ԴՆԹ-ի ուլտրաձայնային կտրում

• ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի կտրման ժամանակ ԴՆԹ-ի մոլեկուլները բաժանվում են փոքր մասերի: ԴՆԹ/ՌՆԹ-ի մասնատումը նմուշի նախապատրաստման կարևոր քայլերից մեկն է, որն անհրաժեշտ է հաջորդ սերնդի հաջորդականության համար գրադարաններ ստեղծելու համար (NGS):
• ԴՆԹ-ի ուլտրաձայնային կտրումը օգտագործում է ակուստիկ կավիտացիայի ուժերը՝ ԴՆԹ-ն կամ ՌՆԹ-ն 100 կտորների բաժանելու համար։ – 5 kb bp.
• Ուլտրաձայնային կտրումը թույլ է տալիս ճշգրիտ ԴՆԹ-ի մասնատումը և հարմարվել ԴՆԹ-ի ցանկալի երկարությանը:

ԴՆԹ-ի կտրում ուլտրաձայնային մեթոդով

Hielscher Ultrasonics-ն առաջարկում է տարբեր ուլտրաձայնային լուծումներ ԴՆԹ-ի, ՌՆԹ-ի և քրոմատինի կտրման համար: Ընտրեք զոնդի տիպի ուլտրաձայնային սարքերի միջև (օրինակ՝ UP100H)՝ միկրոծածկույթի միջոցով ուղղակի ձայնագրման համար, կամ օգտագործեք VialTweeeter-ը կամ ուլտրաձայնային ուլտրաձայնային կափարիչը՝ տարբեր նմուշների ԴՆԹ-ի անուղղակի պատրաստման համար միաժամանակ: Hielscher-ն առաջարկում է իդեալական սարք՝ հաշվի առնելով ձեր կարիքները. անկախ նրանից, դուք ունեք 1 կամ մինչև 10 նմուշ, ծավալները՝ միկրոլիտրից մինչև լիտր ծավալ: – Hielscher ուլտրաձայնային պրոցեսորները հասանելի են՝ բավարարելու ձեր պահանջները՝ ճիշտ երկարությամբ ԴՆԹ, ՌՆԹ և քրոմատին բեկորներ պատրաստելու համար: Վերարտադրելիությունը, հեշտ շահագործումը և ճշգրիտ կառավարումը թույլ են տալիս ստեղծել հուսալի գրադարան հաջորդ սերնդի հաջորդականության համար:
Ի տարբերություն ֆերմենտային ԴՆԹ-ի մասնատման, ուլտրաձայնային կտրումը կիրառում է մաքուր մեխանիկական կտրող ուժեր՝ առանց որևէ քիմիական նյութ ավելացնելու: Գործընթացի պարամետրերի ճշգրիտ սահմանմամբ, ուլտրաձայնային կտրումը առաջացնում է բարձր մոլեկուլային քաշով ԴՆԹ-ի բեկորներ (պլազմիդ և գենոմային ԴՆԹ):
Մաքրված նուկլեինաթթուները կարող են ուժեղացվել մասնատման փուլից առաջ կամ հետո:
Sonication պարամետրերը (հզորությունը, զարկերակային ցիկլը / պայթյունները, ժամանակը և ջերմաստիճանը) կարող են ապահով վերահսկվել ծրագրային պարամետրերի միջոցով:

Արձանագրություններ ուլտրաձայնային ԴՆԹ-ի կտրման համար

Քրոմատինի իմունային նստվածքների վերլուծության համար

Համառոտ, բջիջները տեղադրվեցին 60 մմ տրամագծով ափսեների մեջ (400,000 մեկ ճաշատեսակի մեջ) և փոխարկվեցին RhoA siRNA-ով (ինչպես նկարագրված է); 72 ժամ հետո դրանք ինկուբացվել են ֆորմալդեհիդով (վերջնական կոնցենտրացիան՝ 1%) 10 րոպե 37°C ջերմաստիճանում՝ սպիտակուցները ԴՆԹ-ին խաչակցելու համար: Խաչաձեւ կապակցման ռեակցիան մարվել է 1,25 մոլ/լ գլիկինի մեկ տասներորդ ծավալի ավելացմամբ՝ տալով 125 մմոլ/լ վերջնական կոնցենտրացիան: Բջիջները երկու անգամ լվացվեցին սառցե PBS-ով, նորից կասեցվեցին ռադիոիմունային նստվածքային վերլուծության բուֆերում [150 մմոլ/լ NaCl, 1% NP40, 0,5% դեզօքսիխոլատ, 0,1% SDS, 5 մմոլ/Լ EDTA, 50 մմոլ/Լ Tris.8HCl0H (p )] պարունակող 1 մմոլ/լ ֆենիլմեթիլսուլֆոնիլ ֆտորիդ, 1 Ag/mL ապրոտինին և 1 Ag/mL պեպստատին A և պահվում է սառույցի վրա 30 րոպե։ Այնուհետև, բջջային լիզատները սառույցի վրա sonicated են a Hielscher UP200S Ուլտրաձայնային ձայնային սարք (3 x 40 վրկ, ամպլիտուդ 40%, ցիկլ 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) մինչև խաչաձև կապակցված քրոմատինները կտրվեցին՝ 200-ից 1000 bp միջակայքում ԴՆԹ-ի բեկորներ ստանալու համար: Ամբողջական լիզատի մեկ տասներորդը օգտագործվել է տարբեր նմուշներում առկա ԴՆԹ-ի քանակությունը չափելու համար և համարվել է որպես “ընդհանուր մուտքային ԴՆԹ”. Սուպերնատանտները ինկուբացվել են սաղմոնի սերմի ԴՆԹ-ով/սպիտակուցային ագարոզա-50% լուծույթով՝ նվազեցնելու ոչ սպեցիֆիկ ֆոնը: Այնուհետև իմունային նստվածքն իրականացվել է գիշերվա ընթացքում 4°C-ում 5 Ag հակա-NF-nB p65-ով (Upstate) կամ առանց հակամարմինների (բացասական հսկողություն): Այս սուպերնատենտները համալրվել են 5 մոլ/լ NaCl-ով և գիշերը տաքացրել 65°C-ում` սպիտակուց-ԴՆԹ խաչաձև կապերը վերականգնելու համար: Իմունոկոմպլեքսները հետագայում մշակվեցին DNase- և RNase-ազատ պրոտեինազ K-ով, և ԴՆԹ-ն մաքրվեց ֆենոլ/քլորոֆորմ արդյունահանման և էթանոլային նստեցման միջոցով: PCR-ն արվել է հատուկ պրայմերներով, որոնք համապատասխանում են մարդկային iNOS գենի պրոմոութեր տարածաշրջանի հաջորդականությանը (p1 այբբենարան՝ 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 պրայմեր՝ GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶): (Doublier et al., 2008)

EGFP-արտահայտման ուսումնասիրություններ

Էքսպրեսիոն ուսումնասիրությունների համար ռեկոմբինանտ շտամը L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Գերմանիա) EGFP-ի (ուժեղացված կանաչ լյումինեսցենտ սպիտակուց) գենով մշակվել է քրոմոսոմային ssu-ի ինտեգրված տարբեր միջավայրերում, ինչպես նախկինում նկարագրված է լրացուցիչ լրացվում է 100 մգ լ^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Գերմանիա): Մշակման ընթացքում վերցվել են 1 մլ նմուշներ, ցենտրիֆուգվել (2000 × գ, 20°C, 10 րոպե) և լվանալ 0,9% NaCl լուծույթով։ Պելետը կրկին կասեցվել է բուֆերի մեջ (20 մՄ HEPES, 5 մՄ EDTA, 2 մՄ DTT) և քայքայվել է ուլտրաձայնային պրոցեսորի միջոցով sonification-ի միջոցով: UP400S (էներգիայի կիրառումը ~ 400 Վտ): Բջջային մնացորդները հեռացվել են ցենտրիֆուգմամբ (6000 × գ, 4°C, 5 րոպե) և վերլուծվել նատրիումի դոդեցիլսուլֆատ-պոլիակրիլամիդ գել էլեկտրոֆորեզով (SDS-PAGE) վերականգնողական պայմաններում՝ Laemmli (1970) մեթոդի համաձայն՝ 12,5% պոլիակրալամիդ գելերով: . EGFP-արտահայտությունը հետազոտվել է գրգռված մշակույթում: (Fritsche et al. 2007 թ.)

քրոմատինի իմունային նստվածք

Քրոմատինի իմունային նստվածքի վերլուծությունը կատարվել է ChIP-IT-ի միջոցով^ՏՄ Էքսպրես (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) ըստ արտադրողի ցուցումների՝ որոշ փոփոխություններով: Համառոտ, դիֆերենցված մարդկային պոդոցիտները 10 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում խաչաձեւ կապակցվել են 1% ֆորմալդեհիդով: Բջիջները լվացվեցին սառցե PBS-ով և ֆիքսման ռեակցիան դադարեցվեց՝ ավելացնելով 0,125 Մ գլիցին 5 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում: Բջիջները կրկին լվացվեցին սառցե PBS-ով և քերեցին սպասքից: Բջիջները գնդիկավորվել են ցենտրիֆուգման միջոցով և նորից կասեցվել լիզի բուֆերի մեջ: Ցենտրիֆուգումից հետո գնդիկավոր միջուկները կրկին կասեցվել են խուզող բուֆերի մեջ, ինկուբացվել սառույցի վրա 30 րոպե, և քրոմատինը կտրվել է սոնիկացիայի միջոցով, օրինակ. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Գերմանիա) 25% հզորությամբ 5 իմպուլսներ 20 վայրկյանից յուրաքանչյուրը սառույցի վրա մոտավորապես 200–600 bp բեկորների մեջ: Կտրված քրոմատինը այնուհետև ցենտրիֆուգվել է, և վերին նյութը հավաքվել է: Իմունային նստվածքների համար 60 μl քրոմատին ինկուբացվել է 1 μg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) կամ NF-κB p50 (Abcam) հակամարմիններով կամ IgG (Zymed Laboratories, Հարավային Սան Ֆրանցիսկո, Կալիֆորնիա, ԱՄՆ), որպես բացասական հսկողություն, գիշերը 4°C-ում մեղմ պտույտով: Մագնիսական ուլունքների հետ կապված իմունոկոմպլեքսները հավաքվել են մագնիսական տակդիրի միջոցով, մանրակրկիտ լվացվել, և սպիտակուցի/ԴՆԹ-ի խաչմերուկները հակադարձվել են և ԴՆԹ-ն մաքրվել իրական ժամանակում PCR վերլուծության համար: (Ristola et al. 2009 թ.)

EHEC ԴՆԹ-ի պատրաստում չիպերի զանգվածի վերլուծության համար

Բջիջների լիզատների և արդյունահանված ԴՆԹ-ների դասավորությունը
PBS-ում կախված բակտերիալ գնդիկները մինչև ցանկալի վերջնական կոնցենտրացիան մշակվել են Ուլտրաձայնային խանգարող UP100H (Hielscher GmbH, Գերմանիա) հագեցած MS1 միկրոթափով (1 մմ տրամագծով): Աշխատանքային հաճախականությունը 30 կՀց էր, իսկ արդյունավետ ելքային հզորությունը՝ 100 Վտ: Գործողության ընթացքում նմուշները սառչում էին սառցե ջրային բաղնիքում, խառնում և ցենտրիֆուգում: Նմուշներն օգտագործվել են հոսքի ցիտոմետրիայի ուսումնասիրության համար, իսկ ավելի ուշ մշակման համար նմուշները ենթարկվել են ջերմային մշակման (95°C, 5 րոպե): Հում բջջային լիզատները մշակվել են ֆենոլ:քլորոֆորմ:իզոամիլ սպիրտ խառնուրդով (25:24:1): Այս խառնուրդի հավասար ծավալն ավելացվեց լիզատի նմուշին, լուծույթը 15 վրկ եռանդով պտտվեց և ցենտրիֆուգվեց 15000 xg-ով 2 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում (RT) մոտ 22°C: Գենոմային ԴՆԹ պարունակող վերին ջրային փուլը խնամքով առանձնացվել և հավաքվել է նոր ստերիլ Էպենդորֆյան խողովակի մեջ:
Այնուհետև նմուշները ձայնագրվել են ԴՆԹ-ի մասնատման համար: Sonication քայլը իրականացվել է նույն պայմաններում, ինչպես նկարագրված է վերը: Գենոմային ԴՆԹ-ի վրա մասնատման ազդեցությունը գնահատելու համար նմուշները վերլուծվել են ագարոզայի գելային էլեկտրոֆորեզի միջոցով:
(…) Նախկինում 2,5 րոպե տեւողությամբ sonicated նմուշները ենթարկվել են արդյունահանման փուլի ջերմային մշակումից և ցենտրիֆուգումից հետո: Ազատված ԴՆԹ-ն արդյունահանվել է երկու անգամ ֆենոլ:քլորոֆորմ:իզոամիլ սպիրտ խառնուրդով, այնուհետև 0-15 րոպե տեւողությամբ երկրորդ ձայնային ախտահանման ենթարկվել: Ագարոզայի գելային էլեկտրոֆորեզն օգտագործվել է որոշելու ԴՆԹ-ի չափերի բաշխումը, որը ենթարկվում է հետքստրակցիոն ուլտրաձայնային մասնատման (նկ. վերևի աջ կողմում): Բարձր մասնատված ԴՆԹ-ն ակնհայտ էր ԴՆԹ-ի քսուկի առկայությունից, այլ ոչ թե բարձր մոլեկուլային քաշի շերտերից, որոնք վերացվել էին 2,5 րոպե կամ ավելի երկար ժամանակով սոնիկացված նմուշներից: Ավելի երկար sonication-ը աստիճանաբար նվազեցրեց բեկորների երկարությունը մոտավորապես 150-600 bp, իսկ 15 րոպեի ընթացքում sonication-ը հետագայում քայքայեց այս բեկորները, ինչպես երևում է հիմնականում քսուքի վերին մասում: Այսպիսով, ԴՆԹ-ի բեկորների միջին չափը աստիճանաբար նվազում էր ուլտրաձայնային ժամանակի հետ և 5 րոպե բուժումը թույլ տվեց ձեռք բերել ԴՆԹ-ի բեկորների չափերը, որոնք առավել հարմար են չիպերի զանգվածի վերլուծության համար: Ի վերջո, հաստատվեց ԴՆԹ-ի անալիտի պատրաստման ընթացակարգը, որը ներառում է առաջին 2 րոպե ուլտրաձայնային բուժումը, ԴՆԹ-ի արդյունահանումը (2×) և հետագա 5 րոպե հնչյունավորումը: (Basselet et al. 2008)

Քրոմատինային իմունային նստվածք (ChIP)

HEK293 բջիջները մշակվել են ինչպես նկարագրված է վերևում և ամրացվել 2 մՄ դիսուկինիմիդիլ-գլյուտարատով 45 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում: Այնուհետև բջիջները երկու անգամ լվացվեցին PBS-ով: Քրոմատինը խաչաձև կապակցվել է 10 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում, օգտագործելով 1% (v/v) ֆորմալդեհիդ և երկու անգամ լվանալ սառույցով սառը PBS-ով: Խաչաձև կապակցման ռեակցիան դադարեցվել է 0,125 Մ վերջնական կոնցենտրացիայով գլիցինով ինկուբացիայի միջոցով 5 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում: Տրիպսինով ինկուբացիայից հետո բջիջները քերել են բջիջների կուլտուրայի ափսեից և երկու անգամ լվանալ PBS-ով: Բջջային գնդիկը նորից կասեցվել է լիզի բուֆերում (5 մՄ խողովակներ, pH 8.0, 85 մՄ KCl և 0.5% (v/v) Nonidet P-40), 10 րոպե ինկուբացվել է սառույցի վրա և համասեռացվել Dounce հոմոգենիզատորով: Այնուհետև միջուկները ցենտրիֆուգման միջոցով (3500 xg, 5 րոպե, 4 °C) և նորից կասեցվեցին միջուկների բուֆերում (50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 10 mM EDTA և 1% (w/v) SDS): Միջուկները խաթարվել են սոնիկացիայով երեք 20-ական իմպուլսներով a UP50H sonicator (Hielscher Ultraschall Technologie) 0,5 ցիկլի և 30% ամպլիտուդի պարամետրում, որը տալիս է գենոմային ԴՆԹ-ի բեկորներ 200 – 1000 bp մեծությամբ: ChIP-ի համար 50 գ ԴՆԹ 4 անգամ նոսրացվել է իմունային նստվածքային բուֆերում (16,7 մՄ Tris-HCl, pH 8,1, 167 մՄ NaCl, 1,2 մՄ EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 և 0,01% (w/w): v) SDS): (Weiske et al. 2006 թ.)

Հիստոնի ձևափոխման վերլուծություն քրոմատինային իմունային նստվածքով (ChIP)

Համառոտ 6 x 10⁶ բջիջները երկու անգամ լվացվեցին PBS-ով և խաչաձեւ կապակցվեցին կուլտուրայի ափսեի վրա 15 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում 0,5% ֆորմալդեհիդի առկայության դեպքում: Խաչաձեւ կապակցման ռեակցիան դադարեցվել է՝ ավելացնելով 0,125 M գլիցին: Բոլոր հետագա քայլերն իրականացվել են 48°C ջերմաստիճանում: Բոլոր բուֆերները նախապես սառեցված էին և պարունակում էին պրոթեզերոնի ինհիբիտորներ (Complete Mini, Roche): Բջիջները երկու անգամ լվացվել են PBS-ով, ապա քերել: Հավաքված գնդիկները լուծվել են 1 մլ լիզի բուֆերի մեջ (1% SDS, 5 մՄ EDTA, 50 մՄ տրիս pH 8) և 10 ցիկլով 100% ամպլիտուդով սառը էթանոլի լոգարանում լուծարվել՝ օգտագործելով UP50H sonicator (Հիլշեր, Թելտո, Գերմանիա): Քրոմատինի մասնատումը տեսանելի է եղել 1% ագարոզայի գելում: Ստացված բեկորները եղել են 200–500 pb միջակայքում: Լուծվող քրոմատինը ստացվել է ցենտրիֆուգման միջոցով 14000 գ-ում 10 րոպե 48°C ջերմաստիճանում լուծվող նմուշները: Լուծվող մասնիկը նոսրացվել է 1/10-ով նոսրացման բուֆերում (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), այնուհետև բաժանվել և պահվել 80°C-ում մինչև օգտագործումը: (Rodriguez et al. 2008)