ԴՆԹ-ի ուլտրաձայնային սահքային մասնատում

ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի սահքային մասնատման ընթացքում ԴՆԹ-ի երկար մոլեկուլները բաժանվում են ավելի փոքր հատվածների. սա կարևոր քայլ է հաջորդ սերնդի սեքվենավորման (NGS) գրադարանի կառուցման համար նմուշների պատրաստման գործընթացում։ ԴՆԹ-ի ուլտրաձայնային սահքային մասնատման ժամանակ ակուստիկ կավիտացիայի ուժերն օգտագործվում են ԴՆԹ-ն կամ ՌՆԹ-ն 100 bp-ից մինչև 5 kb չափերով հատվածների բաժանելու համար։ Այս մեթոդը հնարավորություն է տալիս ճշգրիտ վերահսկել հատվածների չափը՝ հեշտացնելով դրանց հարմարեցումը ԴՆԹ-ի ցանկալի երկարությանը՝ սեքվենավորման օպտիմալ արդյունքներ ստանալու համար։

ԴՆԹ-ի սահքային մասնատում ուլտրաձայնի կիրառմամբ

Hielscher Ultrasonics ընկերությունն առաջարկում է ուլտրաձայնի վրա հիմնված տարբեր լուծումներ՝ ԴՆԹ-ի, ՌՆԹ-ի և քրոմատինի սահքային մասնատման համար։ Ընտրեք զոնդային տիպի ուլտրաձայնային սարք (օրինակ՝ UP100H)՝ միկրոծայրակով ուղղակի ուլտրաձայնային մշակման համար, կամ օգտագործեք VialTweeeter սարքը կամ ուլտրաձայնային cuphorn սարքը՝ միաժամանակ տարբեր նմուշներում ԴՆԹ-ի անուղղակի պատրաստման համար։ Hielscher ընկերությունն առաջարկում է ձեր կարիքներին համապատասխան իդեալական սարք. անկախ նրանից՝ ունեք 1, թե մինչև 10 նմուշ, միկրոլիտրից մինչև լիտր ծավալներ՝ Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը կբավարարեն ԴՆԹ-ի, ՌՆԹ-ի և քրոմատինի՝ համապատասխան երկարությամբ հատվածների պատրաստման ձեր պահանջները։ Վերարտադրելիությունը, շահագործման պարզությունն ու ճշգրիտ վերահսկումը թույլ են տալիս ստանալ հուսալի գրադարան՝ հաջորդ սերնդի սեքվենավորման համար։
Ի տարբերություն ԴՆԹ-ի ֆերմենտային մասնատման՝ ուլտրաձայնային սահքային մասնատումը կիրառում է զուտ մեխանիկական սահքի ուժեր՝ առանց որևէ քիմիական նյութ ավելացնելու։ Գործընթացի պարամետրերի ճշգրիտ կարգավորմամբ ուլտրաձայնային սահքային մասնատումը տալիս է ԴՆԹ-ի բարձր մոլեկուլային զանգվածով հատվածներ (պլազմիդային և գենոմային ԴՆԹ)։
Մաքրված նուկլեինաթթուները կարող են ամպլիֆիկացվել մասնատման փուլից առաջ կամ հետո։
Ուլտրաձայնային մշակման պարամետրերը (հզորություն, իմպուլսային ցիկլ / իմպուլսների շարքեր, ժամանակ և ջերմաստիճան) կարող են անվտանգ վերահսկվել ծրագրային կարգավորումների միջոցով։

ԴՆԹ-ի ուլտրաձայնային սահքային մասնատման արձանագրություններ

Քրոմատինի իմունապրեցիպիտացիոն հետազոտության համար

Հակիրճ՝ բջիջները ցանվել են 60mm տրամագծով թասերի մեջ (յուրաքանչյուր թասում՝ 400 000 բջիջ) և տրանսֆեկցվել RhoA siRNA նյութով (ինչպես նկարագրված է)։ 72 h անց դրանք ինկուբացվել են ֆորմալդեհիդով (վերջնական կոնցենտրացիան՝ 1%) 10 min՝ 37°C ջերմաստիճանում՝ սպիտակուցները ԴՆԹ-ի հետ խաչաձև կապակցելու համար։ Խաչաձև կապակցման ռեակցիան դադարեցվել է՝ ավելացնելով ծավալի մեկ տասներորդին հավասար ծավալով 1,25 mol/L գլիցին՝ ստանալով 125 mmol/L վերջնական կոնցենտրացիա։ Բջիջները երկու անգամ լվացվել են սառցասառը PBS լուծույթով, կրկին կախույթավորվել ռադիոիմունապրեցիպիտացիոն հետազոտության բուֆերում [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% դեզօքսիխոլատ, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)], որը պարունակում էր 1 mmol/L ֆենիլմեթիլսուլֆոնիլ ֆտորիդ, 1 Ag/mL ապրոտինին և 1 Ag/mL պեպստատին A, և պահվել սառույցի վրա 30 min։ Այնուհետև բջջային լիզատները սառույցի վրա մշակվել են ուլտրաձայնով՝ կիրառելով Hielscher UP200S ուլտրաձայնային սարքը (3 x 40 s, ամպլիտուդը՝ 40%, ցիկլը՝ 1; Hielscher Ultrasonics GmbH), մինչև խաչաձև կապակցված քրոմատինները սահքային մասնատմամբ տվել են 200-ից մինչև 1 000 bp չափերով ԴՆԹ-ի հատվածներ։ Ամբողջ լիզատի մեկ տասներորդն օգտագործվել է տարբեր նմուշներում առկա ԴՆԹ-ի քանակը որոշելու համար և համարվել «ընդհանուր մուտքային ԴՆԹ»։ Վերնստվածքային հեղուկներն ինկուբացվել են սաղմոնի սպերմայի ԴՆԹ/սպիտակուցային ագարոզի 50% կախույթի հետ՝ ոչ սպեցիֆիկ ֆոնային ազդանշանը նվազեցնելու համար։ Այնուհետև իմունապրեցիպիտացիան իրականացվել է գիշերվա ընթացքում՝ 4°C ջերմաստիճանում, 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) հակամարմնի առկայությամբ կամ առանց հակամարմնի (բացասական ստուգիչ)։ Այս վերնստվածքային հեղուկներին ավելացվել է 5 mol/L NaCl լուծույթ, և դրանք տաքացվել են գիշերվա ընթացքում՝ 65°C ջերմաստիճանում՝ սպիտակուց–ԴՆԹ խաչաձև կապերը քանդելու համար։ Իմունային համալիրները հետագայում մշակվել են DNase և RNase չպարունակող պրոտեինազ K ֆերմենտով, իսկ ԴՆԹ-ն մաքրվել է ֆենոլ/քլորոֆորմային էքստրակցիայով և էթանոլով նստեցմամբ։ ՊՇՌ-ն իրականացվել է սպեցիֆիկ պրայմերներով, որոնք համապատասխանում էին մարդու iNOS գենի պրոմոտորային շրջանում գտնվող հաջորդականությանը (p1 պրայմեր՝ 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 պրայմեր՝ GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶)։ (Doublier et al., 2008)

EGFP-ի էքսպրեսիայի ուսումնասիրություններ

Էքսպրեսիայի ուսումնասիրությունների համար L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 ռեկոմբինանտ շտամը (Jena Bioscience, Գերմանիա), որի քրոմոսոմային ssu տեղամասում ինտեգրված էր EGFP (ուժեղացված կանաչ ֆլուորեսցենտ սպիտակուց) կոդավորող գենը, աճեցվել է տարբեր միջավայրերում՝ ինչպես նկարագրվել է նախկինում, լրացուցիչ ավելացնելով 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Գերմանիա)։ Աճեցման ընթացքում վերցվել են 1 ml նմուշներ, ցենտրիֆուգվել (2000 × g, 20°C, 10 min) և լվացվել 0,9% NaCl լուծույթով։ Նստվածքը վերասուսպենդավորվել է բուֆերում (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) և քայքայվել ուլտրաձայնային մշակմամբ՝ օգտագործելով ուլտրաձայնային պրոցեսոր UP400S (կիրառված էներգիան՝ ∼ 400 Ws)։ Բջջային մնացորդները հեռացվել են ցենտրիֆուգմամբ (6000 × g, 4°C, 5 min) և վերլուծվել նատրիումի դոդեցիլսուլֆատ – պոլիակրիլամիդային գելային էլեկտրոֆորեզով (SDS-PAGE)՝ վերականգնող պայմաններում, ըստ Laemmli (1970) մեթոդի՝ օգտագործելով 12,5% պոլիակրիլամիդային գելեր։ EGFP էքսպրեսիան ուսումնասիրվել է խառնվող կուլտուրայում։ (Fritsche et al. 2007)

Քրոմատինի իմունոպրեցիպիտացիա

Քրոմատինի իմունոպրեցիպիտացիայի անալիզը կատարվել է՝ օգտագործելով ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, ԱՄՆ)՝ արտադրողի հրահանգների համաձայն՝ որոշ փոփոխություններով։ Հակիրճ՝ մարդու տարբերակված պոդոցիտներում խաչաձև կապեր են առաջացվել 1% ֆորմալդեհիդով՝ 10 min սենյակային ջերմաստիճանում։ Բջիջները լվացվել են սառցասառը PBS լուծույթով, և ֆիքսման ռեակցիան դադարեցվել է՝ ավելացնելով 0,125 M գլիցին՝ 5 min սենյակային ջերմաստիճանում։ Բջիջները կրկին լվացվել են սառցասառը PBS լուծույթով և քերվել թասից։ Բջիջները նստեցվել են ցենտրիֆուգմամբ և վերասուսպենդավորվել լիզիսի բուֆերում։ Ցենտրիֆուգումից հետո նստեցված կորիզները վերասուսպենդավորվել են տրոհման բուֆերում, ինկուբացվել սառույցի վրա 30 min, իսկ քրոմատինը տրոհվել է ուլտրաձայնային մշակմամբ, օրինակ՝ օգտագործելով UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Գերմանիա)՝ 25% հզորությամբ, սառույցի վրա կիրառելով 5 իմպուլս՝ յուրաքանչյուրը 20 sec տևողությամբ, և ստանալով մոտավորապես 200–600 bp երկարությամբ հատվածներ։ Տրոհված քրոմատինն այնուհետև ցենտրիֆուգվել է, և վերնստվածքային հեղուկը հավաքվել է։ Իմունոպրեցիպիտացիաների համար 60 μl քրոմատինն ինկուբացվել է 1 μg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, ԱՄՆ), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, Միացյալ Թագավորություն) կամ NF-κB p50 (Abcam) հակամարմինների հետ կամ ճագարի IgG-ի (Zymed Laboratories) հետ՝ որպես բացասական ստուգիչ, ամբողջ գիշեր՝ 4°C պայմաններում, մեղմ պտտեցմամբ։ Մագնիսական հատիկներին կապված իմունահամալիրները հավաքվել են մագնիսական հենարանի օգնությամբ, մանրակրկիտ լվացվել, այնուհետև սպիտակուց/ԴՆԹ խաչաձև կապերը վերացվել են, իսկ ԴՆԹ-ն էլյուցվել է իրական ժամանակի ՊՇՌ վերլուծության համար։ (Ristola et al. 2009)

