Ուլտրաձայնային լիզինգ E. Coli- ի կողմից

• E. coli մանրէներ են առավել լայնորեն կիրառվող մանրէներ մանրէաբանության եւ կենսատեխնոլոգիայի:
• Ուլտրաձայնային բջջային Խանգարիչներ մատուցել հուսալի եւ reproducible արդյունքները համար lysis Ե coli.
• Ինտենսիվ դեռ հստակ կառավարելի Cavitation եւ խուզել ուժերը հանգեցնել ամբողջական կազմալուծման եւ բարձր ջրահեռացման զիջում (օրինակ սպիտակուցներ, ԴՆԹ).

Բջջային կազմալուծման կողմից Cavitation

Ուլտրաձայնային Հուշել-type Homogenizers գործել մոտ: 20,000 ցիկլեր մեկ վայրկյանում (at 20KHz) եւ առաջացնել cavitation է հեղուկների կամ supsensions: Ակուստիկ cavitation միկրոսկոպիկ ոլորտներն Վակուումային նման ճնշումների եւ բարձր ջերմաստիճանի, որոնք արցունքաբեր բջիջները բացի. Չնայած նրան, որ ջերմաստիճանը կարող է հասնել մի քանի հազար աստիճան, Cavitation ծավալները այնքան փոքր է, որ նրանք չեն տաքացնում այդ գործընթացը զգալիորեն. Ուլտրաձայնային գեներացվել ակուստիկ cavitation եւ խուզել ուժերը անցք կամ կոտրել բջջային թաղանթ E.coli – կախված սարքի ընդլայնված ուլտրաձայնային homogenizer:

Առավելությունները ուլտրաձայնային Lysis

• ճշգրիտ վերահսկողություն lysis (ինտենսիվությունը, առատություն, ջերմաստիճան)
• օպտիմալը adaption է կոնկրետ նմուշների
• ջերմաստիճանի վերահսկում
• շատ փոքր է, շատ մեծ նմուշների (մկլ է լիտր)
• մաքուր մեխանիկական թերապիա
• գծային սանդղակի-մինչեւ լաբորատորիայում արտադրության

Մինչդեռ քիմիական եւ enzymtic lysis կարող է խնդրահարույց – քանի որ քիմիական lysis կարող փոխել սպիտակուցը կառույցներին եւ ներկայացնել մաքրման խնդիրներ եւ ֆերմենտային lysis պահանջում է երկար ինկուբացիոն անգամ, եւ ոչ թե reproducible – Ուլտրաձայնային խզում է բարդ, արագ բջջային խզում մեթոդը:
Ուլտրաձայնային լիզինգը հիմնված է միայն մեխանիկական ուժերի վրա: Ոչ մի քիմիական նյութ չի ավելացվել, sonication խախտում է բջջային պատը shear ուժերի կողմից: Քիմիական լիզինգը կարող է փոխել սպիտակուցի կառուցվածքը եւ ներդնել մաքրման խնդիրները: enzymatic խանգարումը պահանջում է երկար ժամանակ ինկուբացիոն ժամանակներ եւ չի վերարտադրելի:

Ընդհանուր Առաջարկություններ

Sonication է ամենատարածված տեխնիկան նկարագիր շատ փոքր, միջին եւ մեծ քանակությամբ բջջային կախույթների – սկսած PICO-լիտր մինչեւ 100L / ժ (օգտագործելով ուլտրաձայնային հոսքի բջիջը): Խցերը lysed են հեղուկ ճղել եւ cavitation. ԴՆԹ-ն նաեւ շերտահատված ընթացքում sonication, այնպես չէ, անհրաժեշտ է ավելացնել DNase է բջջային կասեցման:
Ջերմաստիճանի:
Ըստ նախնական սառեցման նմուշը եւ պահելու նմուշը ընթացքում sonication սառույցի, sample ջերմային դեգրադացիան նմուշի կարող է հեշտությամբ կանխել:
Իդեալում, նմուշները պետք է սառչել սառնարանին լիզինգի ժամանակ, բայց շատ նմուշների համար դա բավարար է, եթե ջերմաստիճանը չի բարձրանում մշակույթի կամ հյուսվածքային աղբյուրի ջերմաստիճանից բարձր: Ուստի խորհուրդ է տրվում պահել սառցադիմումը սառույցի վրա եւ sonicate մի քանի կարճ ուլտրաձայնային պուլսերի 5-10 վայրկյան եւ pauses 10-30 վայրկյան: Դադարների ընթացքում ջերմությունը կարող է ջնջվել, որպեսզի վերականգնել ցածր ջերմաստիճանը: Ավելի մեծ բջիջների նմուշների համար հասանելի հոսքային բջջային ռեակտորներ են հովացման բաճկոններով:

