Ուլտրաձայնային նմուշի պատրաստում ELISA վերլուծության համար
ELISA-ի նման անալիզները լայնորեն օգտագործվում են in vitro ախտորոշման, հիվանդությունների հետ կապված սպիտակուցների հայտնաբերման և որակի վերահսկման համար (օրինակ՝ սննդային ալերգենների մոնիտորինգ): Ուլտրաձայնային նմուշի պատրաստումը արագ, հուսալի և վերարտադրելի տեխնիկա է բջիջների լիզման և ներբջջային սպիտակուցների, ԴՆԹ-ի, ՌՆԹ-ի և օրգանելների մեկուսացման համար: Hielscher Ultrasonics-ն առաջարկում է տարբեր ուլտրաձայնային լուծումներ առանձին նմուշների, բազմաթիվ սրվակների, ինչպես նաև միկրոտիտրային թիթեղների և 96 ջրհորի թիթեղների հարմար պատրաստման համար:
ԷԼԻԶԱ – Ֆերմենտների հետ կապված իմունոսորբենտային վերլուծություն
ELISA-ն նշանակում է ֆերմենտային կապակցված իմունոսորբենտ վերլուծություն և հանդիսանում է լիգանդ կապող անալիզների կատեգորիայի կենսաքիմիական վերլուծության լայնորեն օգտագործվող տեխնիկա: ELISA-ում հեղուկ նմուշը ավելացվում է հատուկ կապող հատկություններով անշարժ պինդ փուլի վրա: Սովորաբար, ստացիոնար պինդ փուլը կիրառվում է որպես ծածկույթ ջրհորի ափսեի կամ ELISA ափսեի վրա: Այնուհետև տարբեր հեղուկ ռեակտիվներ հաջորդաբար ավելացվում են, ինկուբացվում և լվանում, որպեսզի վերջապես օպտիկական փոփոխություն (օրինակ՝ գույնի զարգացում ֆերմենտային ռեակցիայի արդյունքով) տեղի ունենա ջրհորի վերջնական հեղուկում: Օպտիկական փոփոխությունը թույլ է տալիս չափել անալիտի քանակը այսպես կոչված քանակականով “ընթերցանություն»: Քանակական ընթերցման համար օգտագործվում է սպեկտրոֆոտոմետր, ֆտորոմետր կամ լուսաչափ՝ հաղորդվող լույսի ինտենսիվությունը հայտնաբերելու և չափելու համար։ Հայտնաբերման զգայունության վրա ազդում է ազդանշանի ուժեղացումը անալիտիկ ռեակցիաների ժամանակ։ Քանի որ ֆերմենտային ռեակցիաները լավ ուսումնասիրված են և հուսալի ուժեղացման գործընթացներ, ազդանշան ստեղծելու համար օգտագործվում են ֆերմենտներ: Ֆերմենտները ֆիքսված համամասնություններով կապված են հայտնաբերման ռեագենտների հետ՝ ճշգրիտ քանակական գնահատումը թույլ տալու համար, ինչը բացատրում է նաև «ֆերմենտային կապակցված» իմունոսորբենտային անալիզ անվանումը:
Քանի որ ELISA-ի անալիզները կատարվում են միկրոտիտրային թիթեղներում / 96 հորատանցքի ափսեներում, այն հայտնի է որպես ափսեի վրա հիմնված վերլուծության տեխնիկա և օգտագործվում է օրինակ՝ կլինիկական in vitro ախտորոշման, հետազոտության, դեղամիջոցների մշակման և այլնի մեջ՝ հակամարմինների, պեպտիդների, սպիտակուցների հայտնաբերման և քանակականացման համար, և հորմոններ:
ELISA տեխնիկան հաճախ օգտագործվում է որպես ախտորոշիչ գործիք բժշկության, կենսատեխնոլոգիայի, բույսերի պաթոլոգիայում և նաև որակի վերահսկման կարևոր չափում է բազմաթիվ ոլորտներում:
Ուլտրաձայնային նմուշի պատրաստման միավոր VialTweeter օգտագործվում է բջիջների լիզի և սպիտակուցի արդյունահանման համար ELISA վերլուծությունից առաջ
