Drosophila Melanogaster նմուշների ուլտրաձայնային լիզիսը

Drosophila melanogaster-ը լայնորեն կիրառվում է լաբորատորիաներում՝ որպես օրինակելի օրգանիզմ։ Հետևաբար, Drosophila melanogaster-ի նմուշների նախավերլուծական պատրաստման քայլերը, ինչպիսիք են լիզիսը, բջիջների խանգարումը, սպիտակուցի արդյունահանումը և ԴՆԹ-ի կտրումը, պետք է հաճախակի իրականացվեն: Ուլտրաձայնային դիմեմբրատորները հուսալի և արդյունավետ են և կարող են օգտագործվել տարբեր առաջադրանքներ կատարելու համար, ինչպիսիք են լիզիսը, սպիտակուցի արդյունահանումը կամ ԴՆԹ-ի մասնատումը հեշտությամբ՝ միայն կարգավորելով ուլտրաձայնային գործընթացի պարամետրերը: Ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորներն այսպիսով ճկուն գործիքներ են՝ կիրառությունների լայն շրջանակով:

Ուլտրաձայնային լիզի և սպիտակուցի արդյունահանում

Լիզիսը, բջիջների լուծարումը, հյուսվածքների համասեռացումը և սպիտակուցի արդյունահանումը բնորոշ առաջադրանքներ են կենսաբանական լաբորատորիաներում ուլտրաձայնային դիմեմբրատորների համար: Ուլտրաձայնային դիզեմբրատորները և բջիջները խանգարող սարքերը հարմար են կենդանիների հյուսվածքների, միջատների (օրինակ՝ Drosophila melanogaster, C. elegans) կամ բույսերի նմուշների համասեռացման համար: Ultrasonication-ի հետագա կիրառությունները բջջային կասեցումների և գնդիկների լիզումն են, ինչպես նաև ներբջջային սպիտակուցների արդյունահանումը:
Ուլտրաձայնային լիզը և սպիտակուցի արդյունահանումը բարձր հուսալի և վերարտադրելի գործընթացներ են, որոնք կարող են իրականացվել սահմանված արձանագրությունների հիման վրա: Քանի որ ուլտրաձայնային պրոցեսի ինտենսիվությունը կարող է ճշգրտորեն ճշգրտվել ձայնային ազդանշանի պարամետրերի միջոցով, ինչպիսիք են ամպլիտուդը, ցիկլը / զարկերակային ռեժիմը, ջերմաստիճանը և նմուշի ծավալը, ապացուցված արձանագրությունները կարող են կրկնվել նույն արդյունքով կրկին ու կրկին:

Ուլտրաձայնային ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի մասնատում

Բջիջների լիզից և սպիտակուցի արդյունահանումից հետո նմուշի պատրաստման ընդհանուր պահանջվող քայլը ԴՆԹ-ի, ՌՆԹ-ի և քրոմատինի կտրումն ու մասնատումն է, օրինակ՝ մինչև քրոմատինի իմունային նստվածքը (ChIP): ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի մասնատումը կարելի է հուսալիորեն հասնել՝ կոտրելով կովալենտային կապերը, որոնք ԴՆԹ-ն միասին են պահում ֆիզիկական ուժերի միջոցով: Օգտագործելով ֆիզիկական կտրում, ինչպիսին է ձայնային ախտորոշումը, սկզբում ԴՆԹ-ի շղթաները կոտրվում են, այնուհետև ԴՆԹ-ն մասնատվում է ավելի փոքր կտորների:
Ուլտրաձայնային ԴՆԹ-ի մասնատումը հուսալի և արդյունավետ է ԴՆԹ-ի նպատակային երկարության կտրման համար, օրինակ՝ 500 bp (բազային զույգեր): Ուլտրաձայնային ԴՆԹ-ի մասնատման հիմնական առավելությունները ներառում են ուլտրաձայնային գործընթացի պարամետրերի և ինտենսիվության ճշգրիտ վերահսկումը: Ուլտրաձայնային գործընթացի պարամետրերը կարող են ճշգրտվել՝ ճշգրտորեն կարգավորելով sonication ինտենսիվությունը, ցիկլերը և ժամանակը: Սա հնարավորություն է տալիս ստեղծել ցանկալի ԴՆԹ չափեր, և թիրախավորված ԴՆԹ երկարությունը կարող է հուսալիորեն արտադրվել, ինչպես նաև վերարտադրվել: ԴՆԹ-ի ուլտրաձայնային կտրումը նույնպես իդեալական է բարձր մոլեկուլային քաշով ԴՆԹ-ի բեկորներ ստեղծելու համար:

Արձանագրություններ Drosophila melanogaster-ի ուլտրաձայնային լիզիսի համար

Ստորև կարող եք գտնել տարբեր արձանագրություններ ուլտրաձայնային օգնությամբ լիզի, սպիտակուցի արդյունահանման և Drosophila-ի նմուշների ԴՆԹ-ի կամ քրոմատինի մասնատման համար:

Ուլտրաձայնային լիզիս՝ խաչաձև կապող իմունոպրեցիպիտացիայի համար (CLIP) վերլուծություն

CLIP վերլուծությունը կատարվել է ինչպես նախկինում հաղորդվել է որոշ փոփոխություններով: Մոտավորապես 20 մգ ձվարաններ 0-ից 1 օրական վայրի տիպի էգերից ուլտրամանուշակագույն ճառագայթման խաչաձեւ կապով (3 × 2000 μJ/cm2), սառույցի վրա համասեռացված էին 1 մլ RCB բուֆերում (50 մՄ HEPES pH 7,4, 200 մՄ NaCl, 2,5 մՄ): MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM սախարոզա, 1 mM DTT, 1× EDTA-free Complete Protease Inhibitors, 1 mM PMSF) լրացված 300 U RNAseOUT-ով և դրված սառույցի վրա 30 րոպե: Համասեռացված նյութը սառույցի վրա ձայնագրվել է 80% հզորությամբ, հինգ անգամ 20 վայրկյանում 60 վայրկյան դադարով, օգտագործելով Hielscher ուլտրաձայնային պրոցեսորը: UP100H (100 Վտ, 30 կՀց) և ցենտրիֆուգվել (16000 × գ 5 րոպե 4°C-ում): Լուծվող էքստրակտը նախապես մաքրվել է 20 մկլ Protein-G-ի դինաբիլներով 20 րոպե 4°C-ում: Իմունոբլոթինգի և ՌՆԹ ներածման քանակականացման համար նմուշների հեռացումից հետո (1%), HP1-ը իմունոպրեցիպիտացվել է հակա-HP1 9A9 հակամարմինով 450 մկլ նախապես մաքրված էքստրակտից՝ 4 ժամ ինկուբացիայի միջոցով 50 մկլ Protein-G դինաբիազներով: Իմունային նստվածքները լվացվել են 4 անգամ RCB-ով: Իմունոպրեցիպիտացված ՌՆԹ-ները մաքրելու համար գնդիկավոր ուլունքները եփեցին 100 μL UltraPure DEPC-ով մշակված ջրի մեջ 5 րոպե: 900 μL Qiazol ռեագենտ ավելացվել է ՌՆԹ-ի պատրաստման համար վերականգնված վերին նյութին: Մաքրված ՌՆԹ-ն օգտագործվել է որպես կաղապար՝ cDNA սինթեզելու համար՝ օգտագործելով օլիգո dT, պատահական հեքսամերներ և SuperScript հակադարձ տրանսկրիպտազ III՝ ըստ արտադրողի արձանագրության:
(Cassale et al. 2019)

Ուլտրաձայնային լիզի քրոմատինի իմունային նստվածքների վերլուծության համար

Քրոմատինային իմունային նստվածքը կատարվել է Մենետի նկարագրած մեթոդի համաձայն՝ չնչին փոփոխություններով: Մոտավորապես 20 մգ ձվարաններ 0-ից 1 օրական վայրի տիպի էգերից միատարրացվել են 1 մլ NEB բուֆերի մեջ (10 մՄ HEPES-Na pH 8.0, 10 մՄ NaCl, 0.1 մՄ EGTA-Na pH 8, 0.5 մ մ. EDTA-Na pH 8, 1 մՄ DTT, 0,5% NP-40, 0,5 մՄ սպերմիդին, 0,15 մՄ սպերմին, 1 × EDTA-ազատ ամբողջական պրոթեզերոնի արգելակիչներ)՝ հոմոգենիզատորով / ընկղմման ցրիչով 1 րոպե (3000 պտ/րոպում): Համասեռացված նյութը տեղափոխվում է նախապես սառեցված ապակյա թմբուկի մեջ և 15 ամբողջական հարվածներ են կիրառվում ամուր մուրճով: Այնուհետև ազատ միջուկները ցենտրիֆուգվել են 6000xg-ով 10 րոպե 4°C-ում: Միջուկներ պարունակող գնդիկները նորից կասեցվել են 1 մլ NEB-ում և ցենտրիֆուգվել 20000 × գ 20 րոպեում սախարոզա գրադիենտի վրա (0,65 մլ 1,6 մ սախարոզա NEB-ում, 0,35 մլ 0,8 մ սախարոզա NEB-ում): Գնդիկը կրկին կասեցվել է 1 մլ NEB-ի և ֆորմալդեհիդի մեջ մինչև 1% վերջնական կոնցենտրացիան: Միջուկները խաչաձեւ կապակցվել են 10 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում և մարել՝ ավելացնելով 1/10 vol 1,375 M գլիցին: Միջուկները հավաքվել են ցենտրիֆուգմամբ 6000 × գ 5 րոպեի ընթացքում: Միջուկները երկու անգամ լվացվեցին 1 մլ NEB-ով և նորից կասեցվեցին 1 մլ լիզի բուֆերի մեջ (15 մՄ HEPES-Na pH 7.6, 140 մՄ NaCl, 0.5 մՄ EGTA, 1 մՄ EDTA pH 8, 1% Triton X-100, 0: mM DTT, 0.1% Na deoxycholate, 0.1% SDS, 0.5% N-lauroylsarcosine և 1× EDTA-ազանց ամբողջական պրոթեզերոնի ինհիբիտորներ): Միջուկները հնչյունավորվել են Hielscher ուլտրաձայնային պրոցեսորի միջոցով UP100H (100 Վտ, 30 կՀց) վեց անգամ 20 վրկ և 1 րոպե սառույցի վրա: Sonicated միջուկները ցենտրիֆուգվել են 13000 × g 4 րոպե 4 ° C-ում: Հնչեցված քրոմատինի մեծ մասը կազմում էր 500-ից 1000 բազային զույգ (bp) երկարություն: Յուրաքանչյուր իմունային նստվածքի համար 15 մկգ քրոմատին ինկուբացվել է 10 մկգ HP1 9A9 մոնոկլոնալ հակամարմինի առկայության դեպքում (3 ժամ 4°C-ում պտտվող անիվում): Այնուհետև ավելացվել է 50 մկլ դինաբիադների սպիտակուց G և ինկուբացիան շարունակվել է գիշերվա ընթացքում 4°C-ում: Սուպերնատենտները դեն նետվեցին և նմուշները երկու անգամ լվացվեցին Lysis բուֆերում (յուրաքանչյուր լվացում 15 րոպե 4 °C-ում) և երկու անգամ TE բուֆերում (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl pH 8-ում): Քրոմատինը ուլունքներից մաքրվել է երկու քայլով. առաջինը 100 մկլ Eluition Buffer 1-ում (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl pH 8-ում) 65°C-ում 15 րոպեի ընթացքում, որին հաջորդում է ցենտրիֆուգումը և վերին նյութի վերականգնումը: Բշտիկների նյութը կրկին արդյունահանվել է 100 մկլ TE + 0,67% SDS-ում: Համակցված էլուատը (200 մկլ) ինկուբացվել է գիշերվա ընթացքում 65°C-ում՝ խաչաձև կապերը փոխելու համար և մշակվել 50 μg/ml RNaseA-ով 15 րոպե 65°C-ում և 500 μg/ml Proteinase K-ով 3 ժամ 65°C-ում: Նմուշները արդյունահանվել են ֆենոլ-քլորոֆորմ և նստեցվել էթանոլով: ԴՆԹ-ն կրկին կասեցվել է 25 մկլ ջրի մեջ: Մոլեկուլային անալիզները առավելագույնի հասցնելու համար իմունոպրեցիպիտացված ԴՆԹ-ով թեկնածու գեները զույգերով ուժեղացվել են օպտիմիզացված դուպլեքս-PCR արձանագրության միջոցով՝ օգտագործելով պրայմերների երկու տարբեր խմբեր, որոնք ունեն հալման նույն ջերմաստիճան մեկ ռեակցիայում:
(Casale et al. 2019)
 

Բարձր արդյունավետության ուլտրաձայնային բջիջների խանգարիչներ կենսաբանական նմուշների համար

Hielscher Ultrasonics-ը ձեր երկարամյա գործընկերն է, երբ խոսքը վերաբերում է բարձր արդյունավետությամբ ուլտրաձայնային սարքերին բջիջների խզման, լիզիսի, սպիտակուցի արդյունահանման, ԴՆԹ-ի, ՌՆԹ-ի և քրոմատինի մասնատման, ինչպես նաև նմուշի պատրաստման այլ նախավերլուծական քայլերի համար: Առաջարկելով ուլտրաձայնային լաբորատոր հոմոգենիզատորների և նմուշների պատրաստման միավորների համապարփակ փաթեթ՝ Hielscher-ն ունի իդեալական ուլտրաձայնային սարք ձեր կենսաբանական կիրառման և պահանջների համար:
Դասական զոնդի տիպի ուլտրաձայնային սարք՝ միկրո ծայրով, ինչպիսին է UP200 St (200W; տես ձախ նկարը) կամ ուլտրաձայնային նմուշի պատրաստման միավորներից մեկը VialTweeter կամ UP200St_TD_CupHorn VialHolder-ի հետ սիրված մոդելներ են հետազոտական և վերլուծական լաբորատորիաներում: Դասական ուլտրաձայնային զոնդը իդեալական է, երբ ավելի քիչ նմուշներ պատրաստելը պետք է լուծվի, արդյունահանվի կամ մասնատվի: Նմուշի պատրաստման միավորները VialTweeter-ը և UP200St_TD_CupHorn-ը թույլ են տալիս համապատասխանաբար մինչև 10 կամ 5 սրվակի միաժամանակյա ձայնագրում:
Եթե նմուշների մեծ քանակություն (օրինակ՝ 96 ջրհորի թիթեղներ, միկրոտիտրային թիթեղներ և այլն) պետք է մշակվեն, ապա UIP400MTP է իդեալական sonication setup. UIP400MTP-ը գործում է որպես ավելի մեծ եղջյուր, որը լցված է ջրով և ունի բավականաչափ տարածություն միկրոհորերի թիթեղները պահելու համար: 400 Վտ հզորությամբ հզոր ուլտրաձայնային պրոցեսորով UIP400MTP-ն ապահովում է բազմաբնույթ ջրհորների թիթեղների շատ միատեսակ և ինտենսիվ հնչյունավորում՝ բջիջները խափանելու, նմուշները լուծարելու, գնդիկները լուծելու, սպիտակուցներ հանելու կամ կտրելու ԴՆԹ-ն:

Ճշգրիտ կառավարում Smart Software-ի միջոցով

Բոլոր Hielscher sonication լուծումները 200 վտ-ից վեր հագեցած են թվային գունավոր սենսորային էկրանով և խելացի ծրագրաշարով: Խելացի տվյալների արձանագրման միջոցով ուլտրաձայնային գործընթացի բոլոր պարամետրերը ավտոմատ կերպով պահվում են որպես CSV ֆայլ ներկառուցված SD-քարտի վրա, հենց որ ուլտրաձայնային սարքը գործարկվի: Սա շատ ավելի հարմար է դարձնում հետազոտությունն ու արձանագրությունը: Sonication-ի փորձարկումներից կամ նմուշի պատրաստումից հետո դուք կարող եք պարզապես վերանայել յուրաքանչյուր sonication-ի փորձարկման պարամետրերը և համեմատել դրանք:
Ինտուիտիվ մենյուի միջոցով բազմաթիվ պարամետրեր կարելի է նախադրել նախքան ձայնագրությունը. Օրինակ՝ նմուշի ջերմաստիճանը վերահսկելու և դրա ջերմային քայքայումը կանխելու համար կարող է սահմանվել նմուշի ջերմաստիճանի վերին սահմանը: Խցանվող ջերմաստիճանի սենսորը, որը գալիս է ուլտրաձայնային միավորի հետ, տալիս է ուլտրաձայնային պրոցեսորի հետադարձ կապը իրական ձայնային ջերմաստիճանի վերաբերյալ: Երբ հասնում է վերին ջերմաստիճանի սահմանը, ուլտրաձայնային սարքը կանգ է առնում այնքան ժամանակ, մինչև սահմանված ∆T-ի ստորին սահմանը հասնի և սկսում է այնուհետև նորից ավտոմատ կերպով հնչեցնել:
Եթե պահանջվում է հատուկ էներգիայի ներդրումով sonication, դուք կարող եք նախադրել sonication-ի վազքի վերջնական ուլտրաձայնային էներգիան: Իհարկե, ուլտրաձայնային պուլսացիան և ցիկլային ռեժիմը նույնպես կարող են առանձին սահմանվել:
Ձեր ամենահաջող ձայնագրման պարամետրերը կրկին օգտագործելու համար դուք կարող եք պահպանել ձայնային ձայնագրման տարբեր ռեժիմներ (օրինակ՝ ձայնային ձայնագրման ժամանակը, ինտենսիվությունը, ցիկլային ռեժիմը և այլն) որպես նախապես սահմանված ռեժիմներ, որպեսզի դրանք հեշտ և արագ վերսկսվեն:
Գործառնական առավել հարմարավետության համար բոլոր թվային ուլտրաձայնային միավորները կարող են շահագործվել դիտարկիչի հեռակառավարման միջոցով ցանկացած ընդհանուր դիտարկիչում (օրինակ՝ InternetExplorer, Safari, Chrome և այլն): LAN կապը պարզ plug-n-play կարգավորում է և չի պահանջում լրացուցիչ ծրագրերի տեղադրում:
Մենք Hielscher-ում գիտենք, որ կենսաբանական նմուշների հաջող հնչյունավորումը պահանջում է ճշգրտություն և կրկնելիություն: Հետևաբար, մենք նախագծել ենք մեր ուլտրաձայնային սարքերը որպես խելացի սարքեր բոլոր հատկանիշներով, որոնք թույլ են տալիս արդյունավետ, հուսալի, վերարտադրվող և հարմար նմուշի պատրաստում:

Ստորև բերված աղյուսակը ցույց է տալիս մեր ուլտրաձայնային համակարգերի մոտավոր մշակման հզորությունը՝ ուլտրաձայնային միկրո-խողովակներից և դասական ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորներից մինչև MultiSample ուլտրաձայնիչներ՝ բազմաթիվ նմուշների հարմար և հուսալի պատրաստման համար.