Drosophila Melanogaster նմուշների ուլտրաձայնային լիզիս

Drosophila melanogaster տեսակը լայնորեն օգտագործվում է լաբորատորիաներում որպես մոդելային օրգանիզմ։ Ուստի հաճախ անհրաժեշտ է իրականացնել Drosophila melanogaster նմուշների նախավերլուծական պատրաստման այնպիսի փուլեր, ինչպիսիք են լիզիսը, բջիջների քայքայումը, սպիտակուցների էքստրակցիան և DNA-ի կտրատումը սահքային ուժերով։ Ուլտրաձայնային դիսմեմբրատորները հուսալի և արդյունավետ են և կարող են հեշտությամբ կատարել տարբեր առաջադրանքներ, օրինակ՝ լիզիս, սպիտակուցների էքստրակցիա կամ DNA-ի ֆրագմենտացում՝ միայն ուլտրաձայնային գործընթացի պարամետրերը կարգավորելով։ Այսպիսով, ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորները ճկուն գործիքներ են՝ կիրառությունների լայն շրջանակով։

Ուլտրաձայնային լիզիս և սպիտակուցների էքստրակցիա

Լիզիսը, բջիջների լուծելիացումը, հյուսվածքների հոմոգենացումը և սպիտակուցների էքստրակցիան կենսաբանական լաբորատորիաներում ուլտրաձայնային դիսմեմբրատորների բնորոշ առաջադրանքներից են։ Ուլտրաձայնային դիսմեմբրատորները և բջջաքայքայիչները լավ են համապատասխանում կենդանական հյուսվածքների, միջատների (օրինակ՝ Drosophila melanogaster, C. elegans) կամ բուսական նմուշների հոմոգենացմանը։ Ուլտրաձայնային մշակման հետագա կիրառություններից են բջջային կախույթների և նստվածքների լիզիսը, ինչպես նաև ներբջջային սպիտակուցների էքստրակցիան։
Ուլտրաձայնային լիզիսը և սպիտակուցների էքստրակցիան խիստ հուսալի և վերարտադրելի գործընթացներ են, որոնք կարելի է իրականացնել հաստատված արձանագրությունների հիման վրա։ Քանի որ ուլտրաձայնային գործընթացի ինտենսիվությունը կարելի է ճշգրիտ կարգավորել ուլտրաձայնային մշակման այնպիսի պարամետրերով, ինչպիսիք են ամպլիտուդը, ցիկլային / իմպուլսային ռեժիմը, ջերմաստիճանը և նմուշի ծավալը, մեկ անգամ փորձարկված արձանագրությունները կարելի է կրկնել բազմիցս՝ ամեն անգամ ստանալով նույն արդյունքը։

DNA-ի և RNA-ի ուլտրաձայնային ֆրագմենտացում

Բջիջների լիզիսից և սպիտակուցների էքստրակցիայից հետո նմուշների պատրաստման հաճախ պահանջվող փուլերից է DNA-ի, RNA-ի և քրոմատինի կտրատումը սահքային ուժերով և ֆրագմենտացումը, օրինակ՝ քրոմատինի իմունապրեցիպիտացիայից (ChIP) առաջ։ DNA-ի և RNA-ի ֆրագմենտացումը կարելի է հուսալիորեն իրականացնել՝ ֆիզիկական ուժերով խզելով DNA-ն միասնական պահող կովալենտ կապերը։ Ֆիզիկական սահքային ազդեցություն, օրինակ՝ ուլտրաձայնային մշակում կիրառելիս սկզբում խզվում են DNA-ի շղթաները, ապա DNA-ն մասնատվում է ավելի փոքր հատվածների։
DNA-ի ուլտրաձայնային ֆրագմենտացումը հուսալի և արդյունավետ միջոց է DNA-ն սահքային ուժերով մինչև նպատակային երկարություն, օրինակ՝ 500bp (հիմքերի զույգ), կտրատելու համար։ DNA-ի ուլտրաձայնային ֆրագմենտացման հիմնական առավելություններից է ուլտրաձայնային գործընթացի պարամետրերի և ինտենսիվության ճշգրիտ վերահսկումը։ Ուլտրաձայնային գործընթացի պարամետրերը կարելի է կարգավորել՝ ճշգրիտ սահմանելով ուլտրաձայնային մշակման ինտենսիվությունը, ցիկլերը և տևողությունը։ Սա հնարավորություն է տալիս ստանալ DNA-ի ցանկալի չափեր, իսկ DNA-ի նպատակային երկարությունը կարելի է հուսալիորեն ստանալ և վերարտադրել։ DNA-ի ուլտրաձայնային կտրատումը սահքային ուժերով իդեալական է նաև բարձր մոլեկուլային զանգվածով DNA-ի ֆրագմենտներ ստանալու համար։

Drosophila melanogaster տեսակի ուլտրաձայնային լիզիսի արձանագրություններ

Ստորև կարող եք գտնել Drosophila նմուշների՝ ուլտրաձայնի օժանդակությամբ լիզիսի, սպիտակուցների էքստրակցիայի և DNA-ի կամ քրոմատինի ֆրագմենտացման տարբեր արձանագրություններ։

Ուլտրաձայնային լիզիս՝ խաչաձև կապակցմամբ իմունապրեցիպիտացիայի (CLIP) հետազոտության համար

CLIP հետազոտությունն իրականացվել է նախկինում նկարագրված եղանակով՝ որոշ փոփոխություններով։ Վայրի տիպի 0-ից 1 օրական էգերից ստացված մոտավորապես 20 mg ձվարանները ենթարկվել են ուլտրամանուշակագույն ճառագայթմամբ խաչաձև կապակցման (3 × 2000 μJ/cm2), սառույցի վրա հոմոգենացվել են 1 mL RCB բուֆերում (50 mM HEPES՝ pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM սախարոզ, 1 mM DTT, 1× EDTA չպարունակող Complete պրոտեազների ինհիբիտորներ, 1 mM PMSF), որին ավելացվել է 300 U RNAseOUT, և պահվել են սառույցի վրա 30 min։ Հոմոգենատը սառույցի վրա ենթարկվել է ուլտրաձայնային մշակման՝ 80% հզորությամբ, հինգ անգամ՝ 20 s տևողությամբ իմպուլսներով և դրանց միջև 60 s դադարներով՝ օգտագործելով Hielscher ընկերության ուլտրաձայնային պրոցեսորը՝ UP100H (100 W, 30 kHz) , և ցենտրիֆուգվել (16 000 × g՝ 5 min, 4°C պայմաններում)։ Լուծելի էքստրակտը նախապես մաքրվել է 20 μl Protein-G dynabeads միկրագնդիկներով՝ 20 min, 4°C պայմաններում։ Իմունոբլոթինգի և մուտքային RNA-ի քանակական որոշման (1%) համար նմուշներ առանձնացնելուց հետո 450 μl նախապես մաքրված էքստրակտից HP1 սպիտակուցը իմունապրեցիպիտացվել է anti-HP1 9A9 հակամարմնով՝ 50 μl Protein-G dynabeads միկրագնդիկներով 4 h ինկուբացման միջոցով։ Իմունապրեցիպիտատները 4 անգամ լվացվել են RCB բուֆերով։ Իմունապրեցիպիտացված RNA-ների էլյուցիայի համար նստեցված միկրագնդիկները եռացվել են 100 μL UltraPure DEPC-treated Water ջրում՝ 5 min։ RNA-ի պատրաստման համար հավաքված վերնստվածքային հեղուկին ավելացվել է 900 μL Qiazol Reagent։ Մաքրված RNA-ն օգտագործվել է որպես մատրիցա՝ cDNA սինթեզելու համար՝ կիրառելով oligo dT, պատահական հեքսամերներ և SuperScript հակադարձ տրանսկրիպտազ III՝ ըստ արտադրողի արձանագրության։
(Cassale et al. 2019)

Ուլտրաձայնային լիզիս՝ քրոմատինի իմունապրեցիպիտացիայի հետազոտության համար

Քրոմատինի իմունապրեցիպիտացիան կատարվել է ըստ Menet-ի նկարագրած մեթոդի՝ փոքր փոփոխություններով։ 0–1 օրական վայրի տիպի էգերից ստացված մոտավորապես 20 mg ձվարանները հոմոգենացվել են 1 mL NEB բուֆերում (10 mM HEPES-Na՝ pH 8,0 պայմաններում, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na՝ pH 8 պայմաններում, 0,5 mM EDTA-Na՝ pH 8 պայմաններում, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM սպերմիդին, 0,15 mM սպերմին, 1× EDTA չպարունակող Complete պրոտեազային արգելակիչներ)՝ հոմոգենիզատորով / ընկղմվող դիսպերսատորով, 1 min (3000 rpm պայմաններում)։ Հոմոգենատը տեղափոխվել է նախապես սառեցված ապակե Dounce հոմոգենիզատորի մեջ, և կատարվել է սերտ նստող մխոցի 15 ամբողջական շարժում։ Այնուհետև ազատ կորիզները ցենտրիֆուգվել են 6000xg պայմաններում՝ 10 min, 4°C պայմաններում։ Կորիզներ պարունակող նստվածքները վերասուսպենզավորվել են 1 mL NEB բուֆերում և ցենտրիֆուգվել 20 000 × g պայմաններում՝ 20 min, սախարոզի գրադիենտի վրա (0,65 mL 1,6 M սախարոզ՝ NEB բուֆերում, 0,35 mL 0,8 M սախարոզ՝ NEB բուֆերում)։ Նստվածքը վերասուսպենզավորվել է 1 mL NEB բուֆերում և ֆորմալդեհիդում՝ վերջինիս 1% վերջնական կոնցենտրացիայով։ Կորիզներում խաչաձև կապեր են առաջացվել 10 min՝ սենյակային ջերմաստիճանում, և ռեակցիան դադարեցվել է՝ ավելացնելով 1/10 ծավալ 1,375 M գլիցին։ Կորիզները հավաքվել են ցենտրիֆուգմամբ՝ 6000 × g պայմաններում, 5 min։ Կորիզները երկու անգամ լվացվել են 1 mL NEB բուֆերում և վերասուսպենզավորվել 1 mL լիզիսի բուֆերում (15 mM HEPES-Na՝ pH 7,6 պայմաններում, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA՝ pH 8 պայմաններում, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% նատրիումի դեզօքսիխոլատ, 0,1% SDS, 0,5% N-լաուրոիլսարկոզին և 1× EDTA չպարունակող Complete պրոտեազային արգելակիչներ)։ Կորիզները մշակվել են ուլտրաձայնով՝ Hielscher արտադրության UP100H (100 W, 30 kHz) ուլտրաձայնային պրոցեսորով՝ վեց անգամ, յուրաքանչյուր անգամ 20 s միացված վիճակում և 1 min սառույցի վրա։ Ուլտրաձայնով մշակված կորիզները ցենտրիֆուգվել են 13 000 × g պայմաններում՝ 4 min, 4°C պայմաններում։ Ուլտրաձայնով մշակված քրոմատինի մեծ մասի երկարությունը եղել է 500–1000 հիմքային զույգ (bp)։ Յուրաքանչյուր իմունապրեցիպիտացիայի համար 15 μg քրոմատին ինկուբացվել է 10 μg HP1 9A9 մոնոկլոնալ հակամարմնի ներկայությամբ (3 h՝ 4°C պայմաններում, պտտվող անիվի վրա)։ Այնուհետև ավելացվել է 50 μl dynabeads protein G, և ինկուբացումը շարունակվել է գիշերվա ընթացքում՝ 4°C պայմաններում։ Վերնստվածքային հեղուկները հեռացվել են, իսկ նմուշները երկու անգամ լվացվել են լիզիսի բուֆերում (յուրաքանչյուր լվացումը՝ 15 min, 4 °C պայմաններում) և երկու անգամ՝ TE բուֆերում (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl՝ pH 8 պայմաններում)։ Քրոմատինը միկրագնդիկներից էլյուցվել է երկու փուլով. նախ՝ 100 μl էլյուցիայի բուֆեր 1-ում (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl՝ pH 8 պայմաններում), 65°C պայմաններում՝ 15 min, որին հաջորդել են ցենտրիֆուգումը և վերնստվածքային հեղուկի հավաքումը։ Միկրագնդիկների նյութը կրկին էքստրակցվել է 100 μl TE + 0,67% SDS լուծույթում։ Միավորված էլյուատը (200 μl) ինկուբացվել է գիշերվա ընթացքում՝ 65°C պայմաններում՝ խաչաձև կապերը քանդելու համար, և մշակվել է 50 μg/ml RNaseA պատրաստուկով՝ 15 min, 65°C պայմաններում, ու 500 μg/ml Proteinase K պատրաստուկով՝ 3 h, 65°C պայմաններում։ Նմուշները ենթարկվել են ֆենոլ–քլորոֆորմային էքստրակցիայի և էթանոլով նստեցման։ DNA-ն վերասուսպենզավորվել է 25 μl ջրում։ Իմունապրեցիպիտացված DNA-ով մոլեկուլային վերլուծությունների հնարավորություններն առավելագույնի հասցնելու համար թեկնածու գեները զույգերով ամպլիֆիկացվել են օպտիմալացված դուպլեքս-PCR արձանագրությամբ՝ մեկ ռեակցիայում կիրառելով հալման նման ջերմաստիճաններ ունեցող պրայմերների երկու տարբեր հավաքածու։
(Casale et al. 2019)
 

Բարձր արդյունավետությամբ ուլտրաձայնային բջջաքայքայիչներ՝ կենսաբանական նմուշների համար

Hielscher Ultrasonics ընկերությունը ձեր երկարամյա փորձ ունեցող գործընկերն է, երբ խոսքը վերաբերում է բջիջների քայքայման, լիզիսի, սպիտակուցների էքստրակցիայի, DNA, RNA և քրոմատինի ֆրագմենտացման, ինչպես նաև նմուշների նախավերլուծական պատրաստման այլ քայլերի համար նախատեսված բարձր արդյունավետությամբ ուլտրաձայնային սարքերին։ Առաջարկելով ուլտրաձայնային լաբորատոր հոմոգենիզատորների և նմուշների պատրաստման սարքերի համապարփակ տեսականի՝ Hielscher ընկերությունն ունի ձեր կենսաբանական կիրառությանն ու պահանջներին իդեալականորեն համապատասխանող ուլտրաձայնային սարք։
Միկրոծայրով դասական զոնդային ուլտրաձայնային սարքերը, օրինակ՝ UP200St (200W, տե՛ս ձախ կողմի պատկերը), կամ նմուշների ուլտրաձայնային պատրաստման VialTweeter կամ UP200ST_TD_CupHorn սարքերը՝ VialHolder հարմարանքով, հետազոտական և վերլուծական լաբորատորիաներում նախընտրելի մոդելներ են։ Դասական ուլտրաձայնային զոնդն իդեալական է, երբ անհրաժեշտ է ավելի փոքր թվով նմուշներ ենթարկել լիզիսի, էքստրակցիայի կամ ֆրագմենտացման։ Նմուշների պատրաստման VialTweeter և UP200St_TD_CupHorn սարքերը թույլ են տալիս միաժամանակ ուլտրաձայնով մշակել համապատասխանաբար մինչև 10 կամ 5 սրվակ։
Եթե անհրաժեշտ է մշակել մեծ թվով նմուշներ (օրինակ՝ 96 հորիկով թիթեղներ, միկրոտիտրային թիթեղներ և այլն), ապա UIP400MTP սարքն ուլտրաձայնային մշակման իդեալական համակարգ է։ UIP400MTP սարքը գործում է ավելի մեծ CupHorn-ի նման, որը լցված է ջրով և բավականաչափ տեղ ունի միկրոհորիկներով թիթեղներ տեղավորելու համար։ 400 վատտ հզորությամբ ուլտրաձայնային պրոցեսորով աշխատող UIP400MTP սարքն ապահովում է բազմահորիկ թիթեղների շատ համաչափ և ինտենսիվ ուլտրաձայնային մշակում՝ բջիջները քայքայելու, նմուշները լիզիսի ենթարկելու, նստվածքները լուծելի դարձնելու, սպիտակուցները էքստրակցելու կամ DNA շղթաները սահքային ուժերով կտրատելու համար։

Ճշգրիտ կառավարում՝ խելացի ծրագրային ապահովման միջոցով

Ուլտրաձայնային մշակման համար նախատեսված Hielscher բոլոր համակարգերը՝ սկսած 200 վատտ հզորությունից և ավելի, հագեցած են թվային գունավոր սենսորային էկրանով և խելացի ծրագրային ապահովմամբ։ Տվյալների խելացի գրանցման միջոցով ուլտրաձայնային գործընթացի բոլոր պարամետրերն ավտոմատ կերպով պահպանվում են ներկառուցված SD քարտի վրա՝ CSV ֆայլի տեսքով, հենց որ ուլտրաձայնային սարքը գործարկվում է։ Սա հետազոտությունն ու արձանագրումը դարձնում է շատ ավելի հարմար։ Ուլտրաձայնային մշակման փորձարկումներից կամ նմուշների պատրաստումից հետո կարող եք պարզապես վերանայել մշակման յուրաքանչյուր գործարկման ուլտրաձայնային պարամետրերը և համեմատել դրանք։
Ինտուիտիվ ընտրացանկի միջոցով բազմաթիվ պարամետրեր կարելի է նախապես սահմանել՝ մինչև ուլտրաձայնային մշակումը։ Օրինակ՝ նմուշի ջերմաստիճանը վերահսկելու և դրա ջերմային քայքայումը կանխելու համար կարելի է սահմանել նմուշի ջերմաստիճանի վերին սահման։ Միացվող ջերմաստիճանային տվիչը, որը տրամադրվում է ուլտրաձայնային սարքի հետ, ուլտրաձայնային պրոցեսորին հետադարձ տեղեկություն է հաղորդում մշակման փաստացի ջերմաստիճանի մասին։ Երբ ջերմաստիճանը հասնում է վերին սահմանին, ուլտրաձայնային սարքը դադարեցնում է աշխատանքը, մինչև ջերմաստիճանը հասնի սահմանված ∆T միջակայքի ստորին սահմանին, որից հետո ավտոմատ կերպով վերսկսում է ուլտրաձայնային մշակումը։
Եթե անհրաժեշտ է ուլտրաձայնային մշակում՝ ներմուծվող էներգիայի որոշակի քանակով, կարող եք նախապես սահմանել մշակման գործարկման ավարտին հաղորդված ուլտրաձայնային էներգիայի քանակը։ Իհարկե, ուլտրաձայնային իմպուլսավորումը և ցիկլային ռեժիմը նույնպես կարելի է առանձին կարգավորել։
Ուլտրաձայնային մշակման ձեր ամենահաջող պարամետրերը կրկին օգտագործելու համար կարող եք մշակման տարբեր ռեժիմներ (օրինակ՝ մշակման տևողությունը, ինտենսիվությունը, ցիկլային ռեժիմը և այլն) պահպանել որպես նախապես սահմանված ռեժիմներ, որպեսզի դրանք հեշտությամբ և արագ կրկին գործարկվեն։
Աշխատանքն ավելի հարմար դարձնելու համար բոլոր թվային ուլտրաձայնային սարքերը կարող են հեռակառավարվել ցանկացած տարածված դիտարկչի միջոցով (օրինակ՝ InternetExplorer, Safari, Chrome և այլն)։ LAN կապն ունի պարզ «միացրու և աշխատիր» կարգավորում և չի պահանջում լրացուցիչ ծրագրային ապահովման տեղադրում։
Մենք՝ Hielscher ընկերությունում, գիտենք, որ կենսաբանական նմուշների հաջող ուլտրաձայնային մշակումը պահանջում է ճշգրտություն և կրկնելիություն։ Այդ պատճառով մենք մեր ուլտրաձայնային սարքերը նախագծել ենք որպես խելացի սարքեր՝ բոլոր այն գործառույթներով, որոնք ապահովում են նմուշների արդյունավետ, հուսալի, վերարտադրելի և հարմար պատրաստումը։

Ստորև բերված աղյուսակը պատկերացում է տալիս մեր ուլտրաձայնային համակարգերի մշակման մոտավոր արտադրողականության մասին՝ ուլտրաձայնային միկրոծայրերից և դասական ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորներից մինչև բազմաթիվ նմուշների հարմար ու հուսալի պատրաստման համար նախատեսված MultiSample ուլտրաձայնային սարքերը։