Արձանագրությունները պատրաստման համար E. coli Lysates

Արտահայտությունը վերլուծություն եւ մաքրում recombinant սպիտակուցային

E կոլի գնդիկ էր sonicated հետ ուլտրաձայնային համակարգով UP100H (Hielscher): Այս նպատակով բջջային գնդիկները վերամշակվել են սառեցված լիզի բուֆերում (50 մմ Tris-HCl pH = 7.5, 100 մմ NaCl, 5 մմ DTT, 1 մմ PMSF) եւ 10 րոպե սառույցով սառեցված: Այնուհետեւ, բջջային կասեցումը sonicated հետ 10 կարճ պայթյունների 10 s, որին հաջորդում է 30 վայրկյան ժամանակ սառեցման համար: Վերջապես, բջջային բեկորները հեռացվել են 4 ° C-ում, 15 րոպե, 14000 ռ / ժ-ով: RPR արտահայտության հաստատման համար սկավառակը գործարկվեց 12% պոլիէթիլենային գելում եւ վերլուծեց SDS-PAGE- ի եւ արեւմտյան blotting- ի միջոցով: RPR- ի մաքրումը կատարվել է Ni- ի միջոցով²⁺-NTA խեժ (Invitrogen, ԱՄՆ), համաձայն արտադրողի ուղեցույցի: Այս փուլում, ծնունդով մաքրման մեթոդը օգտագործվում էր: Մաքրությունը զտած սպիտակուցային էր գնահատվել electrophoresis է 12% polyacrylamide գել ու հետագա Coomassie կապույտ staining. Մաքրվել սպիտակուցը կոնցենտրացիան չափվում էր Միկրո BCA սպիտակուցը հարգը հանդերձանքը (PIERCE, ԱՄՆ): (Azarnezhad et al. 2016 թ.):

Բջջային Աճի, քրոսլինքինգ եւ պատրաստում E. coli Բջջային Մզվածքներ

Համար SeqA եւ RNA պոլիմերազային Chip-Chip E. coli MG1655 կամ MG1655 ΔseqA մեծացել է 37 ° C է Od₆₀₀ 50 մլ-ի մոտ 0,15-ը (+ 0,2% գլյուկոզա) ավելացվել է մինչեւ 27 մլ-ի ֆորմալդեհիդը (37%) մեկ միլիոն միջին (վերջնական կոնցենտրացիա `1%): Խաչաձեւ կապը կատարվել է դանդաղ թափահարում (100 ռ / վ) 20 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում, այնուհետեւ `10 մլ 2.5 Մ գլիցինով (վերջնական կոնցենտրացիան 0.5 Մ): Ջերմահեռացման փորձերի համար E. coli MG1655 աճել է 65 ° LB միջավայրում, 30 ° C- ով, OD- ով₆₀₀ մոտ 0.3: Հետագայում 30 մլ մշակույթը փոխանցվեց նախնական տաքացվող շշով 43 ° C- ում, իսկ մնացածը, 30 ° C- ում: Crosslinking եւ quenching էր վերը նկարագրված էր, բացառությամբ, որ բջիջները պահվել են 30 կամ 43 ° C 5 րոպե առաջ դանդաղ թափահարում սենյակային ջերմաստիճանում: Բջիջները հավաքվում էին ցենտրիֆուգով եւ երկու անգամ լվացվում էին ցրտաշունչ TBS- ով (pH7.5): 1 մլ լիզի բուֆեր (10 մմ Tris (pH 8.0), 20% sucrose, 50 mM NaCl, 10 մմ EDTA, 10 մգ / մլ լիզոզիմ) եւ ինկուբացիա 37 ° C- ում 30 րոպե հետո վերականգնելուց հետո, 4 մլ բուֆեր, բջիջները սառույցի վրա sonicated են 12 անգամ 30 վայրկյան եւ 30 վայրկյան ընդմիջում է UP400St ուլտրաձայնային պրոցեսոր (Hielscher Ultrasonics GmbH) հետ 100% իշխանության. Այն բանից հետո, centrifugation համար 10 րոպե 9000 գ, 800 մկլ aliquotes է supernatant էին պահվում է -20 ° C: (Waldminghaus 2010)