Ուլտրաձայնային նմուշի պատրաստում ELISA-ից առաջ
Նախքան ELISA վերլուծությունը կատարելը, նմուշները պահանջում են նախապատրաստման քայլեր, ինչպիսիք են բջիջների լիզումը և ներբջջային սպիտակուցների, ԴՆԹ-ի, ՌՆԹ-ի և այլնի արդյունահանումը: Բջջի ուլտրաձայնային լիզի և սպիտակուցի մեկուսացման առավելությունը դրա բարձր արդյունավետությունն է, հուսալիությունը և վերարտադրելիությունը: Այս բոլոր գործոնները կարևոր են բարձրորակ ախտորոշման և հետազոտության արդյունքների հասնելու համար
- Նմուշի համասեռ բուժում
- Ամբողջական լիզս
- Սպիտակուցների ամբողջական արդյունահանում (օրինակ՝ հակամարմիններ, ԴՆԹ)
- Օպտիմալ հարմարեցում բջջային տեսակին
- Ցանկացած նմուշի չափի համար
- վերարտադրելի
- ջերմաստիճանի վերահսկում
- Տվյալների ավտոմատ արձանագրում SD-քարտի վրա
Արձանագրություն Pre-ELISA-ի ուլտրաձայնային բջիջների լիզիսի համար
- Բջջային կուլտուրաների համար. Նախքան ուլտրաձայնային բջիջների լիզումը, ցենտրիֆուգեք բջիջները 5 րոպե 270 xg-ով միկրոցենտրիֆուգայում: Հեռացրեք վերին նյութը ասպիրացիայի միջոցով և նորից կասեցրեք բջիջները 30-100 մկլ RIPA բուֆերի մեջ: Այնուհետև 30 րոպե ինկուբացրեք բջջային գնդիկը սառույցի վրա:
- Այժմ բջջի նմուշը պատրաստ է ուլտրաձայնային լուծարման.
Օգտագործեք զոնդի տիպի ուլտրաձայնային սարք (օրինակ UP200Ht S26d2 զոնդով) կամ ուլտրաձայնային բազմակի նմուշառման սարք (օրինակ՝ VialTweeter՝ մինչև 10 սրվակի միաժամանակյա ձայնագրման համար կամ UIP400MPT միկրոտիտրային թիթեղների / 96 ջրհորի թիթեղների համար) կախված նմուշների քանակից, որոնք դուք պետք է պատրաստեք:
Մեկ նմուշի զոնդային տիպի ձայնագրման համար բջիջները տեղադրեք 1,5 մլ միկրոցենտրիֆուգային խողովակների մեջ: - Ուլտրաձայնային սարքի թվային ընտրացանկում նախապես սահմանեք ձեր ուլտրաձայնային տևողությունը, ընդհանուր էներգիայի մուտքագրումը, ցիկլի ռեժիմը և/կամ ջերմաստիճանի սահմանները: Սա ապահովում է բարձր հուսալի հնչյունավորում և կրկնելիություն:
- Տեղադրեք sonotrode-ը և միացրեք ուլտրաձայնային սարքը: Մեղմորեն տեղափոխեք ուլտրաձայնային զոնդի միկրո ծայրը նմուշի միջով՝ նմուշը միատեսակ հնչյունավորելու համար:
Բջիջների մեծ մասի համար ուլտրաձայնային լիզը կավարտվի 10 վայրկյան տեւողությամբ 2-4 ցիկլից հետո: - Հետո sonication, հեռացնել sonotrode նմուշի. Նմուշները պետք է ինկուբացվեն սառույցի վրա 5 րոպե: Այնուհետև ցենտրիֆուգեք 10,000 xg-ով 20 րոպե՝ բեկորները գնդիկավորելու համար: Վերցրած նյութերը տեղափոխեք նոր միկրոցենտրիֆուգային խողովակի մեջ: Նշեք անալիտները և պահեք -20°C ջերմաստիճանում:
- Ուլտրաձայնային սոնոտրոդը կարելի է մաքրել՝ այն պատշաճ կերպով սրբելով սպիրտով կամ սպիրտով լցված բաժակի մեջ, օրինակ՝ 70% էթանոլով: Բոլոր ուլտրաձայնային զոնդերը, որոնք պատրաստված են տիտանից, կարող են ավտոկլավացվել:
E.coli բջիջներից սպիտակուցի արդյունահանում ուլտրաձայնային զոնդ UP200St
- Լվացեք հյուսվածքը սառցե PBS-ով (0,01 Մ, pH=7,4)՝ հեմոլիզային ավելցուկային արյունը մանրակրկիտ հեռացնելու համար:
- Կշռեք հյուսվածքը (երիկամ, սիրտ, թոքեր, փայծաղ և այլն) և թրմեք այն փոքր կտորների, որոնք համասեռացված են PBS-ում: Պահանջվող PBS-ի ծավալը կապված է հյուսվածքի քաշի հետ: Որպես կանոն, 1 գ հյուսվածքի համար պահանջվում է մոտ. 9 մլ PBS: Խորհուրդ է տրվում PBS-ին ավելացնել պրոթեզերոնի որոշ ինհիբիտոր: (RIPA կամ հիպոտոնիկ լիզի բուֆեր, որը պարունակում է պրոթեզերոն և ֆոսֆատազի ինհիբիտոր կոկտեյլ, կարող է օգտագործվել որպես այլընտրանքային տարբերակ):
- Կախված հյուսվածքի չափից, կարճ պտույտային բուժումը (մոտ 1-2 րոպե 15 վրկ. իմպուլսներում) կարող է օգտակար լինել հյուսվածքի նախնական մշակման համար:
- Տեղադրեք միկրո ծայրը, օրինակ՝ S26d2, ձեր ուլտրաձայնային սարքին: Նմուշի խողովակը հյուսվածքի հետ դրեք սառցե լոգարանում:
- Նմուշը արտաձայնացրեք ձեր ուլտրաձայնային սարքով, օրինակ՝ UP200St (80% ամպլիտուդ) 1 րոպեով: զարկերակային ռեժիմում (15 վայրկյան միացված, 15 վայրկյան դադար): Նմուշը պահեք սառցե լոգարանում:
- Այնուհետև հոմոգենատները ցենտրիֆուգվում են՝ ստանալով հատուկ լողավազաններ (ցիտոզոլային, միջուկային, միտոքոնդրիալ կամ լիզոսոմային)՝ վերլուծության համար սպիտակուցը հարստացնելու նպատակով: Նմուշը 5 րոպե 5000×g-ով ցենտրիֆուգելով՝ վերցված նյութը դուրս է բերվում:
Sonotrode MTP-24-8-96-ն ունի ութ ուլտրաձայնային զոնդ միկրոտիտրային թիթեղների հորերի sonication-ի համար:
Ջերմաստիճանի հուսալի վերահսկում Sonication-ի ժամանակ
Ջերմաստիճանը գործընթացի վրա ազդող կարևոր գործոն է, որը հատկապես կարևոր է կենսաբանական նմուշների մշակման համար, օրինակ՝ սպիտակուցների ջերմային քայքայումը կանխելու համար: Ինչպես բոլոր մեխանիկական նմուշների պատրաստման մեթոդները, այնպես էլ sononication-ը ջերմություն է ստեղծում: Այնուամենայնիվ, նմուշների ջերմաստիճանը կարելի է լավ վերահսկել Hielscher Ultrasonics սարքերի օգտագործման ժամանակ: Մենք ձեզ ենք ներկայացնում տարբեր տարբերակներ՝ վերահսկելու և վերահսկելու ձեր նմուշների ջերմաստիճանը, մինչ դրանք պատրաստվում են զոնդի տիպի ուլտրաձայնային սարքի կամ VialTweeter-ի հետ նախավերլուծական եղանակով:
- Նմուշի ջերմաստիճանի մոնիտորինգ. Բոլոր Hielscher թվային ուլտրաձայնային պրոցեսորները հագեցած են խելացի ծրագրաշարով և խցանվող ջերմաստիճանի սենսորով: Միացրեք ջերմաստիճանի ցուցիչը ուլտրաձայնային սարքի մեջ (օրինակ. UP200Ht, UP200 St, VialTweeter, Բազմաբխային ափսեի ձայնային սարք UIP400MTP) և տեղադրեք ջերմաստիճանի սենսորի ծայրը նմուշի խողովակներից մեկում: Թվային գունավոր սենսորային էկրանի միջոցով դուք կարող եք ուլտրաձայնային պրոցեսորի ընտրացանկում սահմանել հատուկ ջերմաստիճանի միջակայք ձեր նմուշի ձայնային ախտահանման համար: Ուլտրաձայնային սարքը ավտոմատ կերպով կդադարի, երբ առավելագույն ջերմաստիճանը հասնի և կդադարի մինչև նմուշի ջերմաստիճանը իջնի սահմանված ջերմաստիճանի Δ-ի ցածր արժեքին: Այնուհետև նորից ինքնաբերաբար կսկսվի ձայնագրումը: Այս խելացի հատկությունը կանխում է ջերմային դեգրադացիան:
- Ինչ վերաբերում է VialTweeter-ի ուլտրաձայնային բազմատեսակ միավորին, ապա տիտանի բլոկը, որը պահում է նմուշի խողովակները, կարող է նախապես հովացվել: Տեղադրեք VialTweeter բլոկը (միայն sonotrode-ն առանց փոխարկիչի!) սառնարանի կամ սառնարանի մեջ, որպեսզի նախապես հովացվի տիտանի բլոկը, որն օգնում է հետաձգել ջերմաստիճանի բարձրացումը նմուշում: Հնարավորության դեպքում, նմուշն ինքնին կարող է նաև նախապես սառեցնել:
- Օգտագործեք սառցե բաղնիք կամ չոր սառույց, որպեսզի սառչի ձայնային ախտահանման ժամանակ: Տեղադրեք ձեր նմուշի խողովակը (ներ)ը սառցե լոգանքի մեջ: VialTweeter-ի համար օգտագործեք մակերեսային սկուտեղ, որը լցված է չոր սառույցով և տեղադրեք VialTweeter-ը չոր սառույցի վրա, որպեսզի ջերմությունը արագորեն ցրվի:
Ողջ աշխարհում հաճախորդները օգտագործում են Hielscher զոնդի տիպի ուլտրաձայնային սարքերը, ինչպես նաև VialTweeter և UIP400MTP բազմակի նմուշների ձայնային ապարատները կենսաբանական, կենսաքիմիական, բժշկական և կլինիկական լաբորատորիաներում նմուշների պատրաստման ամենօրյա աշխատանքի համար: Hielscher պրոցեսորների խելացի ծրագրակազմը և ջերմաստիճանի վերահսկումը, ջերմաստիճանը հուսալիորեն վերահսկվում է և խուսափում է շոգից առաջացած նմուշի քայքայումից: Ուլտրաձայնային նմուշի պատրաստումը Hielscher ուլտրաձայնային լուծույթներով ապահովում է բարձր հուսալի և վերարտադրելի արդյունքներ:
Կարդացեք ավելին բարձր թողունակության ձայնագրման մասին, օգտագործելով բազմաբնակարան ափսեի ձայնագրիչ UIP400MTP վերլուծությունների համար:
Կապ մեզ հետ: / Հարցրեք մեզ:
Hielscher Ultrasonics-ը արտադրում է բարձր արդյունավետության ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորներ՝ լաբորատոր, փորձնական և արդյունաբերական մասշտաբով կիրառական կիրառությունների խառնուրդի, ցրման, էմուլսացման և արդյունահանման համար:
Գրականություն / Հղումներ
- Brandy Verhalen , Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed. Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
Փաստեր, որոնք արժե իմանալ
ELISA-ի ի՞նչ տեսակներ կան:
Գոյություն ունեն ELISA-ի մի քանի տեսակներ, որոնք առանձնանում են իրենց գործելու սկզբունքով։ Դրանք հայտնի են որպես ուղղակի ELISA, անուղղակի ELISA, սենդվիչ ELISA, մրցակցային ELISA և reverse ELISA: Ստորև ձեզ ենք ներկայացնում ELISA-ի տարբեր տեսակների և դրանց հիմնական բնութագրերի ու տարբերությունների ակնարկ:
ELISA-ն կարող է իրականացվել որակական կամ քանակական ձևաչափով: Որակական արդյունքները տալիս են պարզ դրական կամ բացասական արդյունք, մինչդեռ քանակական ELISA-ում նմուշի օպտիկական խտությունը (OD) համեմատվում է ստանդարտ կորի հետ, որը սովորաբար թիրախային մոլեկուլի հայտնի կոնցենտրացիայի լուծույթի սերիական նոսրացում է:
Ուղղակի ELISA
Ուղղակի ELISA-ն Elisa-ի ամենապարզ փորձարկման ձևն է, որտեղ օգտագործվում է միայն ֆերմենտով պիտակավորված առաջնային հակամարմին, և երկրորդական հակամարմիններ չեն պահանջվում: Ֆերմենտով պիտակավորված առաջնային հակամարմինը ուղղակիորեն կապվում է թիրախին, այսինքն՝ անտիգենին: Բուֆերացված հակագենի լուծույթը ավելացվում է միկրոտիտրային ափսեի յուրաքանչյուր հորին (սովորաբար 96 հորատանցք ունեցող թիթեղներ, ELISA-ափսեներ), որտեղ լիցքի փոխազդեցության միջոցով կպչում է պլաստիկ մակերեսին: Երբ առաջնային հակամարմինի հետ կապված ֆերմենտը արձագանքում է իր սուբստրատի հետ, այն արտադրում է տեսանելի ազդանշան, որը կարող է չափվել սպեկտրոֆոտոմետրի, ֆտորոմետրի կամ լուսաչափի միջոցով։
Անուղղակի ELISA
Անուղղակի ELISA թեստի համար անհրաժեշտ է և՛ առաջնային, և՛ երկրորդական հակամարմին: Այնուամենայնիվ, ի տարբերություն ուղղակի ELISA-ի, ոչ թե առաջնային հակամարմինը, այլ երկրորդական հակամարմինը պիտակավորված է ֆերմենտով: Հակագենը անշարժացված է ջրհորի թիթեղին և կապված է առաջնային հակամարմինով: Հետագայում ֆերմենտով պիտակավորված երկրորդական հակամարմինը կապվում է առաջնային հակամարմինին: Ի վերջո, երկրորդական հակամարմինի հետ կապված ֆերմենտը արձագանքում է իր սուբստրատի հետ՝ արտադրելով տեսանելի ազդանշան, որը հնարավոր է հայտնաբերել:
Սենդվիչ ELISA
Մինչ ուղղակի և անուղղակի ELISA թեստերի ժամանակ անտիգենը անշարժացված է և պատված է ջրհորի ափսեի մակերեսին, սենդվիչ ELISA-ում հակամարմինը անշարժացված է ELISA-ափսեի պլաստիկ մակերեսին: Սենդվիչ ELISA-ում անշարժացված հակամարմինները հայտնի են որպես գրավման հակամարմիններ: Ի լրումն գրավման հակամարմինների, սենդվիչ ELISA-ում պահանջվում են նաև այսպես կոչված հայտնաբերման հակամարմիններ: Հայտնաբերող հակամարմինները ներառում են չպիտակավորված առաջնային հայտնաբերման հակամարմիններ և ֆերմենտներով պիտակավորված երկրորդային հայտնաբերման հակամարմիններ:
Քայլ առ քայլ, հետաքրքրող անտիգենը կապվում է թիթեղին անշարժացված գրավման հակամարմինին: Այնուհետև առաջնային հայտնաբերման հակամարմինը կապվում է անտիգենին: Այնուհետև երկրորդային հայտնաբերման հակամարմինը կապվում է առաջնային հայտնաբերման հակամարմինին: Ռեակցիայի վերջին փուլում ֆերմենտը փոխազդում է իր սուբստրատի հետ՝ արտադրելով տեսանելի ազդանշան, որը կարելի է հայտնաբերել օպտիկական եղանակով:
Մրցակցային ELISA
Մրցակցային ELISA-ն, որը նաև հայտնի է որպես արգելակման ELISA, ամենաբարդ ELISA տեսակն է, քանի որ այն ներառում է արգելակիչ հակագենի օգտագործումը: Երեք ձևաչափերից յուրաքանչյուրը՝ ուղղակի, անուղղակի և սենդվիչ ELISA, կարող է հարմարվել մրցակցային ELISA ձևաչափին: Մրցակցային ELISA-ում արգելակիչ անտիգենը և հետաքրքրող անտիգենը մրցում են առաջնային հակամարմինին կապվելու համար:
Մրցակցային ELISA-ի համար չպիտակավորված հակամարմինը ինկուբացվում է իր անտիգենի, այսինքն՝ նմուշի առկայության դեպքում: Այս կապակցված հակամարմինների/հակագենի համալիրներն այնուհետև ավելացվում են հակագենով պատված ջրհորի մեջ:
Թիթեղը լվանում են, որպեսզի չկապված հակամարմինները հեռացվեն։ Մրցակցային ELISA-ն ստացել է իր անվանումը` պայմանավորված նրանով, որ որքան շատ հակագեն կա նմուշում, այնքան ավելի շատ հակագեն-հակամարմին բարդույթներ են ձևավորվում: Սա նշանակում է, որ ավելի քիչ չկապված հակամարմիններ կան ջրհորի հակագենին միանալու համար, և անտիգենները պետք է մրցեն հասանելի հակամարմինների համար: Ավելացվում է երկրորդական հակամարմին, որը համապատասխանում է առաջնային հակամարմինին: Այս երկրորդ հակամարմինը կապված է ֆերմենտի հետ: Երբ ենթաշերտը ավելացվում է, մնացած ֆերմենտները արտադրում են քրոմոգեն կամ լյումինեսցենտ ազդանշան:
Այս պահին ռեակցիան դադարեցվում է ազդանշանի վերջնական հագեցվածությունից խուսափելու համար:
Որոշ մրցակցային ELISA փաթեթներ ներառում են ֆերմենտի հետ կապված հակագեն՝ ֆերմենտի հետ կապված հակամարմինի փոխարեն: Նշված հակագենը մրցում է հակամարմինների կապող առաջնային վայրերի համար նմուշի անտիգենի հետ (չպիտակավորված): Որքան քիչ հակագեն է նմուշում, այնքան ավելի պիտակավորված հակագեն է պահվում ջրհորի մեջ և այնքան ուժեղ է ազդանշանը:
Հակադարձ ELISA
Reverse ELISA-ն չի օգտագործում ջրհորի թիթեղները, այլ թողնում է անտիգենները կախված փորձարկման հեղուկում: Հակադարձ ELISA թեստը չափում է կապված հակամարմինների քանակը հակագենի միջոցով: Այն մշակվել է հատուկ՝ հայտնաբերելու և հետազոտելու Արևմտյան Նեղոսի վիրուսի ծրարի սպիտակուցը և ինչպես է այն կարողանում գտնել վիրուսին հատուկ հակամարմիններ:
Ո՞ր ֆերմենտային մարկերներն են օգտագործվում ELISA-ի համար:
Ստորև բերված ցանկը տալիս է ELISA-ի անալիզներում օգտագործվող ամենատարածված ֆերմենտային մարկերները, որոնք թույլ են տալիս չափել վերլուծության արդյունքները ավարտից հետո:
- OPD (օ-ֆենիլենդիամին դիհիդրոքլորիդ) վերածվում է սաթի՝ հայտնաբերելու HRP (Ծովաբողկի պերօքսիդազը), որը հաճախ օգտագործվում է որպես զուգակցված սպիտակուց:
- TMB (3,3′,5,5′-տետրամեթիլբենզիդին) կապույտ է դառնում HRP-ի հայտնաբերման ժամանակ և դառնում դեղին ծծմբական կամ ֆոսֆորաթթվի ավելացումից հետո:
- ABTS (2,2′-Ազինոբիս [3-էթիլբենզոթիազոլին-6-սուլֆոնաթթու]-դիամոնիումի աղ) դառնում է կանաչ, երբ հայտնաբերում է HRP:
- PNPP (p-Nitrophenyl Phosphate, Disodium Salt) դեղին է դառնում ալկալային ֆոսֆատազը հայտնաբերելիս: