում է բջջային միջանկյալ կազմավորում, որտեղ բջջային նյութը կազմակերպման մակարդակով գտնվում է բջիջների և ամբողջական օրգանի միջև։ Հյուսվածքում միավորված են նույն ծագումն ունեցող նմանատիպ բջիջներ, որոնք միասին կատարում են որոշակի գործառույթ։ Բազմաթիվ հյուսվածքների գործառութային խմբավորման միջոցով ձևավորվում են օրգանների բարդ կառուցվածքները։
Հյուսվածքից նմուշներ են վերցվում կենսաբանության, հյուսվածաբանության/հյուսվածաախտաբանության, մակաբուծաբանության, կենսաքիմիայի, իմունահյուսվածաքիմիայի բնագավառներում հետազոտություններ կատարելու, ինչպես նաև DNA աճեցնելու և արդյունահանելու համար։ Տարբերակում են կենդանական (ենթաբաժին՝ կաթնասունների հյուսվածք) և բուսական հյուսվածքներ։ Կենդանական հյուսվածքները խմբավորվում են չորս հիմնական տեսակների՝ շարակցական, մկանային, նյարդային և էպիթելային հյուսվածքների։ Բուսական հյուսվածքը ստորաբաժանվում է հետևյալ երեք հյուսվածքային համակարգերի՝ էպիդերմիս, հիմնական հյուսվածք և փոխադրող հյուսվածք։
Հյուսվածքային նմուշներ կարելի է պատրաստել կենդանիների կամ բույսերի մասերից, օրինակ՝ ոսկրից, մկանից, տերևներից և այլն։
Մարմնի հեղուկներ
Արյունը, շիճուկը, պլազման, ողնուղեղային հեղուկը, թուքը և սինովիալ հեղուկը մարմնի հեղուկներ են, որոնք ախտորոշման համար նշանակալի տեղեկատվության հարուստ աղբյուր են։ Ուստի կարևոր է մարմնի հեղուկների նմուշների մանրակրկիտ նախապատրաստումը վերլուծության համար։ Առաջին դժվարությունը կապված է մարմնի հեղուկներում առկա բաղադրիչների լայն դինամիկ տիրույթի հետ։
Սպիտակուցի կոնցենտրացիայի որոշում
Բրեդֆորդի, Լոուրիի և բիցինխոնինաթթվային (BCA) անալիզները սպիտակուցների կոնցենտրացիան որոշելու տարածված մեթոդներ են։ Տավարի շիճուկային ալբումինը (BSA) ամենահաճախ օգտագործվող սպիտակուցային ստանդարտներից մեկն է։
Լիզիսի բուֆեր
Լիզիսի բուֆերը պետք է ընտրվի՝ հաշվի առնելով բջջային նյութը կամ հյուսվածքը (հյուսվածքային կուլտուրա, բույս, բակտերիաներ, սնկեր և այլն), ինչպես նաև այն, թե արդյոք բջիջները որևէ կառուցվածքի կազմում են, և ինչ տեսակի է այդ կառուցվածքը։ Սպիտակուցների, թաղանթների և օրգանելների էքստրակցիայի համար նախատեսված լիզիսի բուֆերների լայն տեսականին պատրաստվում է մեկ կամ մի քանի դետերգենտներով։ Դետերգենտը սովորաբար ընտրվում է փորձերի և սխալների մեթոդով կամ, առկայության դեպքում, սպիտակուցների էքստրակցիայի գործող արձանագրության համաձայն։ Դետերգենտը պետք է համատեղելի լինի հյուսվածքի աղբյուրի և սպիտակուցների հետ։ Ընդհանուր առմամբ, էքստրակտի առավելագույն ֆունկցիոնալությունը պահպանելու համար ընտրվում է տվյալ հյուսվածքի / սպիտակուցի համար արդյունավետ ամենամեղմ դետերգենտը։ Բացի այդ, թաղանթների և օրգանելների էքստրակցիայի դեպքում մեղմ դետերգենտը պահպանում է թաղանթի ամբողջականությունը։ Լիզիսի բուֆերներում սովորաբար օգտագործվող դետերգենտները հիմնականում ոչ իոնային կամ ցվիտերիոնային են, օրինակ՝ CHAPS, դեզօքսիխոլատ, Triton™ X-100, NP40 և Tween 20։
Օրինակ՝ ուղեղի, լյարդի, աղիքի, երիկամի, փայծաղի և այլ հյուսվածքներ կարելի է պարզապես բուֆերացնել RIPA բուֆերով, սակայն անհրաժեշտ է ներառել պրոտեազների ինհիբիտորներ և DTT (օրինակ՝ գելային էլեկտրոֆորեզի համար)։
Լիզիսի բուֆեր կմախքային մկանային հյուսվածքի համար (սառցասառը)՝ 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) գլիցերին, 1 mM EDTA, 1 mM դիթիոթրեիտոլ՝ պրոտեազների և ֆոսֆատազների ինհիբիտորների խառնուրդի հավելմամբ։
Տարածված բուֆերների և դրանց pH միջակայքի աղյուսակ։ Ընդհանուր առմամբ, այս բուֆերները սովորաբար օգտագործվում են 20–50 mM կոնցենտրացիաներով։
| Բուֆեր | pH միջակայք |
|---|---|
| Կիտրոնաթթու – NaOH | 2,2 — 6,5 |
| Նատրիումի ցիտրատ – կիտրոնաթթու | 3,0 — 6,2 |
| Նատրիումի ացետատ – քացախաթթու | 3,6 — 5,6 |
| Կակոդիլաթթվի նատրիումական աղ – HCl | 5,0 — 7,4 |
| MES – NaOH | 5,6 — 6,8 |
| Նատրիումի դիհիդրոֆոսֆատ – դինատրիումի հիդրոֆոսֆատ | 5,8 — 8,0 |
| Իմիդազոլ – HCl | 6,2 — 7,8 |
| MOPS – KOH | 6,6 — 7,8 |
| Տրիէթանոլամինի հիդրոքլորիդ – NaOH | 6,8 — 8,8 |
| Tris – HCl | 7,0 — 9,0 |
| HEPES – NaOH | 7,2 — 8,2 |
| Տրիցին – NaOH | 7,6 — 8,6 |
| Նատրիումի տետրաբորատ – բորաթթու | 7,6 — 9,2 |
| Բիցին – NaOH | 7,7 — 8,9 |
| Գլիցին – NaOH | 8,6 — 10,6 |
Բուֆերների մեծ մասի pH արժեքը կախված է ջերմաստիճանից։ Սա հատկապես վերաբերում է Tris բուֆերներին։ pKa արժեքը փոխվում է՝ 25°C ջերմաստիճանում 8,06-ից մինչև 0°C ջերմաստիճանում 8,85։
(Բուֆերի pH և pKa. pH ցուցանիշը չափում է ջրային լուծույթում ջրածնի իոնների կոնցենտրացիան։ pKa (= թթվի դիսոցման հաստատուն) ցուցանիշը հարակից, սակայն ավելի յուրահատուկ չափանիշ է, քանի որ օգնում է կանխատեսել, թե ինչպես կգործի մոլեկուլը տվյալ pH արժեքի դեպքում։)
TRIzol
TRIzol քիմիական լուծույթն օգտագործվում է RNA/DNA/սպիտակուցի էքստրակցիայի համար՝ գուանիդինիումի թիոցիանատ–ֆենոլ–քլորոֆորմային էքստրակցիայի ընթացքում։ Ուլտրաձայնի օժանդակությամբ TRIzol էքստրակցիայի կիրառումը նույն նմուշից ապահովում է DNA, RNA և սպիտակուցների բարձր ելքեր և այդպիսով գերազանցում է էքստրակցիայի այլ մեթոդներին։
Գրականություն/Հղումներ
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.