E. Coli բակտերիաների ուլտրաձայնային լիզիս
- E. coli բակտերիաները մանրէաբանության և կենսատեխնոլոգիայի մեջ ամենից հաճախ օգտագործվող բակտերիաներն են։
- Ուլտրաձայնային բջջաքայքայիչները ապահովում են հուսալի և վերարտադրելի արդյունքներ E. coli բակտերիաների լիզիսի համար։
- Ինտենսիվ, սակայն ճշգրիտ կառավարելի կավիտացիան և սահքային ուժերը հանգեցնում են ամբողջական քայքայման և արդյունահանման բարձր ելքերի (օրինակ՝ սպիտակուցների, DNA)։
Ինչո՞ւ է E. coli բջիջների ուլտրաձայնային քայքայումը նախընտրելի մեթոդը։
Ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորները կամ զոնդային տիպի ուլտրաձայնային սարքերը մի շարք առավելություններ են առաջարկում E. coli բակտերիաների լիզիսի համար, քանի որ ինտենսիվ ուլտրաձայնը արդյունավետորեն քայքայում է բջջապատերն ու թաղանթները։ Զոնդային տիպի ուլտրաձայնային սարքերը լայնորեն օգտագործվում են E. coli բակտերիաների լիզիսի համար հետևյալ պատճառներով․
E.coli բջիջներից սպիտակուցների արդյունահանումն արդյունավետորեն կատարվում է՝ օգտագործելով UP200St ուլտրաձայնային զոնդը
Զոնդային տիպի ուլտրաձայնային սարքը բազմաթիվ առավելություններ է առաջարկում E. coli բակտերիաների լիզիսի համար։ Ուլտրաձայնային գործընթացի պարամետրերի հուսալի և ճշգրիտ կառավարումը թույլ է տալիս օպտիմալացնել աշխատանքային պարամետրերը, ինչպիսիք են հզորությունը, տևողությունը և նմուշի հետ աշխատանքը՝ ցանկալի արդյունքներին հասնելու համար։
0 – 15 min ուլտրաձայնային մշակման ենթարկված E. coli EDL933 բակտերիաների գենոմային DNA-ի էլեկտրոֆորետիկ վերլուծություններ։ L տառը ցույց է տալիս DNA-ի չափային մարկերը։
(հետազոտություն և պատկեր՝ ©Basselet et al. 2008)
Բջիջների քայքայում ուլտրաձայնային կավիտացիայի միջոցով
Զոնդային տիպի ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորներն աշխատում են վայրկյանում մոտ 20 000 ցիկլով (20kHz հաճախականությամբ) և հեղուկներում կամ կախույթներում առաջացնում են կավիտացիա։ Ակուստիկ կավիտացիան առաջացնում է վակուումանման ճնշումներով և բարձր ջերմաստիճաններով մանրադիտակային տիրույթներ, որոնք քայքայում են բջիջները։ Թեև ջերմաստիճանները կարող են հասնել մի քանի հազար աստիճան Ցելսիուսի, կավիտացիոն ծավալներն այնքան փոքր են, որ գործընթացի ընթացքում զգալի տաքացում չեն առաջացնում։ Ուլտրաձայնով առաջացած ակուստիկ կավիտացիան և սահքի ուժերը ծակոտկենացնում կամ քայքայում են բակտերիաների, օրինակ՝ E.coli բակտերիաների բջջաթաղանթը։ Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը թույլ են տալիս ճշգրիտ վերահսկել գործընթացի այնպիսի պարամետրեր, ինչպիսիք են ուլտրաձայնի ինտենսիվությունը, ամպլիտուդը, ներմուծվող էներգիան և ջերմաստիճանը։ Այդպիսով, ուլտրաձայնային լիզիսի գործընթացը կարելի է օպտիմալ կերպով հարմարեցնել բջջի տեսակին, բջջային կուլտուրային և գործընթացի նպատակին։
- լիզիսի ճշգրիտ վերահսկում (ինտենսիվություն, ամպլիտուդ, ջերմաստիճան)
- հուսալի, վերարտադրելի արդյունքներ
- օպտիմալ հարմարեցում կոնկրետ նմուշներին
- ջերմաստիճանի վերահսկում
- շատ փոքրից մինչև շատ մեծ նմուշների համար (µL-ից մինչև լիտրեր)
- զուտ մեխանիկական մշակում
- օգտագործման հարմարավետություն և անվտանգ շահագործում
- մասշտաբի գծային մեծացում՝ լաբորատորիայից մինչև արտադրություն
VialTweeter ուլտրաձայնային լիզիսի համար
Ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորի համեմատությունը լիզիսի այլ մեթոդների հետ
Թեև քիմիական և ֆերմենտային լիզիսը կարող է խնդրահարույց լինել – քանի որ քիմիական լիզիսը կարող է փոփոխել սպիտակուցների կառուցվածքները և մաքրման խնդիրներ առաջացնել, իսկ ֆերմենտային լիզիսը պահանջում է երկարատև ինկուբացիա և վերարտադրելի չէ – ուլտրաձայնային քայքայումը բջիջների քայքայման տեխնոլոգիապես առաջադեմ, արագ մեթոդ է։
Ուլտրաձայնային լիզիսը հիմնված է միայն մեխանիկական ուժերի վրա։ Քիմիական նյութեր չեն ավելացվում. ուլտրաձայնային մշակումը քայքայում է բջջապատը սահքի ուժերի միջոցով։ Քիմիական լիզիսը կարող է փոփոխել սպիտակուցի կառուցվածքը և մաքրման խնդիրներ առաջացնել։ Ֆերմենտային քայքայումը պահանջում է երկարատև ինկուբացիա և վերարտադրելի չէ։ E.coli բակտերիաների բջիջների ուլտրաձայնային քայքայումն արագ է, պարզ, հուսալի և վերարտադրելի։ Այդ պատճառով Hielscher ուլտրաձայնային սարքերն ամբողջ աշխարհում օգտագործվում են կենսաբանական և կենսաքիմիական լաբորատորիաներում՝ նմուշների նախապատրաստման, նախավերլուծական աշխատանքների, փորձանոթային ախտորոշման և բազմատեսակ փորձաքննությունների համար։
Ուլտրաձայնային լիզիսի ընդհանուր առաջարկություններ
Ուլտրաձայնային մշակումը բջջային կախույթների շատ փոքր, միջին և մեծ քանակությունների լիզիսի ամենատարածված մեթոդն է՝ պիկոլիտրերից մինչև 100L/hr (ուլտրաձայնային հոսքային խցիկի կիրառմամբ)։ Բջիջները լիզիսի են ենթարկվում հեղուկի սահքի և կավիտացիայի միջոցով։ Ուլտրաձայնային մշակման ընթացքում ԴՆԹ-ն նույնպես ենթարկվում է սահքային տրոհման, ուստի բջջային կախույթին DNase ավելացնելու անհրաժեշտություն չկա։
Ջերմաստիճանի վերահսկումը E.coli բակտերիաների ուլտրաձայնային լիզիսի ընթացքում
Նմուշը նախապես սառեցնելով և ուլտրաձայնային մշակման ընթացքում սառույցի վրա պահելով՝ կարելի է հեշտությամբ կանխել նմուշի ջերմային քայքայումը։
Իդեալական դեպքում լիզիսի ընթացքում նմուշները պետք է պահել սառցային սառնության պայմաններում, սակայն նմուշների մեծ մասի համար բավարար է, որ ջերմաստիճանը չգերազանցի կուլտուրայի կամ հյուսվածքի աղբյուրի ջերմաստիճանը։ Ուստի խորհուրդ է տրվում կախույթը պահել սառույցի վրա և մշակել ուլտրաձայնով՝ կիրառելով 5–10 sec տևողությամբ մի քանի կարճ ուլտրաձայնային իմպուլսներ և 10–30 sec դադարներ։ Դադարների ընթացքում ջերմությունը կարող է ցրվել՝ վերականգնելով ցածր ջերմաստիճանը։ Ավելի մեծ բջջային նմուշների համար հասանելի են սառեցման պատյաններով տարբեր հոսքային ռեակտորներ։
Այստեղ կարդացեք մանրամասն խորհուրդներ և առաջարկություններ՝ հաջող ուլտրաձայնային լիզիսի համար։
E. Coli լիզատների ուլտրաձայնային պատրաստման արձանագրություններ
Հետազոտողները E.coli բջիջների քայքայման համար օգտագործում են Hielscher ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորներ։ Ստորև կարող եք գտնել E.coli լիզիսի տարբեր փորձարկված և ապացուցված արձանագրություններ՝ Hielscher ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորների կիրառմամբ, E. coli բակտերիաների հետ կապված տարբեր կիրառությունների համար։
Բջիջների աճեցում, խաչաձև կապակցում և E. coli բջջային մզվածքների պատրաստում՝ ուլտրաձայնի կիրառմամբ
SeqA-ի և ՌՆԹ պոլիմերազի ChIP-Chip վերլուծության համար E. coli MG1655 կամ MG1655 ΔseqA բակտերիաներն աճեցվել են 37°C ջերմաստիճանում՝ մինչև OD600 մոտ 0,15 արժեքի հասնելը՝ 50 ml LB միջավայրում (+ 0,2% գլյուկոզ), որից հետո միջավայրի յուրաքանչյուր ml ծավալին ավելացվել է 27 μl ֆորմալդեհիդ (37%) (վերջնական կոնցենտրացիան՝ 1%)։ Խաչաձև կապակցումն իրականացվել է դանդաղ թափահարմամբ (100 rpm), սենյակային ջերմաստիճանում, 20 min տևողությամբ, որից հետո ռեակցիան դադարեցվել է՝ ավելացնելով 10 ml 2,5 M գլիցին (վերջնական կոնցենտրացիան՝ 0,5 M)։ Ջերմային շոկի փորձերի համար E. coli MG1655 բակտերիաներն աճեցվել են 65 ml LB միջավայրում՝ 30°C ջերմաստիճանում, մինչև OD600 մոտ 0,3 արժեքի հասնելը։ Այնուհետև կուլտուրայի 30 ml ծավալը տեղափոխվել է նախապես մինչև 43°C տաքացված կոլբայի մեջ, իսկ մնացած մասը պահվել է 30°C ջերմաստիճանում։ Խաչաձև կապակցումն ու ռեակցիայի դադարեցումն իրականացվել են վերը նկարագրված ձևով՝ այն տարբերությամբ, որ բջիջները 5 min պահվել են 30 կամ 43°C ջերմաստիճանում՝ նախքան սենյակային ջերմաստիճանում հետագա դանդաղ թափահարումը։ Բջիջները հավաքվել են ցենտրիֆուգմամբ և երկու անգամ լվացվել սառը TBS լուծույթով (pH7.5)։ 1 ml լիզիսի բուֆերում (10 mM Tris (pH 8,0), 20% սախարոզ, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml լիզոցիմ) կրկին սուսպենդացնելուց և 37°C ջերմաստիճանում 30 min ինկուբացնելուց, այնուհետև 4 ml IP բուֆեր ավելացնելուց հետո բջիջները սառույցի վրա ենթարկվել են ուլտրաձայնային մշակման՝ 12 անգամ, յուրաքանչյուր անգամ 30 sec տևողությամբ և 30 sec ընդմիջումներով՝ օգտագործելով Hielscher ուլտրաձայնային պրոցեսոր UP400St սարքը՝ հզորության 100% կարգավորմամբ։ 9000 g պայմաններում 10 min ցենտրիֆուգելուց հետո վերնստվածքային հեղուկի 800 μl բաժնեմասերը պահվել են -20°C ջերմաստիճանում։ (Waldminghaus 2010)
Ֆերմենտների գերարտադրություն և մաքրում ուլտրաձայնային զոնդով
Դեկահիստիդինային (His10) պիտակով սպիտակուցների գերարտադրության համար E. coli BL21(DE3) բակտերիաները տրանսֆորմացվել են pET19b կոնստրուկցիաներով։ Գիշերվա ընթացքում աճեցված նախակուլտուրան հավաքվել է ցենտրիֆուգմամբ, և դրա 1% բաժինն օգտագործվել է էքսպրեսիոն կուլտուրան պատվաստելու համար։ pET19mgtB կրող բջիջներն աճեցվել են 22°C ջերմաստիճանում, մինչև 600 nm ալիքի երկարության դեպքում օպտիկական խտությունը (OD600) հասել է 0,7 արժեքի։ Կուլտուրան տեղափոխվել է 17°C ջերմաստիճանային պայմաններ, և ինդուկցիան իրականացվել է 100 μM IPTG միջոցով։ 16 h անց կուլտուրան հավաքվել է ցենտրիֆուգմամբ՝ 7 500 × g պայմաններում և 4°C ջերմաստիճանում։ Բջիջները կրկին սուսպենդացվել են 0,3 M NaCl պարունակող 50 mM ֆոսֆատային բուֆերացված աղային լուծույթում (PBS)՝ pH 7,4 պայմաններում, և քայքայվել ուլտրաձայնային մշակմամբ՝ օգտագործելով Hielscher ուլտրաձայնային սարք UP200St և S2 միկրոծայրով սոնոտրոդ՝ 0,5 ցիկլի և 75% ամպլիտուդի կարգավորումներով։
Դեկահիստիդինային պիտակով GtfC սպիտակուցի գերարտադրությունն ինդուկցվել է 37°C ջերմաստիճանում՝ OD600 0,6 արժեքի պայմաններում, 100 μM IPTG միջոցով։ Այնուհետև բջիջներն ինկուբացվել են 4 h, հավաքվել և ենթարկվել լիզիսի՝ ինչպես վերը նկարագրված է MgtB սպիտակուցի համար։
Չմաքրված բջջային էքստրակտները ցենտրիֆուգվել են 15 000 × g պայմաններում և 4°C ջերմաստիճանում՝ բջջային բեկորները նստեցնելու համար։ Պարզեցված էքստրակտները ներմուծվել են 1-ml HisTrap FF Crude աշտարակների մեջ՝ օգտագործելով ÄKTAprime Plus համակարգը։ Ֆերմենտները մաքրվել են ըստ արտադրողի արձանագրության՝ His պիտակով սպիտակուցների գրադիենտային էլյուցիայի համար։ Էլյուցված սպիտակուցային լուծույթները երկու անգամ դիալիզվել են 0,3 M NaCl պարունակող 50 mM PBS լուծույթի 1 000 ծավալի դիմաց՝ pH 7,4 պայմաններում և 4°C ջերմաստիճանում։ Մաքրումը վերլուծվել է 12% SDS-PAGE մեթոդով։ Սպիտակուցի կոնցենտրացիան որոշվել է Բրեդֆորդի մեթոդով՝ օգտագործելով Roti-Quant։ (Rabausch et al. 2013)
Սպիտակուցի ուլտրաձայնային էքստրակցիա E. coli բակտերիաներից
Հետաքրքրություն ներկայացնող խայծ-սպիտակուցը (այս դեպքում՝ Arabidopsis thaliana բույսի MTV1 սպիտակուցը) միաձուլվում է GST պիտակին և էքսպրեսիայի ենթարկվում BL21 Escherichia coli (E. coli) բջիջներում։
- Վերցրեք GST-MTV1 և GST պարունակող մեկական նստվածք (50 ml բակտերիալ կուլտուրային համապատասխանող) և յուրաքանչյուրը կրկին սուսպենդացրեք սառույցի ջերմաստիճանի հասցված 2,5 mL էքստրակցիոն բուֆերում։
- Օգտագործեք UP100H ուլտրաձայնային սարք (համալրված MS3 միկրոծայրով սոնոտրոդով՝ մոտ 2–5mL փոքր ծավալների համար)՝ բակտերիալ բջիջները քայքայելու համար, մինչև դրանք ենթարկվեն լիզիսի, ինչի մասին վկայում են պղտորության նվազումը և մածուցիկության աճը։ Սա պետք է իրականացվի սառույցի վրա, և խորհուրդ է տրվում ուլտրաձայնային մշակումն իրականացնել ընդմիջումներով (օրինակ՝ 10 sec ուլտրաձայնային մշակում, որին հաջորդում է 10 sec դադար սառույցի վրա, և այդպես շարունակ)։ Պետք է զգուշանալ չափազանց բարձր ինտենսիվությամբ ուլտրաձայնային մշակումից։ Փրփրագոյացում կամ սպիտակ նստվածքի առաջացում հայտնաբերելու դեպքում ինտենսիվությունը պետք է նվազեցնել։
- Լիզիսի ենթարկված բակտերիաների լուծույթը տեղափոխեք 1,5 mL միկրոցենտրիֆուգային փորձանոթների մեջ և ցենտրիֆուգեք 4°C ջերմաստիճանում՝ 16 000 x g պայմաններում, 20 min տևողությամբ։
Զոնդային տիպի ուլտրաձայնային սարքերը, օրինակ՝ UP400St սարքը, կիրառում են ակուստիկ կավիտացիայի աշխատանքի սկզբունքը՝ E.coli բակտերիաների արդյունավետ լիզիսի համար։
Էքսպրեսիայի վերլուծություն և ռեկոմբինանտ սպիտակուցի մաքրում ուլտրաձայնային մշակմամբ
E. coli-ի բջջային նստվածքը ենթարկվել է ուլտրաձայնային մշակման Hielscher UP100H ուլտրաձայնային սարքով։ Այդ նպատակով բջջային նստվածքը կրկին կախույթացվել է սառեցված լիզիսի բուֆերում (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) և սառեցվել սառույցի վրա՝ 10 min։ Այնուհետև բջջային կախույթը մշակվել է ուլտրաձայնի 10 կարճ՝ յուրաքանչյուրը 10 s տևողությամբ իմպուլսներով՝ սառեցման համար հաջորդող 30 s ընդմիջումներով։ Վերջում բջջային մնացորդները հեռացվել են ուլտրացենտրիֆուգմամբ՝ 4°C ջերմաստիճանում, 15 min տևողությամբ, 14 000 