E. Coli-ի ուլտրաձայնային լիզիս
- E. coli բակտերիաները մանրէաբանության և կենսատեխնոլոգիայի մեջ ամենատարածված բակտերիաներն են:
- Ուլտրաձայնային բջիջների խանգարիչները ապահովում են հուսալի և վերարտադրվող արդյունքներ E. coli-ի լիզի համար:
- Ինտենսիվ, բայց ճշգրիտ կառավարելի կավիտացիա և կտրող ուժերը հանգեցնում են ամբողջական խզման և բարձր արդյունահանման (օրինակ՝ սպիտակուցներ, ԴՆԹ):
Ինչու՞ է E. coli-ի ուլտրաձայնային բջիջների խանգարումը նախընտրելի մեթոդ:
Ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորները կամ զոնդային տիպի ուլտրաձայնային սարքերն առաջարկում են E. coli lysis-ի մի քանի առավելություններ, քանի որ ինտենսիվ ուլտրաձայնը արդյունավետորեն խախտում է բջջային պատերը և թաղանթները: Զոնդի տիպի ուլտրաձայնային սարքերը լայնորեն օգտագործվում են E. coli lysis- ի համար հետևյալ պատճառներով.
E.coli-ի բջիջներից սպիտակուցի արդյունահանումը արդյունավետորեն իրականացվում է ուլտրաձայնային զոնդ UP200St
Զոնդի տիպի ուլտրաձայնային սարքը բազմաթիվ առավելություններ է տալիս E. coli lysis-ի համար: Ուլտրաձայնային գործընթացի պարամետրերի հուսալի և ճշգրիտ հսկողությունը թույլ է տալիս օպտիմալացնել գործառնական պարամետրերը, ինչպիսիք են հզորությունը, տևողությունը և նմուշի մշակումը ցանկալի արդյունքների հասնելու համար:
E. coli EDL933-ի գենոմային ԴՆԹ-ի էլեկտրաֆորետիկ անալիզներ, որոնք ենթարկվել են 0 – 15 րոպե ուլտրաձայնային: L-ն ցույց է տալիս ԴՆԹ-ի սանդուղքը:
(ուսումնասիրություն և պատկեր՝ ©Basselet et al. 2008)
Բջջային խանգարում ուլտրաձայնային կավիտացիայի միջոցով
Ուլտրաձայնային զոնդի տիպի համասեռացուցիչները գործում են մոտ. 20,000 ցիկլ վայրկյանում (20 կՀց հաճախականությամբ) և առաջացնում են հեղուկների կամ կասեցումների կավիտացիա: Ակուստիկ կավիտացիոն միկրոսկոպիկ տարածքներ՝ վակուումանման ճնշումների և բարձր ջերմաստիճանների, որոնք պատռում են բջիջները: Չնայած ջերմաստիճանը կարող է հասնել մի քանի հազար աստիճանի Ցելսիուսի, կավիտացիայի ծավալներն այնքան փոքր են, որ զգալիորեն չեն տաքացնում գործընթացը: Ուլտրաձայնային առաջացած ակուստիկ կավիտացիան և կտրող ուժերը ծակում կամ կոտրում են բակտերիալ բջիջների բջջային թաղանթը, ինչպիսին է E.coli-ն: Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը թույլ են տալիս ճշգրիտ վերահսկել գործընթացի պարամետրերը, ինչպիսիք են ուլտրաձայնային ինտենսիվությունը, ամպլիտուդը, էներգիայի մուտքագրումը և ջերմաստիճանը: Այսպիսով, ուլտրաձայնային լիզի գործընթացը կարող է օպտիմալ կերպով ճշգրտվել բջջի տեսակին, բջիջների մշակույթին և գործընթացի նպատակին:
- լիզի ճշգրիտ վերահսկում (ինտենսիվություն, ամպլիտուդ, ջերմաստիճան)
- հուսալի, վերարտադրելի արդյունքներ
- օպտիմալ հարմարեցում կոնկրետ նմուշներին
- ջերմաստիճանի վերահսկում
- շատ փոքրից շատ մեծ նմուշների համար (µL-ից լիտր)
- Զուտ մեխանիկական բուժում
- օգտագործողի համար հարմար, անվտանգ շահագործում
- գծային մասշտաբը լաբորատորիայից մինչև արտադրություն
VialTweeter ուլտրաձայնային լիզի համար
Ուլտրաձայնային հոմոգենիզատոր ընդդեմ Լիզիսի այլ տեխնիկայի
Մինչդեռ քիմիական և ֆերմենտային լիզը կարող է խնդրահարույց լինել – քանի որ քիմիական լիզը կարող է փոխել սպիտակուցի կառուցվածքները և առաջացնել մաքրման խնդիրներ, իսկ ֆերմենտային լիզը պահանջում է երկար ինկուբացիոն ժամանակներ և վերարտադրելի չէ – Ուլտրաձայնային խանգարումը բարդ, արագ բջիջների խանգարման մեթոդ է:
Ուլտրաձայնային լիզը հիմնված է միայն մեխանիկական ուժերի վրա: Քիմիական նյութեր չեն ավելացվում, ձայնային ճառագայթումը կոտրում է բջջային պատը կտրող ուժերով: Քիմիական լիզը կարող է փոխել սպիտակուցի կառուցվածքը և առաջացնել մաքրման խնդիրներ: Ֆերմենտային խանգարումը պահանջում է երկար ինկուբացիոն ժամանակներ և չի կարող վերարտադրվել: E.coli բակտերիաների բջիջների ուլտրաձայնային խանգարումը արագ, պարզ, հուսալի և վերարտադրելի է: Այդ իսկ պատճառով Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը օգտագործվում են կենսաբանական և կենսաքիմիական լաբորատորիաներում ամբողջ աշխարհում՝ նմուշների պատրաստման, նախնական վերլուծության, in-vitro դիագոնստիկան և բազմակի վերլուծությունների համար:
Ընդհանուր առաջարկություններ ուլտրաձայնային լիզի համար
Sonication-ը ամենատարածված տեխնիկան է շատ փոքր, միջին և մեծ քանակությամբ բջիջների կասեցման համար – պիկո-լիտրից մինչև 100 լ/ժամ (ուլտրաձայնային հոսքի բջիջի օգտագործմամբ): Բջիջները լիզվում են հեղուկ կտրվածքով և կավիտացիայով: ԴՆԹ-ն կտրվում է նաև ձայնային ախտահանման ժամանակ, ուստի անհրաժեշտ չէ DNase ավելացնել բջիջների կասեցմանը:
Ջերմաստիճանի վերահսկում ուլտրաձայնային E.coli lysis-ի ժամանակ
Նմուշը նախապես հովացնելով և սառույցի վրա ձայնագրման ընթացքում նմուշը պահելով, նմուշի ջերմային քայքայումը կարելի է հեշտությամբ կանխել:
Իդեալում, նմուշները պետք է սառույցով մնան լիզի ընթացքում, բայց նմուշների մեծ մասի համար դա բավարար է, եթե ջերմաստիճանը չբարձրանա կուլտուրայի կամ հյուսվածքի աղբյուրի ջերմաստիճանից: Հետևաբար, խորհուրդ է տրվում կախոցը պահել սառույցի վրա և կատարել մի քանի կարճ ուլտրաձայնային իմպուլսներով 5-10 վրկ և 10-30 վայրկյան դադարներով: Դադարների ընթացքում ջերմությունը կարող է ցրվել՝ ցածր ջերմաստիճանը վերականգնելու համար։ Ավելի մեծ բջիջների նմուշների համար հասանելի են տարբեր հոսքային բջիջների ռեակտորներ՝ սառեցնող բաճկոններով:
Կարդացեք այստեղ մանրամասն խորհուրդներ և առաջարկություններ հաջող ուլտրաձայնային լիզի համար:
E. Coli լիզատների ուլտրաձայնային պատրաստման արձանագրություններ
Հետազոտողները օգտագործում են Hielscher ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորներ E.coli բջիջների խանգարման համար: Ստորև կարող եք գտնել E.coli lysis-ի տարբեր փորձարկված և ապացուցված արձանագրություններ՝ օգտագործելով Hielscher ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորներ E. coli-ի հետ կապված տարբեր ծրագրերի համար:
Բջիջների աճ, խաչաձև կապում և E. coli բջիջների էքստրակտների պատրաստում ուլտրաձայնային օգնությամբ
SeqA-ի և ՌՆԹ-ի պոլիմերազի ChiP-Chip-ի համար E. coli MG1655 կամ MG1655 ΔseqA-ն աճեցվել է 37°C-ում մինչև OD600 թ մոտ 0,15 50 մլ LB-ում (+ 0,2% գլյուկոզա) մինչև 27 մկլ ֆորմալդեհիդ (37%) մեկ մլ միջավայրում ավելացվի (վերջնական կոնցենտրացիան 1%): Խաչաձև կապը կատարվել է դանդաղ թափահարման ժամանակ (100 պտ/րոպե) սենյակային ջերմաստիճանում 20 րոպե, որին հաջորդում է մարման 10 մլ 2,5 Մ գլիցինով (վերջնական կոնցենտրացիան 0,5 Մ): Ջերմային ցնցումների փորձերի համար E. coli MG1655-ն աճեցվել է 65 մլ LB միջավայրում 30°C-ում մինչև OD600 թ մոտ 0.3: Այնուհետև 30 մլ մշակույթը տեղափոխվեց նախապես տաքացված կոլբայի մեջ 43°C-ում, իսկ մնացածը պահվեց 30°C-ում: Խաչաձև կապը և մարումը տեղի է ունեցել վերևում նկարագրվածի պես, բացառությամբ, որ բջիջները պահվել են 30 կամ 43°C ջերմաստիճանում 5 րոպե մինչև սենյակային ջերմաստիճանում հետագա դանդաղ թափահարումը: Բջիջները հավաքվել են ցենտրիֆուգմամբ և երկու անգամ լվանալ սառը TBS-ով (pH7.5): 1 մլ լիզի բուֆերում (10 մՄ Տրիս (pH 8.0), 20% սախարոզա, 50 մՄ NaCl, 10 մՄ EDTA, 10 մգ/մլ լիզոզիմում) և 30 րոպե ինկուբացիայից հետո 37°C-ում ինկուբացիայից հետո, որին հաջորդում է 4 մլ IP-ի ավելացում: բուֆեր, բջիջները սառույցի վրա ձայնագրվել են 12 անգամ 30 վայրկյան և 30 վրկ ընդմիջումներով՝ օգտագործելով Hielscher ուլտրաձայնային պրոցեսոր UP400St 100% հզորության կարգավորմամբ: 10 րոպե 9000 գ-ում ցենտրիֆուգումից հետո 800 մկլ վերին հեղուկի մասնիկները պահվել են -20°C-ում: (Waldminghaus 2010)
Ֆերմենտների գերարտադրություն և մաքրում ուլտրաձայնային զոնդով
Դեկահիստիդին (His10) պիտակավորված սպիտակուցների գերարտադրության համար E. coli BL21 (DE3) փոխակերպվել է pET19b կոնստրուկտներով: Ցենտրիֆուգման միջոցով հավաքվել է մեկ գիշերվա նախակուլտուր, և 1%-ն օգտագործվել է էքսպրեսիոն կուլտուրա պատվաստելու համար: pET19mgtB կրող բջիջները աճեցվեցին 22°C-ում մինչև 600 նմ (OD600) օպտիկական խտությունը 0,7: Մշակույթը տեղափոխվեց 17°C և առաջացվեց 100 μM IPTG-ով: 16 ժամ հետո մշակույթը հավաքվել է ցենտրիֆուգմամբ 7500 × գ 4°C-ում: Բջիջները կրկին կասեցվել են 50 մմ ֆոսֆատով բուֆերացված ֆիզիոլոգիական լուծույթում (PBS) 0,3 Մ NaCl-ով pH 7,4-ով և խաթարվել են ուլտրաձայնային ախտորոշմամբ S2 միկրո ծայրով sonotrode-ով Hielscher ultrasonicator UP200St-ում 0,5 ցիկլով և 75% ամպլիտուդայով:
Դեկահիստիդինով պիտակավորված GtfC-ի գերարտադրությունը առաջացել է 37°C ջերմաստիճանում OD-ում600 թ 0,6-ից 100 մկմ IPTG-ով: Բջիջներն այնուհետև ինկուբացվել են 4 ժամ, հավաքվել և լուծվել, ինչպես վերը նշված է MgtB-ի համար:
Բջջային չմշակված քաղվածքները ցենտրիֆուգվել են 15000 × գ և 4°C ջերմաստիճանում՝ բջիջների բեկորները նստեցնելու համար: Հստակեցված քաղվածքները բեռնվել են 1-մլ HisTrap FF Crude սյուների վրա՝ օգտագործելով ÄKTAprime Plus համակարգ: Ֆերմենտները մաքրվել են ըստ արտադրողի արձանագրության՝ His-tagged սպիտակուցների գրադիենտ էյույացիայի համար: Էլյուտացված սպիտակուցային լուծույթները երկու անգամ դիալիզացվել են 50 մՄ PBS-ի 1000 ծավալի դեմ, pH 7,4, 0,3 Մ NaCl-ով 4°C-ում: Մաքրումը վերլուծվել է 12% SDS-PAGE-ով: Սպիտակուցի կոնցենտրացիան որոշվել է Բրեդֆորդի մեթոդով՝ օգտագործելով Roti-Quant: (Rabausch et al. 2013)
Սպիտակուցի ուլտրաձայնային հեռացում E. coli բակտերիայից
Հետաքրքրվող խայծի սպիտակուցը (այս դեպքում՝ MTV1 Arabidopsis thaliana) միաձուլվում է GST պիտակի հետ և արտահայտվում BL21 Escherichia coli (E. coli) բջիջներում:
- Վերցրեք մեկական գնդիկ GST-MTV1 և GST (համապատասխանում է 50 մլ բակտերիաների կուլտուրաներին) և յուրաքանչյուրը նորից կասեցրեք 2,5 մլ սառույցով արդյունահանման բուֆերի մեջ:
- Օգտագործեք ուլտրաձայնային սարք UP100H (հագեցված է MS3 microtip-sonotrode-ով փոքր ծավալների համար՝ մոտավորապես 2-5 մլ)՝ խանգարելու բակտերիաների բջիջները մինչև դրանք լուծարվեն, ինչը ցույց է տալիս կրճատված անթափանցիկությունը և ավելացված մածուցիկությունը: Սա պետք է իրականացվի սառույցի վրա, և խորհուրդ է տրվում կատարել ինտերվալներով (օրինակ՝ 10 վրկ, որին հաջորդում է 10 վայրկյան դադար սառույցի վրա և այլն): Պետք է զգույշ լինել, որպեսզի շատ բարձր ինտենսիվությամբ չհնչեն: Եթե հայտնաբերվում է փրփուր կամ սպիտակ նստվածքի ձևավորում, անհրաժեշտ է նվազեցնել ինտենսիվությունը:
- Լիզացված բակտերիաների լուծույթը տեղափոխեք 1,5 մլ միկրոցենտրիֆուգային խողովակների մեջ և ցենտրիֆուգեք 4°C ջերմաստիճանում, 16000 xg 20 րոպե:
Զոնդի տիպի ուլտրաձայնիչներ, ինչպիսիք են UP400St օգտագործել ակուստիկ կավիտացիայի աշխատանքի սկզբունքը E.coli-ի արդյունավետ լիզիզի համար:
Արտահայտման վերլուծություն և ռեկոմբինանտ սպիտակուցի մաքրում` օգտագործելով Sonication
E. coli գնդիկը sonicated է Hielscher ultrasonicator UP100H-ով: Այդ նպատակով բջջային գնդիկը նորից կասեցվեց սառեցված լիզի բուֆերի մեջ (50 mM Tris-HCl pH=7.5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) և սառեցրեց սառույցի վրա 10 րոպե: Այնուհետև բջիջների կախոցը հնչյունավորվեց 10 վրկ 10 կարճ պոռթկումներով, որին հաջորդեց 30 վրկ ընդմիջումով սառեցման համար: Ի վերջո, բջջային մնացորդները հեռացվել են ուլտրակենտրոնացման միջոցով 4°C-ում 15 րոպե 14000 պտ/րոպե արագությամբ: rPR էքսպրեսիայի հաստատման համար վերին նյութը գործարկվել է 12% պոլիակրիլամիդ գելի վրա և վերլուծվել SDS-PAGE-ով և Western blotting-ով: rPR-ի մաքրումը կատարվել է Ni2+-NTA խեժի միջոցով (Invitrogen, ԱՄՆ)՝ ըստ արտադրողի ուղեցույցի: Այս փուլում կիրառվել է բնական մաքրման մեթոդը։ Մաքրված սպիտակուցի մաքրությունը գնահատվել է 12% պոլիակրիլամիդ գելի վրա էլեկտրոֆորեզի և հետագա Coomassie կապույտ ներկման միջոցով: Մաքրված սպիտակուցի կոնցենտրացիան չափվել է Micro BCA սպիտակուցի փորձարկման հավաքածուի միջոցով (PIERCE, ԱՄՆ): (Azarnezhad et al. 2016)
Ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորներ E. coli Lysis-ի համար
Hielscher Ultrasonics-ը նախագծում, արտադրում և մատակարարում է բարձր արդյունավետության ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորներ՝ E. coli բակտերիաների և բջիջների այլ տեսակների, հյուսվածքների և կուլտուրաների հուսալի և արդյունավետ լուծարման համար:
Ուլտրաձայնային զոնդերի, ինչպես նաև անուղղակի ձայնային համակարգերի լայն պորտֆելը մեզ թույլ է տալիս առաջարկել ձեզ իդեալական ուլտրաձայնային հյուսվածքների հոմոգենիզատոր ձեր բջիջների խանգարման և արդյունահանման կիրառման համար:
Դիզայն, արտադրություն և խորհրդատվություն – Որակյալ Արտադրված է Գերմանիայում
Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը հայտնի են իրենց բարձր որակի և դիզայնի չափանիշներով: Խելացի ծրագրակազմը, ինտուիտիվ ընտրացանկը, ծրագրավորվող կարգավորումները և տվյալների ավտոմատ արձանագրումը Hielscher ուլտրաձայնային սարքերի միայն մի քանի առանձնահատկություններ են: Հզորությունը և հեշտ շահագործումը թույլ են տալիս մեր ուլտրաձայնային սարքերի սահուն ինտեգրումը հետազոտական և կենսատեխնոլոգիական հաստատություններում: Նույնիսկ կոպիտ պայմանները և պահանջկոտ միջավայրերը հեշտությամբ կառավարվում են Hielscher ուլտրաձայնային սարքերի կողմից:
Hielscher Ultrasonics-ը ISO սերտիֆիկացված ընկերություն է և հատուկ շեշտադրում է կատարում բարձր արդյունավետության ուլտրաձայնային սարքերի վրա, որոնք բնութագրվում են ժամանակակից տեխնոլոգիաներով և օգտագործողների համար հարմարավետությամբ: Իհարկե, Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը համապատասխանում են ԵԽ-ին և համապատասխանում են UL, CSA և RoH-ների պահանջներին:
Ստորև բերված աղյուսակը ցույց է տալիս մեր ուլտրաձայնային սարքերի մոտավոր մշակման հզորությունը.
| Խմբաքանակի ծավալը | Հոսքի արագություն | Առաջարկվող սարքեր |
|---|---|---|
| բազմաբնակարան հորատանցք / միկրոտիտրային թիթեղներ | ԱԺ | UIP400MTP |
| CupHorn սրվակների կամ բաժակի համար | ԱԺ | Ուլտրաձայնային CupHorn |
| ուլտրաձայնային միկրո հոսքի ռեակտոր | ԱԺ | GDmini2 |
| մինչև 10 սրվակ 0,5-ից 1,5 մլ պարունակությամբ | ԱԺ | VialTweeter |
| 0.5-ից 1.5մլ | ԱԺ | VialTweeter |
| 1-ից 500 մլ | 10-ից 200 մլ / րոպե | UP100H |
| 10-ից 2000 մլ | 20-ից 400 մլ / րոպե | UP200Ht, UP400 Փ |
| 0.1-ից 20լ | 0.2-ից 4լ/րոպե | UIP2000hdT |
| 10-ից 100 լ | 2-ից 10 լ / րոպե | UIP4000 |
| ԱԺ | 10-ից 100 լ / րոպե | UIP16000 |
| ԱԺ | ավելի մեծ | կլաստերի UIP16000 |
Կապ մեզ հետ: / Հարցրեք մեզ:
Լրացուցիչ արձանագրություններ ուլտրաձայնային E. coli Lysis-ի համար
Ալիցինով ձևափոխված սպիտակուցներ E. coli-ում, օգտագործելով Ultrasonic VialTweeter
Սուլֆհիդրիլի պարունակության որոշումը 5,5'-դիթիոբիս(2-նիտրոբենզոյաթթու) (DTNB) վերլուծությամբ
E. coli MG1655 մեկ գիշերվա կուլտուրան օգտագործվել է MOPS նվազագույն միջավայրը պատվաստելու համար (1:100): Մշակույթը աճեցվում էր աերոբիկ եղանակով մինչև A600-ի ստացումը 0.4: Սթրեսի բուժման համար մշակույթը բաժանվել է երեք 15 մլ մշակույթների: Չբուժված մշակույթը ծառայեց որպես բացասական հսկողություն: Մնացած երկու մշակույթներից մեկին ավելացվել է 0,79 մՄ ալիցին (128 մկգ մլ-1) կամ 1 մՄ դիամիդ: Մշակույթները ինկուբացվել են 15 րոպե: Յուրաքանչյուր մշակույթից 5 մլ հավաքվել է ցենտրիֆուգմամբ (8525 × գ, 4°C, 10 րոպե): Բջիջները երկու անգամ լվացվել են 1 մլ PBS-ով (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4, օգտագործելուց առաջ պահվել են անաէրոբ եղանակով) և ցենտրիֆուգվել (13000 × g, 4°C, 10 րոպե): Բջիջները կրկին կասեցվել են լիզի բուֆերի մեջ (PBS 6 մՄ գուանիդինիումի HCl, pH 7.4) նախքան 4°C-ում ուլտրաձայնային եղանակով խափանումը (VialTweeter ուլտրաձայնային սարք, Hielscher GmbH, Գերմանիա) (3 × 1 րոպե): Բջջային բեկորները գնդիկավորվել են ցենտրիֆուգմամբ (13000 × գ, 4 °C, 15 րոպե): Վերևը տեղափոխվեց 3,5 մլ QS-մակրո կուվետ (10 մմ) մագնիսական խառնիչով և խառնվեց 1 մլ լիզի բուֆերի հետ: Նմուշների մարումը մշտադիտարկվել է 412 նմ-ով Jasco V-650 սպեկտրոֆոտոմետրով, որը հագեցած է PSC-718 ջերմաստիճանով կառավարվող բջիջների պահարանով սենյակային ջերմաստիճանում: Ավելացվել է 100 մկլ 3 մՄ դիթիոբիս(2-նիտրոբենզոյաթթու) լուծույթ: Անհետացմանը վերահսկվում էր մինչև այն հասավ հագեցվածության: Թիոլի կոնցենտրացիայի հաշվարկը կատարվել է մարման գործակից ϵ412 = 13700 Մ-1 սմ-1 թիո-2-նիտրոբենզոյաթթվի համար (TNB): Բջջային թիոլի կոնցենտրացիան հաշվարկվել է E. coli բջիջների 6,7 × 10 ծավալի հիման վրա-15 լիտր և բջիջների խտությունը A600 = 0,5 (համարժեք է 1 × 10-ի8 բջիջները մլ-1 մշակույթ): (Müller et al. 2016)
In Vivo գլուտատիոնի որոշում՝ օգտագործելով ուլտրաձայնային բջիջների ջարդիչ
E.coli MG1655-ն աճեցվել է MOPS նվազագույն միջավայրում 200 մլ ընդհանուր ծավալով մինչև A600 0,5-ի ստացումը: Սթրեսի բուժման համար մշակույթը բաժանվել է 50 մլ մշակույթների: 15 րոպե ինկուբացիայից հետո 0,79 մՄ ալիցինով, 1 մՄ դիամիդով կամ դիմեթիլ սուլֆօքսիդով (հսկիչ), բջիջները հավաքվել են 4000 գ 4°C-ում 10 րոպե: Բջիջները երկու անգամ լվացվել են KPE բուֆերով՝ նախքան կարկուտները 700 մկլ KPE բուֆերի մեջ լուծարելը: Ապապրոտեինացման համար ավելացվել է 300լ 10% (w/v) սուլֆոսալիսիլիկ թթու մինչև բջիջների խախտումը ուլտրաձայնային եղանակով (3 x 1 րոպե; VialTweeter ուլտրաձայնային սարք): Սուպերնատենտները հավաքվել են ցենտրիֆուգումից հետո (30 րոպե, 13000գ, 4°C): Սուլֆոսալիցիլաթթվի կոնցենտրացիաները նվազել են մինչև 1%՝ 3 ծավալով KPE բուֆերի ավելացումով: Ընդհանուր գլուտատիոնի և GSSG-ի չափումները կատարվել են ինչպես նկարագրված է վերևում: Բջջային գլուտատիոնի կոնցենտրացիան հաշվարկվել է E. coli բջիջների 6,7 ծավալի հիման վրա:×10-15 լիտր և բջիջների խտությունը A600 0,5 (համարժեք 1×108 բջիջները մլ-1 մշակույթ): GSH-ի կոնցենտրացիաները հաշվարկվել են ընդհանուր գլուտատիոնից 2[GSSG] հանելով: (Müller et al. 2016)
Մարդու mAspAT-ի արտահայտությունը E. coli-ում՝ օգտագործելով ուլտրաձայնային հոմոգենիզատոր
E. coli BL21 (DE3) մեկ գաղութը, որը պարունակում է արտահայտման վեկտոր 30 մլ Luria-Bertani (LB) միջավայրում, որը պարունակում է 100 μg/mL ամպիցիլին, և այնուհետև մշակվում է 37ºC ջերմաստիճանում մինչև օպտիկական խտությունը (OD):600 թ) հասել է 0,6-ի։ Բջիջները հավաքվել են ցենտրիֆուգման միջոցով 4000 × գ 10 րոպեի ընթացքում և նորից կասեցվել 100 մկգ/մլ ամպիցիլին պարունակող 3 լ թարմ LB միջավայրում:
Այնուհետև, սպիտակուցի արտահայտումն առաջացել է 1 մՄ իզոպրոպիլ β-ᴅ-1-թիոգալակտոպիրանոզիդով (IPTG) 20 ժամ 16ºC-ում: Բջիջները հավաքվել են ցենտրիֆուգմամբ 8000 × գ 15 րոպեի ընթացքում և լվանալ բուֆեր A-ով (20 մՄ NaH2PO4, 0,5 Մ NaCl, pH 7,4): Մոտավորապես 45 գ (թաց քաշով) բջիջներ են ստացվել 3 լ կուլտուրայից: Ցենտրիֆուգումից հետո բջջային գնդիկները կրկին կասեցվել են 40 մլ (1 լ կուլտուրայի համար) սառույցով արդյունահանման բուֆեր A-ում և լուծվել ուլտրաձայնային եղանակով սառցե ջերմաստիճանում՝ օգտագործելով Hielscher ուլտրաձայնային բջիջների ջարդիչը UP400St: Բջջային լիզը ցենտրիֆուգվել է 12000 պտ/րոպում 15 րոպե՝ լուծելի (վերածանց) և նստեցված (գնդիկավոր) ֆրակցիաները առանձնացնելու համար: (Jiang et al. 2015)
Փաստեր, որոնք արժե իմանալ
E.coli
Escherichia coli (E. coli) գրամ-բացասական, ֆակուլտատիվ անաէրոբ, ձողաձև կոլիֆորմ բակտերիա է Escherichia սեռից, որը սովորաբար հանդիպում է տաքարյուն օրգանիզմների ստորին աղիքներում (էնդոթերմ): Կան մեծ թվով E. coli շտամներ (կամ ենթատեսակներ)՝ տարբեր բնութագրերով: E. coli շտամների մեծ մասը անվնաս են մարդկանց համար, օրինակ՝ B և K-12 շտամները, որոնք սովորաբար օգտագործվում են լաբորատորիաներում հետազոտական կիրառման համար: Այնուամենայնիվ, որոշ շտամներ վնասակար են և կարող են լուրջ հիվանդություններ առաջացնել:
E. coli-ն կարևոր դեր է խաղում ժամանակակից կենսաբանական ճարտարագիտության և արդյունաբերական մանրէաբանության մեջ, քանի որ բակտերիաները հեշտ է շահարկել: Ընդհանուր լաբորատոր կիրառություններ, որոնք հաճախ ենթադրում են E. coli-ի օգտագործում, օրինակ՝ ռեկոմբինանտ դեզօքսիռիբոնուկլեինաթթու (ԴՆԹ) ստեղծելու կամ որպես օրինակելի օրգանիզմի դեր:
E. coli-ն շատ բազմակողմանի հյուրընկալող է հետերոլոգ սպիտակուցների արտադրության համար, և առկա են բազմակի սպիտակուցային արտահայտման համակարգեր E. coli-ում ռեկոմբինանտ սպիտակուցներ արտադրելու համար: Օգտագործելով պլազմիդներ, որոնք թույլ են տալիս սպիտակուցի բարձր մակարդակի արտահայտում, գեները կարող են ներմուծվել բակտերիաների մեջ, ինչը թույլ է տալիս արտադրել այդպիսի սպիտակուցներ մեծ քանակությամբ արդյունաբերական խմորման գործընթացներում:
E.coli-ն օգտագործվում է որպես բջջային գործարաններ ինսուլին արտադրելու համար: Հետագա կիրառությունները ներառում են մոդիֆիկացված E. coli բջիջների օգտագործումը պատվաստանյութեր և անշարժացված ֆերմենտներ մշակելու և արտադրելու, կենսավառելիքներ արտադրելու, ինչպես նաև կենսավերականգնման համար:
K-12 շտամը E. coli-ի մուտանտ ձևն է, որը գերարտահայտում է ալկալային ֆոսֆատազ (ALP) ֆերմենտը: Այս մուտացիան տեղի է ունենում գենի թերության պատճառով, որն անընդհատ կոդավորում է ֆերմենտը: Եթե գենը արտադրում է արտադրանք առանց որևէ արգելքի, դա հայտնի է որպես ստեղծող ակտիվություն: Այս հատուկ մուտանտի ձևն օգտագործվում է ALP ֆերմենտի մեկուսացման և մաքրման համար:
E. coli բակտերիաները նույնպես լայնորեն օգտագործվում են որպես բջջային գործարաններ: Ինժեներական մանրէները (օրինակ՝ բակտերիաները) և բույսերի բջիջները կարող են օգտագործվել որպես այսպես կոչված բջջային գործարաններ: Այս գենետիկորեն ձևափոխված բջիջները արտադրում են մոլեկուլներ, քիմիական նյութեր, պոլիմերներ, սպիտակուցներ և այլ նյութեր, որոնք օգտագործվում են, օրինակ, դեղագործության, սննդի և քիմիական արդյունաբերության մեջ: Նման բիոինժեներական բջիջների ինտերիերում արտադրված մոլեկուլները ազատելու համար ուլտրաձայնային լիզը բջիջների պատերը խաթարելու և թիրախային նյութերը շրջապատող հեղուկ տեղափոխելու սովորական մեթոդ է: Կարդացեք ավելին բիոինժեներական բջիջների լիզիսի մասին:
ԴՆԹ-ի ուլտրաձայնային կտրում
Ուլտրաձայնային կտրող ուժերը մոլեկուլների, օրգանելների և սպիտակուցների բջջի ներսից ազատելու, ինչպես նաև ԴՆԹ-ի շղթաները մասերի բաժանելու սովորաբար օգտագործվող մեթոդ են: Ակուստիկ կավիտացիան կոտրում է բջիջների պատերը և թաղանթները՝ բջիջներից ԴՆԹ-ն հանելու և մոտ 600 բեկորներ առաջացնելու համար։ – 800 bp երկարությամբ, որն իդեալական է վերլուծության համար:
Կտտացրեք այստեղ՝ ԴՆԹ-ի մասնատման ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորների մասին ավելին իմանալու համար:
Գրականություն / Հղումներ
- Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
- Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
- Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
- Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
- Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
- Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.
Hielscher Ultrasonics-ը արտադրում է բարձր արդյունավետության ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորներ լաբորատորիա դեպի արդյունաբերական չափս.