Գերարտադրություն եւ մաքրում enzymes:

Համար գերարտադրության մասին decahistidine (His10) -tagged սպիտակուցներ, E. coli BL21 (DE3) վերափոխվում հետ pET19b կառուցում. An գիշերում preculture էր harvested է centrifugation, իսկ 1% -ը օգտագործվում էր ներշնչել մի արտահայտություն մշակույթ: Բջիջները իրականացնող pET19mgtB են աճել 22 ° C մինչեւ օպտիկական խտությունը 600 նմ (OD₆₀₀) Եւ 0,7: Մշակույթը էր փոխանցվել է 17 ° C եւ induced կողմից 100 մկմ-ից IPTG: Այն բանից հետո, 16 ժ, իսկ մշակույթը harvested է centrifugation է 7500 × g ժամը 4 ° C: Խցերը resuspended է 50 մմ ֆոսֆատ-buffered saline (PBS) 0.3 M NaCl Փի-Էյչ 7.4 եւ դադարեցրեցին կողմից ultrasonication հետ S2 միկրո-tip sonotrode ժամը UP200St ultrasonicator (Hielscher, Teltow, Գերմանիա) մի ցիկլի 0.5 եւ առատություն 75%:
Որ Գերարտադրություն decahistidine-հատկորոշվել GtfC էր induced 37 ° C, ժամը Od₆₀₀ 0,6 100 մկմ-ից IPTG: Խցերը ապա հիմնադրամի համար 4 ժ, harvested, եւ lysed վերոհիշյալին համար MgtB.
Հում Բջջային Մզվածքներ են centrifuged 15000 × գ եւ 4 ° C է նստվածք բջջային բեկորներ. Ճշգրտված հատվածները, որոնք բեռնված է 1 մլ HisTrap ff կոպիտ սյունակներում օգտագործելով ÄKTAprime Plus համակարգ (GE Առողջապահություն): Այն enzymes մաքրվել ըստ արտադրողի կողմից արձանագրության համար գրադիենտ elution Նրա-նշած սպիտակուցներ. Eluted Սպիտակուցներ լուծումներ են dialyzed երկու անգամ դեմ 1000 ծավալների 50 մմ PBS, pH 7.4, 0.3 M NaCl է 4 ° C: Մաքրումը էր վերլուծել է 12% SDS-էջում: Կոնցենտրացիան սպիտակուցային որոշվել է Bradford մեթոդով roti-Քվանտ (Carl Roth GmbH, Կարլսրուէ, Գերմանիա): (Rabausch et al., 2013):