rpm արագությամբ։ rPR-ի էքսպրեսիան հաստատելու համար վերնստվածքային հեղուկը անցկացվել է 12% պոլիակրիլամիդային գելով և վերլուծվել SDS-PAGE ու վեստեռն բլոթինգի միջոցով։ rPR-ի մաքրումն իրականացվել է Ni2+-NTA խեժով (Invitrogen, ԱՄՆ)՝ արտադրողի ուղեցույցի համաձայն։ Այս փուլում կիրառվել է նատիվ մաքրման մեթոդը։ Մաքրված սպիտակուցի մաքրությունը գնահատվել է 12% պոլիակրիլամիդային գելով էլեկտրոֆորեզի և դրան հաջորդող Կումասիի կապույտով ներկման միջոցով։ Մաքրված սպիտակուցի կոնցենտրացիան չափվել է Micro BCA սպիտակուցի որոշման հավաքածուով (PIERCE, ԱՄՆ)։ (Azarnezhad et al. 2016)
Ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորներ՝ E. coli-ի լիզիսի համար
Hielscher Ultrasonics ընկերությունը նախագծում, արտադրում և մատակարարում է բարձր արդյունավետությամբ ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորներ՝ E. coli բակտերիաների և այլ տեսակի բջիջների, հյուսվածքների ու բջջային կուլտուրաների հուսալի և արդյունավետ լիզիսի համար։
Ուլտրաձայնային զոնդերի, ինչպես նաև անուղղակի ուլտրաձայնային մշակման համակարգերի լայն տեսականին մեզ թույլ է տալիս ձեզ առաջարկել հյուսվածքների իդեալական ուլտրաձայնային հոմոգենիզատոր՝ բջիջների քայքայման և էքստրակցիայի ձեր կիրառության համար։
Նախագծում, արտադրություն և խորհրդատվություն – Գերմանիայում ստեղծված որակ
Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը հայտնի են որակի և նախագծման իրենց ամենաբարձր չափանիշներով։ Խելացի ծրագրաշարը, ինտուիտիվ ընտրացանկը, ծրագրավորվող կարգավորումները և տվյալների ավտոմատ գրանցումը Hielscher ուլտրաձայնային սարքերի հնարավորություններից ընդամենը մի քանիսն են։ Ամրությունն ու շահագործման պարզությունը թույլ են տալիս մեր ուլտրաձայնային սարքերն անխափան ինտեգրել հետազոտական և կենսատեխնոլոգիական հաստատություններում։ Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը հեշտությամբ աշխատում են նույնիսկ ծանր պայմաններում և խիստ պահանջներ ներկայացնող միջավայրերում։
Hielscher Ultrasonics ընկերությունն ունի ISO հավաստագրում և հատուկ ուշադրություն է դարձնում բարձր արդյունավետությամբ ուլտրաձայնային սարքերին, որոնք առանձնանում են գերժամանակակից տեխնոլոգիայով և օգտագործման հարմարավետությամբ։ Իհարկե, Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը համապատասխանում են CE պահանջներին և բավարարում են UL, CSA ու RoHs պահանջները։
Ստորև բերված աղյուսակը պատկերացում է տալիս մեր ուլտրաձայնային սարքերի մոտավոր մշակման արտադրողականության մասին։
| Խմբաքանակի ծավալ | Հոսքի ծավալային արագություն | Առաջարկվող սարքեր |
|---|---|---|
| բազմափոսիկ / միկրոտիտրային թիթեղներ | n.a. | UIP400MTP |
| CupHorn՝ սրվակների կամ բաժակի համար | n.a. | Ուլտրաձայնային CupHorn |
| ուլտրաձայնային միկրոհոսքային ռեակտոր | n.a. | GDmini2 |
| մինչև 10 սրվակ՝ յուրաքանչյուրը 0,5–1,5mL ծավալով | n.a. | VialTweeter |
| 0,5–1,5mL | n.a. | VialTweeter |
| 1–500mL | 10–200mL/min | UP100H |
| 10–2000mL | 20–400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0,1–20L | 0,2–4L/min | UIP2000hdT |
| 10–100L | 2–10L/min | UIP4000 |
| n.a. | 10–100L/min | UIP16000 |
| n.a. | ավելի մեծ | սարքերի համախումբ՝ UIP16000 |
Կապվե՛ք մեզ հետ։ / Հարցրե՛ք մեզ։
Լրացուցիչ արձանագրություններ՝ E. coli-ի ուլտրաձայնային լիզիսի համար
Ալիցինով ձևափոխված սպիտակուցներ E. coli-ում՝ ուլտրաձայնային VialTweeter սարքի կիրառմամբ
Սուլֆհիդրիլային խմբերի պարունակության որոշում՝ 5,5′-դիթիոբիս(2-նիտրոբենզոյական թթու) (DTNB) թեստի միջոցով
E. coli MG1655-ի գիշերային կուլտուրան օգտագործվել է MOPS նվազագույն սննդամիջավայրը ցանելու համար (1:100)։ Կուլտուրան աճեցվել է աերոբ պայմաններում մինչև A600-ի 0,4 արժեքին հասնելը։ Կուլտուրան բաժանվել է երեք 15-ml կուլտուրաների՝ սթրեսային մշակման համար։ Չմշակված կուլտուրան ծառայել է որպես բացասական ստուգիչ։ Մնացած երկու կուլտուրաներից մեկին ավելացվել է 0,79 mM ալիցին (128 μg ml-1), իսկ մյուսին՝ 1 mM դիամիդ։ Կուլտուրաները ինկուբացվել են 15 min։ Յուրաքանչյուր կուլտուրայից 5 ml հավաքվել է ցենտրիֆուգմամբ (8 525 × g, 4°C, 10 min)։ Բջիջները երկու անգամ լվացվել են 1 ml PBS լուծույթով (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, օգտագործումից առաջ պահվել է անաերոբ պայմաններում) և ցենտրիֆուգվել (13 000 × g, 4°C, 10 min)։ Բջիջները կրկին կախույթացվել են լիզիսի բուֆերում (PBS՝ 6 mM գուանիդինիումի HCl-ով, pH 7,4), ապա քայքայվել 4°C ջերմաստիճանում ուլտրաձայնային մշակման միջոցով (VialTweeter ուլտրաձայնային սարք, Hielscher GmbH, Գերմանիա) (3 × 1 min)։ Բջջային մնացորդները նստեցվել են ցենտրիֆուգմամբ (13 000 × g, 4 °C, 15 min)։ Վերնստվածքային հեղուկը տեղափոխվել է մագնիսական խառնիչի ձողիկ պարունակող 3,5-ml QS-macro կյուվետ (10 mm) և խառնվել 1 ml լիզիսի բուֆերի հետ։ Նմուշների օպտիկական կլանումը վերահսկվել է 412 nm ալիքի երկարության դեպքում՝ սենյակային ջերմաստիճանում, օգտագործելով Jasco V-650 սպեկտրալուսաչափ՝ հագեցած ջերմակարգավորվող PSC-718 կյուվետակալով։ Ավելացվել է դիթիոբիս(2-նիտրոբենզոյական թթվի) 3 mM լուծույթից 100μl։ Օպտիկական կլանումը վերահսկվել է մինչև հագեցման հասնելը։ Թիոլի կոնցենտրացիայի հաշվարկի համար օգտագործվել է մոլային կլանման գործակիցը՝ ϵ412 = 13 700 M-1 cm-1 ՝ թիո-2-նիտրոբենզոյական թթվի (TNB) համար։ Բջջային թիոլների կոնցենտրացիաները հաշվարկվել են՝ հիմք ընդունելով E. coli բջիջների 6,7 × 10-15 լիտր ծավալը և A600 = 0,5 բջջային խտությունը (համարժեք է 1 × 108 բջիջ ml-1 կուլտուրայում)։ (Müller et al. 2016)
Գլուտաթիոնի որոշումը կենդանի օրգանիզմում՝ ուլտրաձայնային բջջաքայքայիչի կիրառմամբ
E.coli MG1655 բակտերիաները աճեցվել են MOPS նվազագույն սննդամիջավայրում՝ 200ml ընդհանուր ծավալով, մինչև A600 ցուցանիշը հասել է 0,5 արժեքի։ Սթրեսային մշակման համար կուլտուրան բաժանվել է 50-ml կուլտուրաների։ 0,79 mM ալիցինի, 1 mM դիամիդի կամ դիմեթիլսուլֆօքսիդի (ստուգիչ տարբերակ) հետ 15 min ինկուբացիայից հետո բջիջները հավաքվել են ցենտրիֆուգմամբ՝ 4 000g պայմաններում, 4°C ջերմաստիճանում, 10 min տևողությամբ։ Բջիջները երկու անգամ լվացվել են KPE բուֆերով, ապա նստվածքները վերասուսպենդացվել են 700µl KPE բուֆերում։ Սպիտակուցազրկման համար ավելացվել է 10% (w/v) սուլֆոսալիցիլաթթվի լուծույթից 300l՝ նախքան բջիջների քայքայումը ուլտրաձայնային մշակմամբ (3 x 1 min; VialTweeter ուլտրաձայնային սարք)։ Վերնստվածքային հեղուկները հավաքվել են ցենտրիֆուգումից հետո (30 min, 13 000g, 4°C)։ Սուլֆոսալիցիլաթթվի կոնցենտրացիաները նվազեցվել են մինչև 1%՝ ավելացնելով KPE բուֆերի 3 ծավալ։ Ընդհանուր գլուտաթիոնի և GSSG չափումները կատարվել են վերը նկարագրված ձևով։ Բջջային գլուտաթիոնի կոնցենտրացիաները հաշվարկվել են՝ հիմք ընդունելով E. coli բջիջների 6,7×10-15 լիտր ծավալը և A600 0,5 բջջային խտությունը (համարժեք է 1×108 բջիջ ml-1 կուլտուրայում)։ GSH կոնցենտրացիաները հաշվարկվել են՝ 2[GSSG] արժեքը ընդհանուր գլուտաթիոնից հանելով։ (Müller et al. 2016)
Մարդու mAspAT սպիտակուցի էքսպրեսիան E. coli բջիջներում՝ ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորի կիրառմամբ
Էքսպրեսիոն վեկտոր պարունակող E. coli BL21 (DE3) բակտերիաների մեկ գաղութը տեղադրվել է 100μg/mL ամպիցիլին պարունակող 30 mL Լուրիա–Բերտանի (LB) սննդամիջավայրում, ապա աճեցվել է 37ºC ջերմաստիճանում, մինչև օպտիկական խտության (OD600) արժեքը հասել է 0,6։ Բջիջները հավաքվել են ցենտրիֆուգմամբ՝ 4 000 × g պայմաններում, 10 min տևողությամբ, և վերասուսպենդացվել են 100μg/mL ամպիցիլին պարունակող 3L թարմ LB սննդամիջավայրում։
Այնուհետև սպիտակուցի էքսպրեսիան հարուցվել է 1 mM իզոպրոպիլ β-ᴅ-1-թիոգալակտոպիրանոզիդով (IPTG)՝ 20 h տևողությամբ, 16ºC ջերմաստիճանում։ Բջիջները հավաքվել են ցենտրիֆուգմամբ՝ 8 000 × g պայմաններում, 15 min տևողությամբ, և լվացվել A բուֆերով (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4)։ 3 L կուլտուրայից ստացվել է մոտավորապես 45g բջիջ (թաց զանգված)։ Ցենտրիֆուգումից հետո բջջային նստվածքները վերասուսպենդացվել են սառցասառը A էքստրակցիոն բուֆերի 40 mL ծավալում (1 L կուլտուրայի համար) և ենթարկվել լիզիսի՝ սառցասառը ջերմաստիճանում ուլտրաձայնային մշակմամբ՝ օգտագործելով Hielscher UP400St ուլտրաձայնային բջջաքայքայիչը։ Բջջային լիզատը ցենտրիֆուգվել է 12 000 rpm պայմաններում՝ 15 min տևողությամբ՝ լուծելի (վերնստվածքային հեղուկ) և նստեցված (նստվածք) ֆրակցիաներն առանձնացնելու համար։ (Jiang et al. 2015)
Փաստեր, որոնք արժե իմանալ
E.coli
Escherichia coli (E. coli) բակտերիան Escherichia ցեղին պատկանող գրամ-բացասական, ֆակուլտատիվ անաերոբ, ցուպիկաձև, կոլիֆորմ բակտերիա է, որը սովորաբար հանդիպում է տաքարյուն օրգանիզմների (էնդոթերմների) աղիների ստորին հատվածում։ Գոյություն ունեն տարբեր բնութագրերով E. coli բակտերիայի բազմաթիվ շտամներ (կամ ենթատեսակներ)։ Շտամների մեծ մասն անվնաս է մարդկանց համար, օրինակ՝ B և K-12 շտամները, որոնք սովորաբար օգտագործվում են լաբորատոր հետազոտություններում։ Սակայն որոշ շտամներ վնասակար են և կարող են լուրջ հիվանդություններ առաջացնել։
E. coli բակտերիան կարևոր դեր է խաղում ժամանակակից կենսաբանական ճարտարագիտության և արդյունաբերական մանրէաբանության մեջ, քանի որ այն հեշտ է մանիպուլացնել։ Լաբորատոր տարածված կիրառությունները, որոնցում հաճախ օգտագործվում է E. coli բակտերիան, ներառում են, օրինակ, ռեկոմբինանտ դեզօքսիռիբոնուկլեինաթթվի (DNA) ստեղծումը կամ E. coli բակտերիայի օգտագործումը որպես մոդելային օրգանիզմ։
E. coli բակտերիան հետերոլոգ սպիտակուցների արտադրության համար շատ բազմակողմանի հյուրընկալող օրգանիզմ է, և դրանում ռեկոմբինանտ սպիտակուցներ արտադրելու համար հասանելի են սպիտակուցների էքսպրեսիայի բազմաթիվ համակարգեր։ Սպիտակուցների բարձր մակարդակի էքսպրեսիա ապահովող պլազմիդների միջոցով բակտերիաների մեջ կարելի է ներմուծել գեներ, ինչը հնարավորություն է տալիս արդյունաբերական ֆերմենտացման գործընթացներում մեծ քանակությամբ արտադրել այդպիսի սպիտակուցներ։
E.coli բակտերիաներն օգտագործվում են որպես բջջային գործարաններ՝ ինսուլին արտադրելու համար։ Այլ կիրառությունները ներառում են փոփոխված E. coli բջիջների օգտագործումը՝ պատվաստանյութեր և անշարժացված ֆերմենտներ մշակելու ու արտադրելու, կենսավառելիք արտադրելու, ինչպես նաև կենսավերականգնման համար։
K-12 շտամը E. coli բակտերիայի մուտանտ ձև է, որը գերարտահայտում է ալկալային ֆոսֆատազ (ALP) ֆերմենտը։ Այս մուտացիան առաջանում է այն գենի արատի հետևանքով, որն անընդհատ կոդավորում է ֆերմենտը։ Եթե գենն առանց որևէ արգելակման արտադրանք է առաջացնում, դա կոչվում է կոնստիտուտիվ ակտիվություն։ Այս հատուկ մուտանտ ձևն օգտագործվում է ALP ֆերմենտի մեկուսացման և մաքրման համար։
E. coli բակտերիաները նաև լայնորեն օգտագործվում են որպես բջջային գործարաններ։ Ինժեներական եղանակով փոփոխված մանրէները (օրինակ՝ բակտերիաները) և բուսական բջիջները կարող են օգտագործվել որպես այսպես կոչված բջջային գործարաններ։ Գենետիկորեն փոփոխված այս բջիջներն արտադրում են մոլեկուլներ, քիմիական նյութեր, պոլիմերներ, սպիտակուցներ և այլ նյութեր, որոնք օգտագործվում են, օրինակ, դեղագործական, սննդի և քիմիական արդյունաբերության մեջ։ Այսպիսի կենսաինժեներական եղանակով ստեղծված բջիջների ներսում արտադրված մոլեկուլներն ազատելու համար ուլտրաձայնային լիզիսը բջջապատերը քայքայելու և թիրախային նյութերը շրջապատող հեղուկի մեջ տեղափոխելու տարածված մեթոդ է։ Կարդացեք ավելին կենսաինժեներական եղանակով ստեղծված բջիջների լիզիսի մասին։
DNA-ի ուլտրաձայնային տրոհում սահքի ուժերով
Ուլտրաձայնային սահքի ուժերի կիրառումը տարածված մեթոդ է բջջի ներսից մոլեկուլներ, օրգանելներ և սպիտակուցներ ազատելու, ինչպես նաև DNA-ի շղթաները հատվածների բաժանելու համար։ Ակուստիկ կավիտացիան քայքայում է բջջապատերն ու թաղանթները՝ բջիջներից DNA արդյունահանելու և մոտ 600 – 800 bp երկարությամբ հատվածներ ստանալու համար, ինչը կատարյալ է վերլուծության համար։
Սեղմեք այստեղ՝ DNA-ի հատվածավորման համար նախատեսված ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորների մասին ավելին իմանալու համար։
Գրականություն / Հղումներ
- Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
- Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
- Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
- Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
- Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
- Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.
Hielscher Ultrasonics ընկերությունն արտադրում է բարձր արդյունավետությամբ ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորներ՝ լաբորատոր չափերից մինչև արդյունաբերական չափեր։