Hielscher ուլտրաձայնային տեխնոլոգիա

Ուլտրաձայնային ԴՆԹ-ի կտրում

  • Ընթացքում ԴՆԹ եւ ՌՆԹ-shearing, ԴՆԹ մոլեկուլների են ներխուժել փոքր կտորների. ԴՆԹ / ՌՆԹ-մասնատման մեկն է կարեւոր նմուշը Prep համար անհրաժեշտ քայլերի ստեղծել գրադարանների համար հաջորդ սերնդի sequencing (NGS):
  • Ուլտրաձայնային ԴՆԹ կտրտմամբ օգտագործում է ուժերը ակուստիկ cavitation է կոտրել ԴՆԹ կամ RNA մեջ կտորների 100 – 5KB bp:
  • Ուլտրաձայնային կտրտմամբ թույլ է տալիս ճշգրիտ ԴՆԹ մասնատելու եւ XIX դարը ցանկալի ԴՆԹ երկարությամբ:

 

Ուլտրաձայնային ԴՆԹ-ի կտրում

Hielscher Ultrasonics առաջարկում է տարբեր ուլտրաձայնային վրա հիմնված լուծումներ ԴՆԹ, ՌՆԹ եւ քրոմատինի SHEARING. Ընտրեք միջեւ հետաքննություն տիպի ultrasonicators (օրինակ UP100H) ուղղակի sonication օգտագործելով microtip, կամ օգտագործել VialTweeeter կամ ուլտրաձայնային cuphorn համար անուղղակի ԴՆԹ պատրաստման տարբեր նմուշների միաժամանակ. Hielscher առաջարկում է իդեալական սարքը, հաշվի առնելով ձեր կարիքները: wether դուք ունեք 1 կամ մինչեւ 10 նմուշները, ծավալների ից microliter դեպի լիտր ծավալների – Hielscher ուլտրաձայնային պրոցեսորները հասանելի են համապատասխանում են Ձեր պահանջներին պետք է պատրաստվել ԴՆԹ, ՌՆԹ-ի եւ քրոմատինի դրվագներ է ճիշտ երկարությամբ: Reproducibility, հեշտ է շահագործման եւ ճշգրիտ վերահսկողության թույլ են տալիս մի հուսալի գրադարան հաջորդ սերնդի sequencing.
Ի տարբերություն ֆերմենտային ԴՆԹ fragmentation, ուլտրաձայնային կտրտմամբ վերաբերում է զուտ մեխանիկական ճղել ուժերը առանց ավելացնելով որեւէ քիմիական նյութեր: Ըստ ճշգրիտ ընդլայնված գործընթացի պարամետրերի, ուլտրաձայնային կտրտմամբ արտադրում է բարձր մոլեկուլային քաշը ԴՆԹ դրվագներ (plasmid եւ գենոմային ԴՆԹ):
Զտած nucleic թթուներ կարող է amplified առաջ կամ հետո մի fragmentation քայլ:
Sonication պարամետրերի (հզորության, զարկերակային ցիկլով / պարպումներ, ժամանակի եւ ջերմաստիճանի) կարող է եւ վերահսկվում է անվտանգ միջոցով ծրագրային պարամետրերը:

Առավելությունները `

  • ճշգրիտ հսկողություն
  • sonication ցիկլեր եւ ժամանակն հենց adaptable է ցանկալի ԴՆԹ չափի
  • բարձր մոլեկուլային քաշը ԴՆԹ բեկորները
  • ջերմաստիճանի վերահսկում
  • արագ
  • վերարտադրելի արդյունքներ
  • autoclavable
  • տարբեր լուծումներ: Probe տիպի,, VialTweeter- ը եւ Cuphorn

Արձանագրությունները ուլտրաձայնային ԴՆԹ Shearing

Համար քրոմատինի Immunoprecipitation Assay

Ընդհանուր առմամբ, բջիջները ծածկված էին 60 մմ տրամագծով ճաշատեսակներով (400,000 մեկ ճաշատեսակով) եւ փոխադրվում են RhoA siRNA- ով (նկարագրված է); 72 ժամ հետո, նրանք inkubated հետ formaldehyde (վերջնական կոնցենտրացիան, 1%) 10 րոպե է 37 ° C խաչաձեւ կապող սպիտակուցներ ԴՆԹ. Խաչաձեւ կապող ռեակցիան սառեցվել է 1.25 մոլ / լ լիկինի մեկ տերմինով ավելացմամբ `125 մմոլ / լ վերջնական կոնցենտրացիան տալով: Բջիջները երկու անգամ լվացվել էին սառույցով ցածր PBS- ով, ռադիոիմմերոպրոպիտավորման փորձարկման բջիջում (150 մմոլ / լ NaCl, 1% NP40, 0.5% deoxycholate, 0.1% SDS, 5 mmol / L EDTA, 50 մմոլ / լ Tris-HCl (pH 8.0 )] պարունակող 1 մմոլ / լ ֆենմմետիլուլֆլոնիլ ֆտորիդ, 1 ագ / մլ aprotinin եւ 1 ագ / մլ պեպստատին A եւ 30 րոպե սառույցով պահելու համար: Այնուհետեւ, բջջային լիզատները սառույցով sonicated էին a Hielscher UP200S ուլտրաձայնային sonicator (3 x 40 - ի, առատություն 40%, ցիկլը 1; Hielscher Ultrasonics GmbH), մինչեւ խաչաձեւ կապված chromatins են խուզել է զիջել ԴՆԹ դրվագներ 200 1000 bp: Մեկ տասներորդն ամբողջ lysate օգտագործվել էր quantitate գումարը ԴՆԹ ներկա տարբեր նմուշների եւ համարվում է որպես “Ընդհանուր մուտքագրում ԴՆԹ”, Supernatants են ինկուբացրել հետ սաղմոն սերմի ԴՆԹ / սպիտակուցը agarose-50% շիլա է նվազեցնել ոչ սպեցիֆիկ ֆոն. Immunoprecipitation այնուհետեւ արել գիշերում 4 ° C 5 կոոպերատիվի հակահայկական-NF-NB p65 (Վերին) կամ առանց հակամարմինների (բացասական վերահսկողության): Այս supernatants են համալրվել 5 մոլ / լ NaCl եւ ջեռուցվում գիշերվա ժամը 65 ° C է վերականգնել սպիտակուցը ԴՆԹ խաչաձեւ հղումներ. Այն immunocomplexes հետագայում բուժվել են DNase- եւ RNase ազատ proteinase K, եւ ԴՆԹ-ի մաքրվել է ֆենոլի / քլորոֆորմի արդյունահանման եւ ethanol տեղումների: PCR արվել է հատուկ պատիճների համապատասխան հաջորդականությամբ շրջանակներում խթանողին շրջանի մարդկային inos գենի (P1 այբբենարան: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶, p2 այբբենարան: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

EGFP-expression ուսումնասիրություններ

Արտահայտության համար ուսումնասիրությունների, որ recombinant լարում Լ tarentolae P10 :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (Յենայի կենսաբանության, Գերմանիա) հետ գենի համար EGFP (Enhanced Կանաչ ֆլուորեսցենտ սպիտակուցներ), chromosomal SSU ինտեգրված, մշակվել է տարբեր ԶԼՄ-ներում, ինչպես նկարագրված է նախկինում եւ լրացուցիչ համալրվել է 100 մգ l-1 Nourseothricin (Յենայի կենսաբանության, Գերմանիա): Ընթացքում մշակության, 1 մլ նմուշներ են վերցվել, centrifuged (2000 × գ, 20 ° C, 10 րոպե) եւ լվացվեն հետ 0.9% NaCl լուծման: Գնդիկ էր resuspended է բուֆերի (20 մմ HEPES, 5 մմ EDTA, 2 մմ DTT) եւ քայքայվել է sonification հետ ուլտրաձայնային պրոցեսոր UP400S (Կիրառումը էներգիայի ~ 400 WS): Բջջային բեկորներ են հանվել է centrifugation (6000 × գ, 4 ° C, 5 րոպե) եւ վերլուծվել են նատրիումի dodecyl sulfate - polyacrylamide գել Էլեկտրաֆորեզ (SDS-PAGE) ներքո կրճատելով պայմաններում, ըստ մեթոդի Laemmli (1970), ինչպես նաեւ 12.5% ​​polyacralamide gels , EGFP-արտահայտությունն էր քննվում է հուզված մշակույթի. (Fritsche et al., 2007):

Hielscher ի UP100H օգտագործվում էր պատրաստել EHEC ԼԱՄ - ի համար չիպ array վերլուծության

Electrophoretic վերլուծությունները genomic ԴՆԹ E. coli EDL933 ենթարկված 0 - 15 min ultrasonication. L ցույց է տալիս ԴՆԹ սանդուղք. (Basselet et al., 2008):

Տեղեկատվության պահանջ





քրոմատինի immunoprecipitation

Ուլտրաձայնային բջջային քայքայել UP100H (100W) համար lysis, բջջային կազմալուծման եւ ԴՆԹ SHEARING.The քրոմատինի immunoprecipitation հարգը էր իրականացվում է օգտագործելով Chip-ITTM Express (Ակտիվ լեյտմոտիվ, Carlsbad, CA, USA) ըստ արտադրողի հրահանգների որոշ փոփոխություններով: Համառոտ, տարբերակված մարդու podocytes էին խաչաձեւ կապում է 1% ֆորմալդեհիդի 10 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում: Բջիջները էին լվանում ice- սառը PBS եւ այդ ամրագրումն արձագանքը դադարեցվել էր `ավելացնելով 0.125 մ Գլիցինի 5 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում: Բջիջները էին լվանում կրկին Ice-cold PBS եւ մաքրում է ուտեստ. Խցերը pelleted են centrifugation եւ resuspended է lysis բուֆերի: Այն բանից հետո, centrifugation, pelleted միջուկներ են resuspended է shearing բուֆերի, հիմնադրամի սառույցի վրա 30 րոպե, իսկ քրոմատինի էր խուզել է sonication, օրինակ UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Գերմանիա) 25% -ով ուժգնությամբ 5 պուլս 20 վայրկյանում սառույցի մոտ, մոտ 200-600 բ / կ-ի բեկորների մեջ: Այնուհետեւ շեղված քրոմատինը սենսրիֆիկացված էր եւ հավաքվում էր սուպերնատատը: Իմմոնոպրիտների համար 60 μL քրոմատին ինկուբացված է 1 μg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, ԱՄՆ), NF-κB p65 (Abcam, Քեմբրիջ, Մեծ Բրիտանիա) կամ NF-κB p50 (Abcam) հակամարմին կամ նապաստակով IgG (Zymed Laboratories- ը, Հարավային Սան Ֆրանցիսկո, ԱՄՆ, ԱՄՆ), որպես բացասական հսկողություն, գիշերում `4 ° C նուրբ ռոտացիայի միջոցով: Մագնիսական բյուզանդների հետ կապված իմունային համալիրները հավաքվել էին մագնիսական դիրքով, լայնորեն լվացվում, եւ սպիտակուցային / ԴՆԹ-ի խաչմերուկները շրջվել են եւ ԴՆԹ-ն հեռացվել է իրական ժամանակի PCR վերլուծության համար: (Ristola եւ այլոք, 2009)

EHEC ԴՆԹ պատրաստման համար չիպ զանգված վերլուծության

Կոմպոզիցիա բջջային lysates եւ արդյունահանվող DNAs
ԲԱԿՏԵՐԱՅԻՆ կարկուտ կասեցված է PBS է ցանկալի վերջնական կոնցենտրացիան վերաբերվում ուլտրաձայնային քայքայել UP100H (Hielscher GmbH, Գերմանիա), որը հագեցած է MS1 (1 մմ տրամագծով) microtip սարքով: Գործառնական հաճախականությունը 30 կՀց էր եւ արդյունավետ ելքային հզորությունը `100 Վտ: Գործողության ընթացքում նմուշները սառեցվել էին սառույցի ջրի բաղնիքում, խառնված եւ ցենտրիֆուգով: Նմուշները օգտագործվել են հոսքի ցիտիտոմետրերի ուսումնասիրության համար, իսկ հետագայում մշակման համար նմուշները ենթարկվել են ջերմային բուժմանը (95 ° C, 5 րոպե): Հում բջիջների լիզաները մշակվել են ֆենոլի խառնուրդով `քլորոֆորմ` էսոամիլային ալկոհոլ (25: 24: 1): Այս խառնուրդի հավասար ծավալը ավելացվել է լիզեին նմուշի վրա, լուծումը 15 վայրկյանով ակտիվորեն փռվեց եւ 15 րոպեում 15 րոպե ցենտրիֆիկացվել էր 22 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում (RT) 2 րոպե: Գենոմիկային ԴՆԹ-ի պարունակությունը վերին ջրային փուլը ուշադիրորեն բաժանվեց եւ հավաքեց նոր ստերիլ Eppendorf խողովակում:
Դրանից հետո նմուշները sonicated են ԴՆԹ-ի հատվածի համար: The sonication քայլը կատարվել է նույն պայմաններում, ինչպես նկարագրված է վերը: Գենոմիկային ԴՆԹ-ի հատվածային ազդեցությունները գնահատելու համար նմուշները վերլուծվել են `օգտագործելով agarose գել էլեկտրոֆորեզ:
(…) Նախկինում 2.5 րոպեում sonicated նմուշները ենթարկվել են ջերմային բուժման եւ ցենտրիֆուգացման արդյունքում արդյունահանման քայլին: ԴՆԹ-ն ազատ է արձակվել երկու անգամ ֆենոլով. Քլորոֆորմ `էսոամիլային ալկոհոլային խառնուրդ, իսկ հետո երկրորդական sonication- ին ենթարկվել 0-ից 15 րոպե: Հետո վերամշակման ուլտրաձայնային մասնատման ենթարկված ԴՆԹ-ի չափի բաշխման համար օգտագործվել է agarose գել էլեկտրաֆորեզը (նկարը, վերին աջ կողմում): Բարձր բեկորացված ԴՆԹ-ն ակնհայտ դարձավ ԴՆԹ-ի կաթվածի առկայությունից, քան բարձր մոլեկուլային քաշային խմբերից, որոնք վերացվել էին 2.5 կամ ավելի կամարով sonicated նմուշներից: Ավելի երկար հնչեցումը աստիճանաբար կրճատեց բեկորների երկարությունը մոտավորապես 150-600 bp- ի վրա, իսկ sonication- ը 15 րոպե հետագայում դանդաղեցրեց այդ բեկորները, ինչպես կարելի է դիտել հիմնականում smear- ի վերին մասում: Այսպիսով, միջին DNA հատվածի չափը աստիճանաբար նվազել է ultrasonication ժամանակով եւ 5 րոպե բուժումը թույլ է տվել ձեռք բերել չիպային զանգվածի փորձերի համար առավել հարմար ԴՆԹ բեկորների չափերը: Վերջապես, ստեղծվել է ԴՆԹ-ի անալիտի պատրաստման կարգը, որն ընդգրկում է առաջին 2 րոպեը ուլտրաձայնային բուժումը, ԴՆԹ-ի արդյունահանումը (2 ×) եւ հետագա 5 րոպե sonication- ը: (Basselet եւ այլն, 2008)

Քրոմատինի Immunoprecipitation (Chip)

Ուլտրաձայնային պրոցեսոր UP100H ՝ ԴՆԹ-ի, ՌՆԹ-ի և քրոմատիկ ծածկույթի համար (Սեղմեք մեծացնելու համար)HEK293 բջիջները մշակվել են որպես վերը նկարագրված եւ ամրացված 2 մմ disuccinimidyl-glutarate- ով 45 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում: Հետո բջիջները լվանում էին PBS- ով երկու անգամ: Chromatin- ը խառնված էր 10 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում, օգտագործելով 1% (v / v) ֆորմալդեհիդ եւ երկու անգամ լվացվեց սառնարանային PBS- ով: Խաչաձեւ կապող ռեակցիան դադարեցվել է գլիկինով ինկուբացիայի միջոցով, 0.125 Մ վերջնական կոնցենտրացիայում, 5 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում: Հետո խցերի հետ քկալու պահից բջիջները քերծվեցին բջիջների մշակաբույսերից եւ երկու անգամ լվացվեցին PBS- ի հետ: Բջջային գնդիկը վերազինվել է լիզի բուֆերում (5 մմ խողովակներ, pH 8.0, 85 մմ Կկլ եւ 0.5% (v / v) Nonidet P-40), 10 րոպե սառույցով ինկուբացված եւ homogenized with Dounce homogenizer. Հետագայում միջուկները կպչում էին ցենտրիֆուգացումով (3500 xg, 5 րոպե, 4 ° C) եւ կրկին զտվում էին միջուկային բուֆերներում (50 մմ Tris-HCl, pH 8.1, 10 մմ EDTA եւ 1% (w / v) SDS): Nuclei- ն խանգարվել է sonication- ի կողմից `ա UP50H sonicator- ը (Hielscher Ultraschall Technologie) մի ընդլայնված ցիկլի 0.5 եւ առատություն 30%, զիջելով գենոմային ԴՆԹ դրվագներ հետ զանգված չափի 200 - 1000 bp. Չիպերի, 50g ԴՆԹ էր diluted 4 անգամ է immunoprecipitation բուֆերի (16.7 մմ Tris-HCl, pH 8.1, 167 մմ NaCl, 1.2 մմ EDTA, 1.1% (v / v) Triton X-100, իսկ 0.01% (Վտ / v) SDS): (Weiske et al., 2006):

Histone փոփոխումը վերլուծություն քրոմատինի immunoprecipitation (Chip)

Համառոտ, 6 x 106 բջիջները PBS- ով երկու անգամ լվանում էին եւ մշակութային ափսեի վրա խառնված 15 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում 0.5% formaldehyde ներկայությամբ: Cross-linking արձագանքը դադարեցվել է, ավելացնելով 0.125 Մլլիսին: Բոլոր հաջորդ քայլերը կատարվեցին 48 ° C-ում: Բոլոր բուֆերները նախապես սառեցված էին եւ պարունակում են պրոտեպա ինիբրիտներ (Complete Mini, Roche): Բջիջները PBS- ով երկու անգամ լվացվելուց հետո քերել էին: Հավաքած կարկուտները լուծարվել են 1 մլ լիզի բուֆերում (1% SDS, 5 մմ EDTA, 50 մմ Tris pH 8) եւ սառեցված էթանոլային բաղնիքում sonicated է 10 cycles 100% amplitude, օգտագործելով UP50H sonicator- ը (Hielscher, Teltow, Գերմանիա): Քրոմատինի fragmentation էր պատկերացնում է 1% agarose գել: Ձեռք բերված բեկորները գտնվում էին 200-500pb տիրույթում: Լուծելի քրոմատինի ստացվել է centrifuging է sonicated նմուշներ 14,000g 10 րոպե 48 ° C: The լուծելի մասն էր diluted 1/10 է նոսրացումը բուֆերի (1% Triton X-100, 2 մմ EDTA, 20 մմ Tris pH 8, 150 մմ NaCl), ապա aliquoted եւ պահվում է 80 ° C մինչեւ օգտագործման համար. (Ռոդրիգես et al., 2008):

սարք Հզորությունը [Վտ] Տիպ Ծավալը [մլ]
VialTweeter- ը 200 կանգնել առանձին 05 1.5
UP50H- ը 50 handheld կամ standmounted 0.01 250
UP100H 100 handheld կամ standmounted 0.01 500
Uf200 ः տ 200 handheld կամ standmounted 01 1000
UP200St 200 կանգնեցված 01 1000
UP400St 400 կանգնեցված 5.0 2000 թ
Cuphorn 200 Գավաթակիր, գորգագործ 10 200
GDmini2 200 աղտոտման ազատ հոսքի բջիջ

Տեղեկատվության պահանջ





Hielscher ի VialTweeter է is'deal համար միաժամանակյա պատրաստման բազմաթիվ նմուշների

VialTweeter- ը ուլտրաձայնային ընտրանքային Prep

Կապ մեզ հետ | / Հարցրեք մեզ!

Հարցրեք ավելին

Խնդրում ենք օգտագործել ստորեւ բերված ձեւը, եթե ցանկանում է պահանջել լրացուցիչ տեղեկություններ ուլտրաձայնային համասեռացումից: Մենք ուրախ կլինենք առաջարկել Ձեզ ուլտրաձայնային համակարգ հանդիպել Ձեր պահանջներին:









Խնդրում ենք նկատի ունենալ մեր Գաղտնիության քաղաքականություն,


Գրականություն / հղումներ

  • Basselet P., Wegrzyn Գ, Enfors S.-O., Gabig-Ciminska Մ. (2008 թ.): Sample վերամշակման համար ԴՆԹ փշուր զանգված հիմնված վերլուծության enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC): Մանրէաբանական Բջջային գործարանները 7:29. 2008 թ.
  • Doublier Ս., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona Գ, Ghigo Դ, Bosia Ա. (008): RhoA լռեցնելով վերադառնում դիմադրության Doxorubicin ի Մարդու հաստ աղիքի քաղցկեղի բջիջների. Մոլեկուլային Cancer Research 6 (10), 2008 թ.
  • Fredlund E., Gidlund Ա., Olsen Մ., Börjesson Տ., Spliid NHH, Simonsson Մ. (2008 թ.): Մեթոդ գնահատումը Fusarium ԴՆԹ արդյունահանման mycelia եւ ցորենի համար ներքեւ հոսք իրական ժամանակում ՊՇՌ-ի քանակական եւ հարաբերակցության mycotoxin մակարդակներում , Ամսագիրը մանրէաբանական մեթոդների 2008 թ.
  • Fritsche C., Sitz Մ., Weiland Ն., Breitling Ռ., Pohl H.-D. (2007 թ.): Բնութագրում է աճի վարքագիծը Leishmania tarentolae մի նոր արտահայտվելու համակարգի ռեկոմբինանտ սպիտակուցներ: Ամսագիր Հիմնական Մանրէաբանություն 47, 2007 թ. 384-393.
  • Ristola Մ., Arpiainen Ս., Saleem Մ. Ա., Mathieson Պ. W., ուելսերեն Գ Ի., Lehtonen Ս., Holthöfer Հ. (2009 թ.): Կանոնակարգում Neph3 գեն է podocytes - առանցքային դերերից տառադարձությամբ գործոններ NF-κB եւ SP1. BMC Մոլեկուլային կենսաբանություն 10:83 2009 թ.
  • Rodriguez J., Վիվես Լ, JORDA Մ., Մորալեսը C., Munoz Մ., Vendrell E., Peinado Մ. Ա. (2008 թ.): Գենոմի-լայն հետեւող unmethylated ԴՆԹ Alu կրկնում է նորմալ եւ քաղցկեղի բջիջների. Nucleic թթուներ Research Vol. 36, թիվ 3, 2008 թ. 770-784.
  • Weiske J. Huber O. (2006): The Histidine Triad Սպիտակուցներ Hint1 թողարկիչ apoptosis, անկախ իր ֆերմենտային ակտիվության: Ամսագիրը կենսաբանական քիմիայի. Vol. 281, թիվ 37, 2006 թ. 27356-27366.


Փաստեր Worth Իմանալով

Ուլտրաձայնային / ակուստիկ cavitation ստեղծում բարձր ինտենսիվ ուժերը, որոնք նպաստում են բյուրեղացման եւ Տեղումները գործընթացները (Մեծացնել)

Ուլտրաձայնային ԴՆԹ կտրտմամբ հիմնված է ակուստիկ cavitation եւ նրա hydrodynamic ճղել ուժերի