Հանույթ Protein ից E. coli բակտերիաների
Խայծ սպիտակուցը հետաքրքրություն (այս դեպքում, MTV1 Հյուրատետր Arabidopsis thaliana), որը fused է GST պիտակով է եւ արտահայտվում է BL21 Escherichia coli (E. coli) բջիջների.
1. Վերցրեք մեկ գնդիկ է GST-MTV1 եւ GST (համապատասխանում է 50 մլ ԲԱԿՏԵՐԱՅԻՆ մշակույթը) եւ resuspend յուրաքանչյուրը 2.5 մլ սառը արդյունահանման բուֆերի:
2. Օգտագործեք ultrasonicator UP100H (Հագեցած MS3 microtip-sonotrode փոքր ծավալներով (2-5mL)) խանգարել մանրէային բջիջները, մինչեւ որ նրանք lysed, որը նշված է կրճատվել անթափանցիկություն եւ աճել մածուցիկության. Սա պետք է իրականացվի սառույցի, եւ այն խորհուրդ է տրվում sonicate է ընդմիջումներով (օրինակ 10 վրկ sonicating հաջորդում են 10 վրկ վրա սառույցի եւ այլն): Խնամք պետք է ձեռնարկվեն, որպեսզի sonicate հետ չափազանց բարձր ինտենսիվությամբ: Եթե ​​փրփուրը կամ ձեւավորումը սպիտակ նստվածք է հայտնաբերվում, ինտենսիվության պետք է իջեցվել:
3. Փոխանցում lysed բակտերիաների լուծում 1,5 մլ microcentrifuge խողովակների եւ ցենտրիֆուգա է 4 ° C, 16000 x գ 20 րոպե.

Allicin-փոփոխվել Սպիտակուցներ E. coli

Վճռականությունը Sulfhydryl Բովանդակություն կողմից 5,5'-Dithiobis (2-nitrobenzoic թթու) (DTNB) Assay
An E. coli MG1655 գիշերում մշակույթը օգտագործվել ներշնչել mops նվազագույն լրատվամիջոց (1: 100): Մշակույթը մեծացել aerobically մինչեւ A600 0,4 ձեռք բերվել: Մշակույթը էր բաժանվում է երեք 15-մլ մշակույթների համար սթրես բուժման. Չբուժված մշակույթը ծառայում էր որպես բացասական վերահսկողության. 0.79 մմ Allicin (128 մկգ մլ^-1) Կամ 1 մմ diamide ավելացվել է մեկի մնացած երկու մշակույթների յուրաքանչյուր. Մշակույթները էին հիմնադրամի 15 րոպե. 5 մլ յուրաքանչյուր մշակույթի են harvested է centrifugation (8.525 × գ, 4 ° C, 10 րոպե): Բջիջները էին լվանում երկու անգամ, 1 մլ PBS (137 մմ NaCl, 2.7 մմ kcl, 10 մմ Na₂HPO- ն₄2 մմ KH₂PO₄, pH 7.4, պահածոյացված աներոբիկորեն մինչեւ օգտագործումը) եւ ցենտրիֆիկացված (13,000 × գ, 4 ° C, 10 րոպե): Բջիջները վերազինվել էին լիզի բուֆերում (PBS 6 մմ guanidinium HCl, pH 7.4) մինչեւ 4 ° C- ի խափանում, ultrasonication- ով (VialTweeter- ը ultrasonicator, Hielscher GmbH, Գերմանիա) (3 × 1 րոպե): Բջջային բեկորներ էր pelleted է centrifugation (13,000 × գ, 4 ° C, 15 րոպե): The supernatant էր փոխանցվել է 3,5 մլ QS-մակրո cuvette (10 մմ), ինչպես նաեւ մագնիսական ակտիվանալ բար եւ խառնել 1 մլ lysis բուֆերի: Ոչնչացման նմուշների վերահսկվել է 412 նմ հետ jasco V-650 Սպեկտրոֆոտոմետրի հագեցած PSC-718 ջերմաստիճանի վերահսկվող բջջային իրավատիրոջ (jasco) սենյակային ջերմաստիճանում: 100μl է 3 մմ dithiobis (2-nitrobenzoic թթու) լուծման են ավելացվել. Մարելը մոնիտորինգի, մինչեւ որ հասել է հագեցվածությունը: Հաշվարկը thiol համակենտրոնացման էր իրականացվում է օգտագործելով մարում գործակիցը varepsilon -ից₄₁₂ = 13.700 M^-1 սմ^-1 համար տիոեթերներ-2-nitrobenzoic թթու (TNB): Բջջային thiol համակենտրոնացումների հաշվարկվել են մի ծավալի E. coli բջիջների 6.7 × 10^-15 լիտր եւ բջջային խտությունը A₆₀₀ = 0.5 (համարժեք է 1 × 10⁸ բջիջները մլ^-1 մշակույթ): (Müller et al. 2016 թ.):

Ի Vivo Glutathione որոշման

E.coli MG1655 մեծացել է mops նվազագույն միջին մի ընդհանուր ծավալի 200ml քանի դեռ A₆₀₀ հասնելով 0,5-ի: Մշակույթը բաժանվել է 50 միլիոն մշակույթների `սթրեսի բուժման համար: 0.79 մմ ալիքին, 1 մմ դիամիդ կամ դիմետիլ սուլֆոքսիդ (հսկողություն) ունեցող 15 րոպե ինկուբացիայից հետո 4 րոպե 4 րոպեում բջիջները հավաքվեցին 4 րոպեում 10 րոպե: Բջիջները կրկնակի անգամ լվացել էին KPE բուֆերով մինչեւ 700μl KPE բուֆերի կուտակված լուծույթը: Ցնցման համար մինչեւ 10% (w / v) սուլֆոսալալիցիաթթու 300 մլ ավելացվել են բջիջների խանգարումը `ultrasonication- ով (3 x 1 min; VialTweeter- ը ultrasonicator): Supernatants էին հավաքվել հետո centrifugation (30 րոպե, 13,000g, 4 ° C): Sulfosalicylic թթու համակենտրոնացումների են նվազել են 1% -ով: Բացի 3 ծավալների KPE բուֆերի: Չափումներ ընդհանուր glutathione եւ GSSG են կատարվում, ինչպես նկարագրված է վերը: Բջջային Glutathione համակենտրոնացումների հաշվարկվել են մի ծավալի E. coli բջիջները 6.7×10^-15 լիտր եւ բջջային խտությունը A₆₀₀ 0.5 (համարժեք է 1×10⁸ բջիջները մլ^-1 մշակույթ): Gsh համակենտրոնացումների էին հաշվարկվում են հանում 2 [GSSG] ընդհանուր glutathione. (Müller et al. 2016 թ.):

Արտահայտությունը մարդկային mAspAT է E. coli

Սինգլը գաղութը E. coli BL21 (DE3) թաքցնելը արտահայտությունը վեկտորը 30 մլ Luria-Bertani (lb) միջնաժամկետ պարունակում է 100μg / մլ ampicillin, եւ ապա աճեցված է 37ºC մինչեւ օպտիկական խտության (OD₆₀₀) Հասել է 0.6: Խցերը harvested է centrifugation է 4000 × g 10 րոպե, եւ resuspended է 3L թարմ LB միջին պարունակում է 100μg / մլ ampicillin:
Դրանից հետո, սպիտակուցը արտահայտությունը induced հետ 1 մմ իզոպրոպիլ բետա-ᴅ-1-thiogalactopyranoside (IPTG) համար 20 ժ ժամը 16ºC: Խցերը harvested է centrifugation է 8000 × g 15 րոպե եւ լվացվեն հետ բուֆերային A (20 մմ NaH2PO4, 0.5 M NaCl, pH 7.4). Մոտարկվել 45g (խոնավ քաշը) բջիջների ստացվել են 3 L մշակույթին. Այն բանից հետո, centrifugation, որ բջջային կարկուտ էր resuspended է 40 մլ (1 L մշակույթի) ice- սառը արդյունահանման բուֆերային A, եւ lysed կողմից ultrasonication է սառույցի սառը ջերմաստիճանի օգտագործելով UP400St գործիք (Դոկտոր Hielscher GmbH, Գերմանիա): Որ բջջային lysis էր centrifuged է 12,000 rpm 15 րոպե է առանձնացնել լուծվող (supernatant) եւ precipitated (գնդիկային) ֆրակցիաների: (Jiang et al. 2015)

Ստորեւ ներկայացված աղյուսակը ձեզ ցույց է տալիս մեր ultrasonicators- ի մոտավոր մշակման հզորությունը: