Drosophila melanogaster- ը լայնորեն օգտագործվում է լաբորատորիաներում `որպես օրինակելի օրգանիզմ: Հետևաբար, պետք է հաճախ իրականացվեն նախալեզիական նախապատրաստման այնպիսի քայլեր, ինչպիսիք են լիզիզացումը, բջիջների խզումը, սպիտակուցի արդյունահանումը և Drosophila melanogaster նմուշների ԴՆԹ-ի կտրումը: Ուլտրաձայնային ապամոնտաժիչները հուսալի և արդյունավետ են և կարող են օգտագործվել տարբեր խնդիրներ, ինչպիսիք են `լիզը, սպիտակուցի արդյունահանումը կամ ԴՆԹ-ի մասնատումը, հեշտությամբ կատարելու համար` միայն ուլտրաձայնային պրոցեսի պարամետրերը կարգավորելով: Ուլտրաձայնային համասեռացուցիչները դրանով իսկ ճկուն գործիքներ են ՝ կիրառական լայն շրջանակով:

Ուլտրաձայնային լուծույթ և սպիտակուցների արդյունահանում

Լիզիզմը, բջիջների լուծումը, հյուսվածքների հոմոգենացումը և սպիտակուցների արդյունահանումը կենսաբանական լաբորատորիաներում ուլտրաձայնային անջատիչների բնորոշ խնդիրներն են: Ուլտրաձայնային բաժանարարները և բջիջների խանգարիչները լավ են համապատասխանում կենդանիների հյուսվածքների, միջատների (օրինակ, Drosophila melanogaster, C. elegans) կամ բուսական նմուշների հոմոգենացմանը: Ուլտրաձայնացման հետագա կիրառությունները բջիջների կախոցների և գնդիկների քերծումն են, ինչպես նաև ներբջջային սպիտակուցների արդյունահանումը:
Ուլտրաձայնային լուծույթը և սպիտակուցի արդյունահանումը խիստ հուսալի և վերարտադրվող գործընթացներ են, որոնք կարող են իրականացվել հաստատված արձանագրությունների հիման վրա: Քանի որ ուլտրաձայնային պրոցեսի ինտենսիվությունը կարող է ճշգրտորեն ճշգրտվել ձայնայնացման պարամետրերի միջոցով, ինչպիսիք են ամպլիտուդը, ցիկլը / զարկերակային ռեժիմը, ջերմաստիճանը և նմուշի ծավալը, ապացուցված արձանագրությունները մեկ անգամ ևս կարող են կրկնվել նույն արդյունքով:

Ուլտրաձայնային ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի մասնատում

Բջիջների լիզիզմից և սպիտակուցների արդյունահանումից հետո, նմուշի պատրաստման ընդհանուր պահանջվող քայլը ԴՆԹ-ի, ՌՆԹ-ի և քրոմատինի կտրումն ու մասնատումն է, օրինակ `նախքան քրոմատինի իմունային նստվածքները (ChIP): ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի մասնատումը կարելի է հուսալիորեն ձեռք բերել `կոտրելով կովալենտային կապերը, որոնք ֆիզիկական ուժերով միասին են պահում ԴՆԹ-ն: Օգտագործելով sonication- ի նման ֆիզիկական կտրվածք `սկզբում կոտրվում են ԴՆԹ-ի թելերը, այնուհետև ԴՆԹ-ն մասնատվում է ավելի փոքր կտորների:
Ուլտրաձայնային ԴՆԹ-ի մասնատումը հուսալի և արդյունավետ է նպատակային երկարության կտրելու ԴՆԹ-ի կտրման համար, օրինակ `500 bp (բազային զույգեր): Ուլտրաձայնային ԴՆԹ-ի մասնատման հիմնական առավելությունները ներառում են ուլտրաձայնային պրոցեսի պարամետրերի և ուժգնության ճշգրիտ վերահսկումը: Ուլտրաձայնային գործընթացի պարամետրերը կարող են ճշգրտվել ճշգրտորեն ճշգրտելով ձայնազերծման ինտենսիվությունը, ցիկլերը և ժամանակը: Սա հնարավորություն է տալիս ստեղծել ցանկալի ԴՆԹ չափսեր, և նպատակային ԴՆԹ երկարությունը կարող է հուսալիորեն արտադրվել, ինչպես նաև վերարտադրվել: Ուլտրաձայնային ԴՆԹ-ի կտրումը նույնպես իդեալական է բարձր մոլեկուլային քաշով ԴՆԹ-ի բեկորներ ստեղծելու համար:

Արձանագրություններ Drosophila melanogaster- ի ուլտրաձայնային լիզի համար

Ստորև կարող եք գտնել ուլտրաձայնային օժանդակությամբ լիզի, սպիտակուցի արդյունահանման և Դրոզոֆիլայի նմուշների ԴՆԹ-ի կամ քրոմատինի մասնատման տարբեր արձանագրություններ:

Ուլտրաձայնային լիզ `խաչաձեւ կապող իմունային տեղումների (CLIP) վերլուծության համար

CLIP վերլուծությունը կատարվել է այնպես, ինչպես նախապես հաղորդվել էր ՝ որոշ փոփոխություններով: 0-ից 1 օրվա վայրի տեսակի կանանց մոտ 20 մգ ձվարանները ուլտրամանուշակագույնով խաչաձեւ կապվել են (3 × 2000 μJ / սմ 2), համասեռացվել սառույցի վրա 1 մլ RCB բուֆերում (50 մմ HEPES pH 7,4, 200 մմ NaCl, 2,5 մմ MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 մմ սախարոզա, 1 մմ DTT, 1 × EDTA- ի պարունակությամբ ամբողջական պրոտեազի ինհիբիտորներ, 1 մմ PMSF) լրացված 300 U RNAseOUT- ով և 30 րոպե տեղադրված սառույցի վրա: Համասեռանյութը վերամշակվեց սառույցի վրա, 80% հզորությամբ, հինգ անգամ 20 վայրկյանում, 60 վայրկյան հանգստի պայմաններում, օգտագործելով Hielscher ուլտրաձայնային պրոցեսոր UP100H (100 Վտ, 30 կՀց) և ցենտրիֆուգացված (16000 × գ 5 րոպե 4 ° C ջերմաստիճանում): Լուծվող քաղվածքը նախապես մաքրվեց 20 μl Protein-G dynabeads- ով 20 րոպե 4 ° C ջերմաստիճանում: Իմունոբլոտացիայի համար նմուշները հեռացնելուց և ՌՆԹ-ի ներդրման քանակականացումից (1%), HP1- ը իմունային տեղումներ է ստացել հակամեկուսիչ HP1 9A9 հակամարմնով 450 մկլ նախաքննական քաղվածքից `ինկուբացիայի միջոցով 4 ժամվա ընթացքում` 50 μl սպիտակուցային-G տոհմային խառնուրդներով: Իմունային նստվածքները լվացվեցին 4 անգամ RCB- ով: Իմունային տեղումներ ունեցող ՌՆԹ-ները դուրս բերելու համար գնդիկավոր ուլունքները եփվել են 100 μL UltraPure DEPC- ով մշակված inրի մեջ 5 րոպե: 900 μL Qiazol ռեագենտ է ավելացվել ՌՆԹ-ի պատրաստման համար վերականգնված գերբնական նյութին: Մաքրված RNA- ն օգտագործվել է որպես cDNA սինթեզելու ձևանմուշ ՝ օգտագործելով օլիգո dT, պատահական հեքսամեր և SuperScript հակադարձ տրանսկրիպտազ III ՝ համաձայն արտադրողի արձանագրության:
(Cassale et al. 2019)

Ուլտրաձայնային լուծույթ քրոմատինի իմունային տեղումների քանակի համար

Քրոմատինի իմունային նստվածքն իրականացվել է Menet- ի կողմից նկարագրված մեթոդի համաձայն `փոքր փոփոխություններով: 0-ից 1 օրվա վայրի տիպի կանանց մոտ 20 մգ ձվարանները համասեռացվել են 1 մլ NEB բուֆերում (10 մմ HEPES-Na pH 8,0, 10 մմ NaCl, 0,1 մգ EGTA-Na pH 8, 0,5 մմ EDTA-Na pH 8-ում, 1 մմ DTT, 0,5% NP-40, 0,5 մմ Սպերմիդին, 0,15 մմ Սպերմին, 1 × EDTA- ով զերծ լիակատար պրոտեազի ինհիբիտորներ) 1 րոպե հոմոգենացնող / ընկղմման ցրիչով (3000 ռ / ժ): Համասեռանյութը տեղափոխվել է նախապես սառեցված ապակու թափք և 15 լրիվ հարվածներ կիրառվել ամուր պատիճով: Այնուհետև ազատ միջուկները ցենտրիֆուգացվեցին 6000xg ջերմաստիճանում 10 րոպե 4 րոպե ջերմաստիճանում: Միջուկ պարունակող գնդիկները վերակոդավորվել են 1 մլ NEB- ի մեջ և ցենտրիֆուգացվել 20000 × գ-ով 20 րոպե սախարոզի գրադիենտի վրա (0.65 մլ 1.6 Մ sucrose NEB- ում, 0.35 ml 0.8 M sucrose NEB- ում): Գնդիկը վերակոդավորվեց 1 մլ NEB և ֆորմալդեհիդում `1% վերջնական կոնցենտրացիայի մեջ: Միջուկները խաչմերուկով կապվել են 10 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում և մարվել ՝ ավելացնելով 1/10 հատ 1,375 Մ գլիցին: Միջուկները հավաքվել են ցենտրիֆուգմամբ 6000 × գ-ով 5 րոպեի ընթացքում: Միջուկները երկու անգամ լվացվեցին 1 մլ NEB- ի մեջ և վերակապոնացվեցին 1 մլ Lysis բուֆերում (15 մմ HEPES-Na pH 7,6, 140 մմ NaCl, 0,5 մմ EGTA, 1 մմ EDTA ՝ pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na Deoxycholate, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroylsarcosine և 1 × EDTA- ով պարունակվող Complete Protease Inhibitors): Միջուկները վերամշակվեցին `օգտագործելով Hielscher ուլտրաձայնային պրոցեսոր UP100H (100 Վտ, 30 կՀց) վեց անգամ 20 վայրկյան սառույցով և 1 րոպե սառույցով: Sonicated միջուկները ցենտրիֆուգացվել են 13000 × գ 4 րոպե 4 ° C ջերմաստիճանում: Sonicated քրոմատինի մեծամասնությունը 500-ից 1000 բազային զույգ էր (bp) երկարությամբ: Յուրաքանչյուր իմունային տեղումների համար 15 μg քրոմատին ինկուբացվել է 10 μg HP1 9A9 մոնոկլոնալ հակամարմնի առկայության դեպքում (պտտվող անիվում 3 ժամ 4 ° C ջերմաստիճանում): Այնուհետև ավելացվեց 50 μl dynabeads սպիտակուցային G և ինկուբացիան շարունակվեց ամբողջ գիշեր 4 ° C ջերմաստիճանում: Գերհեղեղները վերացվեցին և նմուշները լվացվեցին երկու անգամ Lysis բուֆերում (յուրաքանչյուր լվացում 15 րոպե 4 ° C) և երկու անգամ TE բուֆերում (1 մմ EDTA, 10 մմ TrisHCl pH 8-ում): Քրոմատինը ուլունքներից մաքրվեց երկու քայլով. առաջին հերթին 100 մկլ-ով Eluition Buffer 1-ում (10 մմ EDTA, 1% SDS, 50 մմ TrisHCl pH 8-ում) 65 ° C ջերմաստիճանում 15 րոպե, որից հետո `ցենտրիֆուգացում և վերահոսքի վերականգնում: Բշտիկների նյութը վերամշակվեց 100 μl TE + 0,67% SDS- ով: Համակցված հեղուկ հեղուկը (200 μl) ինկուբացվել է ամբողջ գիշեր 65 ° C ջերմաստիճանում `խաչաձեւ կապերը փոխելու համար և մշակվել 50 μg / ml RNaseA- ով 15 րոպե 65 ° C ջերմաստիճանում և 500 μg / ml սպիտակուցային K սպիտակուցով 3 ժամ 65 ° C ջերմաստիճանում: Նմուշները արդյունահանվել են ֆենոլ-քլորոֆորմով և նստվել էթանոլի վրա: ԴՆԹ-ն վերակենդանացվել է 25 մկլ ջրի մեջ: ԴՆԹ-ի իմունային տեղումների միջոցով մոլեկուլային անալիզներն առավելագույնի հասցնելու համար թեկնածու գեները զույգերով ուժեղացան օպտիմիզացված դուպլեքս-PCR պրոտոկոլի միջոցով `օգտագործելով երկու տարբեր տարբեր նախածանցեր, որոնք ունեն մեկ հանկարծակի հալման ջերմաստիճան:
(Casale et al. 2019)
 

Կենսաբանական նմուշների բարձր արդյունավետության ուլտրաձայնային բջիջների խանգարող սարքեր

Hielscher Ultrasonics- ը ձեր երկար փորձառու գործընկերն է, երբ խոսքը վերաբերում է բարձրորակ ուլտրաձայնային սարքերին `բջիջների խզման, լիզիզմի, սպիտակուցների արդյունահանման, ԴՆԹ-ի, ՌՆԹ-ի և քրոմատինի մասնատման, ինչպես նաև նմուշի նախնական վերլուծական այլ քայլերի համար: Առաջարկելով ուլտրաձայնային լաբորատորիայի հոմոգենացման և նմուշ պատրաստման ստորաբաժանումների համապարփակ պորտֆոլիո ՝ Hielscher- ը ունի իդեալական ուլտրաձայնային սարք ձեր կենսաբանական կիրառման և պահանջների համար:
Դասական զոնդային տիպի ուլտրաձայնիչ `միկրո հուշումով, ինչպիսին է UP200St (200W; տես նկարը ձախ) կամ ուլտրաձայնային նմուշի պատրաստման ստորաբաժանումներից մեկը VialTweeter- ը կամ UP200ST_TD_CupHorn VialHolder– ի հետ հետազոտական և վերլուծական լաբորատորիաների սիրված մոդելներն են: Դասական ուլտրաձայնային զոնդը իդեալական է, երբ պատրաստել ավելի քիչ նմուշներ պետք է լիզել, արդյունահանել կամ մասնատել: VialTweeter- ի և UP200St_TD_CupHorn- ի պատրաստման նմուշի ստորաբաժանումները թույլ են տալիս միաժամանակ կատարել sonication մինչև համապատասխանաբար 10 կամ 5 սրվակների:
Եթե նմուշի բարձր համարները (օր. ՝ 96 հորատանցքի ափսեներ, միկրոտիտր ափսեներ և այլն) պետք է մշակվեն, ապա UIP400MTP sonication իդեալական տեղադրում է: UIP400MTP- ը գործում է ավելի մեծ խուփի նման, որը լցված է ջրով և ունի բավականաչափ տարածք միկրոհորերի ափսեներ պահելու համար: Սնուցվում է 400 վտ հզոր ուլտրաձայնային պրոցեսորով, UIP400MTP- ն ապահովում է բազմահորս ափսեների շատ համասեռ և ինտենսիվ վերամշակում `բջիջները խաթարելու, նմուշները լիզացնելու, գնդիկները լուծելու, սպիտակուցները կամ ԴՆԹ կտրելու համար:

Controlշգրիտ վերահսկում խելացի ծրագրակազմի միջոցով

Hielscher- ի ձայնազերծման բոլոր լուծումները 200 վտ-ից բարձր հագեցած են թվային գունավոր սենսորային էկրանով և խելացի ծրագրակազմով: Ուլտրաձայնային պրոցեսլինգի միջոցով ուլտրաձայնային գործընթացի բոլոր պարամետրերն ավտոմատ կերպով պահվում են որպես CSV ֆայլ ներկառուցված SD քարտի վրա, հենց որ սկսվում է ուլտրաձայնագրիչը: Սա հետազոտությունն ու պրոտոկոլինգը շատ ավելի հարմարավետ է դարձնում: Ձայնազերծման փորձարկումներից կամ նմուշի նախապատրաստումից հետո կարող եք պարզապես վերանայել ձայնազերծման յուրաքանչյուր գործարկման ձայնագրման պարամետրերը և համեմատել դրանք:
Ինտուիտիվ մենյուի միջոցով բազմաթիվ պարամետրեր կարող են նախադրվել նախքան ձայնագրումը. Օրինակ ՝ նմուշում ջերմաստիճանը վերահսկելու և դրա ջերմային դեգրադացիան կանխելու համար կարող է սահմանվել նմուշի ջերմաստիճանի վերին սահման: Խցանվող ջերմաստիճանի տվիչը, որը գալիս է ուլտրաձայնային սարքի հետ, տալիս է ուլտրաձայնային պրոցեսորին հետադարձ կապ իրական ձայնային ջերմաստիճանի վերաբերյալ: Երբ հասնում է ջերմաստիճանի վերին սահմանը, ուլտրաձայնային սարքը դադար է տալիս մինչև հասնի setT լրակազմի ստորին սահմանը և սկսվի, ապա նորից ավտոմատ կերպով ձայնայնացվում է:
Եթե հատուկ էներգիայի ներմուծում է պահանջում ձայնամեկուսացում, դուք կարող եք կանխորոշել sonication վազքի վերջին ուլտրաձայնային էներգիան: Իհարկե, ուլտրաձայնային պուլսացիայի և ցիկլի ռեժիմը նույնպես կարող է անհատապես սահմանվել:
Ձայնագրման ձեր առավել հաջող պարամետրերը կրկին օգտագործելու համար կարող եք պահպանել տարբեր ձայնային եղանակներ (օրինակ `ձայնազերծման ժամանակը, ինտենսիվությունը, ցիկլի ռեժիմը և այլն) որպես նախապես սահմանված ռեժիմներ, որպեսզի դրանք լինեն հեշտ և արագ սկսվեն նորից:
Ավելի շատ գործառնական հարմարության համար, ուլտրաձայնային բոլոր թվային ստորաբաժանումները կարող են գործարկվել զննարկիչի հեռակառավարման միջոցով ցանկացած սովորական զննարկչում (օրինակ ՝ InternetExplorer, Safari, Chrome և այլն): LAN կապը պարզ plug-n-play կարգավորում է և չի պահանջում լրացուցիչ ծրագրաշարի տեղադրում:
Մենք Hielscher- ում գիտենք, որ կենսաբանական նմուշների հաջող վերամշակումը պահանջում է ճշգրտություն և կրկնություն: Հետեւաբար, մենք նախագծեցինք մեր ուլտրաձայնային սարքերը որպես խելացի սարքեր ՝ բոլոր հատկություններով, որոնք հնարավորություն են տալիս արդյունավետ, հուսալի, վերարտադրելի և հարմար նմուշ պատրաստել:

Ստորև բերված աղյուսակը ցույց է տալիս մեր ուլտրաձայնային համակարգերի մոտավոր մշակման կարողության ցուցումը ուլտրաձայնային միկրոհուշերից և դասական ուլտրաձայնային համասեռացուցիչներից մինչև MultiSample ուլտրաձայնային սարքեր ՝ բազմաթիվ նմուշների հարմարավետ և հուսալի պատրաստման համար.