EHEC ԴՆԹ-ի պատրաստում՝ չիպային մատրիցի վերլուծության համար

Բջջային լիզատների և առանձնացված ԴՆԹ-ների պատրաստում
PBS լուծույթում մինչև ցանկալի վերջնական կոնցենտրացիան սուսպենդավորված բակտերիալ նստվածքները մշակվել են՝ օգտագործելով ուլտրաձայնային քայքայիչ UP100H (Hielscher GmbH, Գերմանիա), որը համալրված էր MS1 միկրոծայրակալով (1mm տրամագծով)։ Աշխատանքային հաճախականությունը 30 kHz էր, իսկ արդյունավետ ելքային հզորությունը՝ 100 W։ Մշակման ընթացքում նմուշները սառեցվել են սառույց–ջուր բաղնիքում, խառնվել և ցենտրիֆուգվել։ Նմուշներն օգտագործվել են հոսքային ցիտոմետրիայի հետազոտությունների համար, իսկ հետագա մշակման համար ենթարկվել են ջերմային մշակման (95°C, 5 min)։ Չմաքրված բջջային լիզատները մշակվել են ֆենոլ:քլորոֆորմ:իզոամիլային սպիրտ (25:24:1) խառնուրդով։ Լիզատի նմուշին ավելացվել է այս խառնուրդի հավասար ծավալ, լուծույթը 15 s ինտենսիվ խառնվել է վորտեքսով և ցենտրիֆուգվել 15 000 x g պայմաններում՝ 2 min, սենյակային ջերմաստիճանում (RT)՝ մոտ 22°C։ Գենոմային ԴՆԹ պարունակող վերին ջրային փուլը զգուշորեն առանձնացվել և հավաքվել է նոր ստերիլ Eppendorf փորձանոթում։
Այնուհետև նմուշները ենթարկվել են ուլտրաձայնային մշակման՝ ԴՆԹ-ն ֆրագմենտացնելու համար։ Ուլտրաձայնային մշակման փուլն իրականացվել է վերը նկարագրված նույն պայմաններում։ Գենոմային ԴՆԹ-ի վրա ֆրագմենտացման ազդեցությունները գնահատելու համար նմուշները վերլուծվել են ագարոզային գելային էլեկտրոֆորեզով։
(…) Նախապես 2,5 min ուլտրաձայնային մշակման ենթարկված նմուշները ջերմային մշակումից և ցենտրիֆուգումից հետո ենթարկվել են էքստրակցիայի փուլի։ Ազատված ԴՆԹ-ն երկու անգամ էքստրակցվել է ֆենոլ:քլորոֆորմ:իզոամիլային սպիրտ խառնուրդով, այնուհետև ենթարկվել երկրորդ ուլտրաձայնային մշակման՝ 0 – 15 min։ Ագարոզային գելային էլեկտրոֆորեզն օգտագործվել է էքստրակցիայից հետո ուլտրաձայնային ֆրագմենտացման ենթարկված ԴՆԹ-ի չափային բաշխումը որոշելու համար (նկարը՝ վերևի աջ կողմում)։ ԴՆԹ-ի բարձր աստիճանի ֆրագմենտացման մասին վկայում էր ԴՆԹ-ի տարածուն հետքի առկայությունը՝ բարձր մոլեկուլային զանգվածով գոտիների փոխարեն, որոնք վերացել էին 2,5 min կամ ավելի երկար ուլտրաձայնային մշակման ենթարկված նմուշներից։ Ավելի երկար ուլտրաձայնային մշակումը աստիճանաբար նվազեցրել է ֆրագմենտների երկարությունը մինչև մոտավորապես 150 – 600 bp, իսկ 15 min տևողությամբ ուլտրաձայնային մշակումն ավելի է քայքայել այս ֆրագմենտները, ինչպես երևում է հիմնականում տարածուն հետքի վերին հատվածից։ Այսպիսով, ուլտրաձայնային մշակման ժամանակի աճին զուգընթաց ԴՆԹ-ի ֆրագմենտների միջին չափն աստիճանաբար նվազել է, իսկ 5 min տևողությամբ մշակումը թույլ է տվել ստանալ ԴՆԹ-ի ֆրագմենտների այն չափերը, որոնք առավել հարմար են չիպային մատրիցներով հետազոտությունների համար։ Վերջապես, սահմանվել է ԴՆԹ անալիտի պատրաստման ընթացակարգը, որը ներառում է սկզբում 2 min ուլտրաձայնային մշակում, ԴՆԹ-ի էքստրակցիա (2×) և հետագա 5 min ուլտրաձայնային մշակում։ (Basselet et al. 2008)

Քրոմատինի իմունոպրեցիպիտացիա (ChIP)

HEK293 բջիջները կուլտիվացվել են վերը նկարագրված ձևով և ֆիքսվել 2 mM դիսուկցինիմիդիլ գլուտարատով՝ 45 min, սենյակային ջերմաստիճանում։ Այնուհետև բջիջները երկու անգամ լվացվել են PBS լուծույթով։ Քրոմատինը խաչաձև կապակցվել է 10 min՝ սենյակային ջերմաստիճանում, օգտագործելով 1% (v/v) ֆորմալդեհիդ, և երկու անգամ լվացվել սառցասառը PBS լուծույթով։ Խաչաձև կապակցման ռեակցիան դադարեցվել է գլիցինի հետ 5 min ինկուբացմամբ՝ 0,125 M վերջնական կոնցենտրացիայով, սենյակային ջերմաստիճանում։ Տրիպսինի հետ ինկուբացումից հետո բջիջները քերվել են բջջային կուլտուրայի թասից և երկու անգամ լվացվել PBS լուծույթով։ Բջջային նստվածքը կրկին սուսպենդացվել է լիզիսի բուֆերում (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl և 0,5% (v/v) Nonidet P-40), ինկուբացվել սառույցի վրա՝ 10 min, և հոմոգենացվել Dounce հոմոգենիզատորով։ Այնուհետև կորիզները նստեցվել են ցենտրիֆուգմամբ (3500 x g, 5 min, 4 °C) և կրկին սուսպենդացվել կորիզների բուֆերում (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA և 1% (w/v) SDS)։ Կորիզները քայքայվել են ուլտրաձայնային մշակմամբ՝ երեք 20-s իմպուլսներով, կիրառելով UP50H ուլտրաձայնային սարքը (Hielscher Ultraschall Technologie)՝ ցիկլի 0,5 և ամպլիտուդի 30% կարգավորումներով, ինչի արդյունքում ստացվել են գենոմային ԴՆԹ-ի ֆրագմենտներ, որոնց հիմնական մասի չափը եղել է 200 – 1000 bp։ ChIP հետազոտության համար 50g ԴՆԹ-ն նոսրացվել է 4 անգամ իմունոպրեցիպիտացիայի բուֆերում (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 և 0,01% (w/v) SDS)։ (Weiske et al. 2006)

Հիստոնների մոդիֆիկացիայի վերլուծություն քրոմատինի իմունոպրեցիպիտացիայի (ChIP) միջոցով

Համառոտ՝ 6 x 10⁶ բջիջները երկու անգամ լվացվել են PBS լուծույթով և կուլտիվացման թիթեղի վրա խաչաձև կապակցվել 15 min սենյակային ջերմաստիճանում՝ 0,5% ֆորմալդեհիդի առկայությամբ։ Խաչաձև կապակցման ռեակցիան դադարեցվել է՝ ավելացնելով 0,125 M գլիցին։ Հետագա բոլոր քայլերն իրականացվել են 48°C ջերմաստիճանում։ Բոլոր բուֆերները նախապես սառեցվել են և պարունակել են պրոտեազների ինհիբիտորներ (Complete Mini, Roche)։ Բջիջները երկու անգամ լվացվել են PBS լուծույթով, ապա քերվել։ Հավաքված նստվածքները լուծվել են 1 ml լիզիսի բուֆերում (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) և սառը էթանոլային բաղնիքում ենթարկվել ուլտրաձայնային մշակման՝ 10 ցիկլով, 100% ամպլիտուդով՝ օգտագործելով UP50H ուլտրաձայնային սարքը (Hielscher, Տելտով, Գերմանիա)։ Քրոմատինի ֆրագմենտացումը տեսանելի է դարձվել 1% ագարոզային գելում։ Ստացված ֆրագմենտների չափերը եղել են 200–500pb միջակայքում։ Լուծելի քրոմատին ստացվել է՝ ուլտրաձայնով մշակված նմուշները ցենտրիֆուգելով 14 000g պայմաններում՝ 10 min, 48°C ջերմաստիճանում։ Լուծելի ֆրակցիան նոսրացվել է 1/10 հարաբերությամբ նոսրացման բուֆերում (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), ապա բաժանվել առանձին չափաբաժինների և պահվել 80°C ջերմաստիճանում մինչև օգտագործումը։ (Rodriguez et al. 2008)