C. Elegans նմուշների ուլտրաձայնային պատրաստում

C. elegans նեմատոդ որդը կենսաբանության մեջ լայնորեն կիրառվող մոդելային օրգանիզմ է։ Վերլուծությունից առաջ նմուշների պատրաստումը պահանջում է լիզիս, սպիտակուցների և լիպիդների էքստրակցիա, ինչպես նաև ՌՆԹ-ի ֆրագմենտացում, որոնք կարելի է հուսալիորեն իրականացնել ուլտրաձայնային մշակմամբ։ Ուլտրաձայնային բջջաքայքայիչները հուսալի, տեխնոլոգիապես կատարելագործված և օգտագործման համար դյուրին սարքեր են՝ C. elegans նմուշների արագ պատրաստման համար։

C. elegans նմուշների ուլտրաձայնային պատրաստում

Caenorhabditis elegans կլոր որդերը լայնորեն կիրառվում են հետազոտական լաբորատորիաներում՝ գենոմիկայի, զարգացման կենսաբանության և հիվանդությունների ուսումնասիրման համար։ C. elegans օրգանիզմի գենոմի բազմաթիվ գեներ մարդու օրգանիզմում ունեն գործառութային համարժեքներ։ Ուստի այս նեմատոդ որդը մարդու հիվանդությունների ուսումնասիրման համար չափազանց օգտակար մոդել է։ C. elegans օրգանիզմի լայն կիրառման մյուս առավելություններն են բակտերիաներ (օրինակ՝ E. coli) պարունակող թիթեղների վրա հեշտ և էժան աճեցումը, թափանցիկությունը, աշխատանքի հարմարավետությունը, ինչպես նաև որդերը սառեցնելու և ավելի երկար ժամանակ պահելու հնարավորությունը։
Սպիտակուցների և լիպիդների վերլուծությունը լաբորատորիաներում սովորական ընթացակարգ է, իսկ նմուշների ուլտրաձայնային պատրաստումը C. elegans նեմատոդների լիզիսի ընդունված մեթոդն է զարգացման յուրաքանչյուր փուլում (այսինքն՝ սաղմեր, L1–L4 թրթուրներ, հասուն առանձնյակներ)։ Քանի որ C. elegans օրգանիզմը նաև օգտագործվում է որպես սպիտակուցների էքսպրեսիայի համակարգ՝ թիրախային սպիտակուցների գերարտահայտման համար, անհրաժեշտ է լիզիսի և սպիտակուցների էքստրակցիայի հուսալի, վերարտադրելի մեթոդ, որն ապահովում է սպիտակուցների բարձր ելք։ Բջիջների ուլտրաձայնային քայքայման և էքստրակցիայի համակարգերը հասանելի են զոնդային հոմոգենիզատորների և բազմա նմուշային ուլտրաձայնային սարքերի տեսքով։ Նմուշների հարմարավետ պատրաստման և ցանկացած չափի ու քանակի նմուշների մշակման համար Hielscher Ultrasonics ընկերությունն ունի ձեր լաբորատոր ընթացակարգին իդեալականորեն համապատասխանող ուլտրաձայնային բջջաքայքայիչը։

C. Elegans նեմատոդների ուլտրաձայնային քայքայման և լիզիսի արձանագրություններ

C. elegans նեմատոդների ուլտրաձայնային հոմոգենացումը և լիզիսը, ինչպես նաև դրանց հաջորդող սպիտակուցների և լիպիդների էքստրակցիան կարելի է իրականացնել տարբեր ընթացակարգերով՝ օգտագործելով հոմոգենացման և լիզիսի տարբեր բուֆերներ և այլն։ Լիզիսի բոլոր արձանագրությունների ընդհանուր պահանջն այն է, որ նմուշները պետք է անընդհատ պահվեն սառույցի վրա՝ սպիտակուցների քայքայումը կանխելու համար։ Ստորև ներկայացնում ենք ուլտրաձայնային լիզիսի և էքստրակցիայի մի քանի հուսալի ու արագ արձանագրություններ՝ սպիտակուցներ կամ լիպիդներ պարունակող բարձրորակ C. elegans նմուշների պատրաստման համար։

C. elegans նեմատոդների ուլտրաձայնային լիզիսի առավելությունները

• հուսալի
• վերարտադրելի
• ջերմաստիճանի ճշգրիտ վերահսկմամբ
• գործընթացի հուսալի վերահսկում
• մեղմ մեթոդ
• հեշտ կիրառելի
• անվտանգ

Սպիտակուցների ուլտրաձայնային էքստրակցիա C. elegans նմուշներից

C. elegans որդերի ուլտրաձայնային լիզիսը և դրանցից սպիտակուցների էքստրակցիան կարելի է իրականացնել տարբեր արձանագրություններով։ Ստորև ներկայացնում ենք լիզիսի մի քանի հուսալի և արագ արձանագրություններ՝ սպիտակուցների էքստրակցիայի վերարտադրելի արդյունքներ ստանալու համար։

C. elegans որդերից ցիտոզոլային էքստրակտի արագ պատրաստում ուլտրաձայնային մշակմամբ

Հետևյալ արձանագրությամբ կարող եք պատրաստել C. elegans լիզատներ 30 րոպեից պակաս ժամանակում։
C. elegans որդերի հավաքում
Ընտրեք անհրաժեշտ C. elegans որդերը և տեղափոխեք ֆոսֆատային բուֆերացված աղային լուծույթ (PBS) պարունակող 1,5ml փորձանոթի մեջ կամ լվացեք դրանք թիթեղի վրայից 1,5ml PBS լուծույթով։ Ցենտրիֆուգեք 1min՝ 2000rpm արագությամբ՝ նստվածք ստանալու համար։ Նմուշները մշտապես պահեք սառույցի վրա։
Այնուհետև որդերը երկու անգամ լվացեք PBS լուծույթով։
Դրանից հետո որդերը երկու անգամ լվացեք ddH₂O-ով։
Որդերը վերակախույթավորեք առնվազն 500ul հոմոգենացման բուֆերում (HB)։ Որդերի նմուշներն այժմ պատրաստ են ուլտրաձայնային լիզիսի համար։
Սպիտակուցային էքստրակտի ավելի բարձր որակ ստանալու համար կարող եք նվազեցնել բակտերիալ աղտոտումը՝ որդերը 5min տևողությամբ լվանալով նախ PBS լուծույթով, ապա ստերիլ, գերմաքուր ջրով (ddH₂O), կամ կատարել սախարոզային ֆլոտացիա։ Որդերի նմուշներն անընդհատ պահեք սառույցի վրա։

C. elegans նեմատոդների ուլտրաձայնային լիզիսի արձանագրություն

• Համոզվեք, որ նախապես պատրաստել եք ուլտրաձայնային սարքը, որպեսզի ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորը պատրաստ լինի օգտագործման համար (զոնդը տեղադրված է, ուլտրաձայնային մշակման ծրագիրը՝ նախապես սահմանված)։ 

Եթե ձեր ուլտրաձայնային սարքն ամրացված է հենակին, նմուշների փորձանոթներով սառցային բաղնիքը տեղադրեք ուլտրաձայնային զոնդի տակ և ուլտրաձայնային զոնդը մտցրեք 1,5ml փորձանոթի մեջ։

• UP200St կամ UP200Ht սարքով C. elegans նեմատոդների լիզիսի համար ուլտրաձայնային մշակումը պետք է կատարել միկրոծայրակալով (օրինակ՝ 2mm զոնդ S26d2․ տես ձախ կողմի պատկերը), 40% ամպլիտուդով, 1sec տևողությամբ՝ միջանկյալ 30sec դադարներով։ Յուրաքանչյուրը 1 վայրկյան տևողությամբ ուլտրաձայնային մշակման 5 ցիկլը՝ 30sec դադարներով, իդեալական է C. elegans նեմատոդների լիզիսի համար։ Եթե լիզիսն իրականացնում եք առաջին անգամ, յուրաքանչյուր իմպուլսից հետո կարող եք մանրադիտակով ստուգել լիզիսի ընթացքը նմուշի փոքր ալիքվոտներում։
• Լիզիսը հաջողությամբ ավարտված է, երբ որդերը քայքայված են։ Չափազանց երկար ուլտրաձայնային մշակումը հանգեցնում է կորիզների քայքայմանը և նկատելի է դառնում, երբ նմուշը մածուցիկ է դառնում կամ փրփրում է։ Նմուշի քայքայումը կանխելու համար անհրաժեշտության դեպքում կիրառեք ավելի շատ իմպուլսներ։ Բարձրորակ սպիտակուցային էքստրակտներ ստանալու համար մի երկարացրեք յուրաքանչյուր ուլտրաձայնային իմպուլսային ցիկլի տևողությունը։
• Պարզեցրեք բջջային լիզատը՝ ուլտրաձայնային լիզիսի ենթարկված որդերը ցենտրիֆուգելով 14 000rpm արագությամբ, 10min տևողությամբ, 4ºC ջերմաստիճանում։
• Այնուհետև վերնստվածքային հեղուկը տեղափոխեք նոր փորձանոթի մեջ և նախապատրաստեք իմունոպրեցիպիտացիայի կամ այլ անալիզների համար։

Նշում հոմոգենացման բուֆերի վերաբերյալ․ վերոնշյալ ուլտրաձայնային լիզիսի արձանագրության համար հոմոգենացման բուֆերը պատրաստեք հետևյալ կերպ․

C. elegans նեմատոդների լիզիս՝ նմուշների մշակման բարձր արտադրողականությամբ, 96 հորատիկով թիթեղներում՝ UIP400MTP թիթեղային ուլտրաձայնային սարքի կիրառմամբ

C. elegans նեմատոդների լիզիս (հասուն նեմատոդներ)
UIP400MTP՝ 80% ամպլիտուդ, 20 ցիկլ (յուրաքանչյուր ուլտրաձայնային մշակման ցիկլը՝ 30 sec միացված, 30 sec անջատված)
Լիզիսի բուֆեր․

• Տարբերակ 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Տարբերակ 2) համաիմունոպրեցիպիտացիայի (co-IP) համար՝ 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (պրոտեինազների ինհիբիտորների ամբողջական խառնուրդ)

ԴՆԹ-ի ֆրագմենտացում՝ նմուշների մշակման բարձր արտադրողականությամբ
C. elegans (հասուն նեմատոդներ) ԴՆԹ՝ 200–300bp․ UIP400MTP թիթեղային ուլտրաձայնային սարք – սահմանեք 80% ամպլիտուդ, 30 իմպուլս – յուրաքանչյուրի համար՝ 30sec միացված, 30sec անջատված

Նմուշների բարձր արտադրողականությամբ նախապատրաստման համար նախատեսված UIP400MTP թիթեղային ուլտրաձայնային սարքը հավասարաչափ ուլտրաձայնով մշակում է բազմահորատիկ, միկրոտիտրային և 96 հորատիկով թիթեղներում գտնվող նմուշները

C. elegans նեմատոդների ուլտրաձայնային լիզիս՝ քանակական աֆինային մաքրման անալիզների համար

C. elegans սաղմերը (յուրաքանչյուր կրկնության համար՝ ∼2 միլիոն) թարմ հավաքվել են երեք կենսաբանական կրկնությամբ՝ ձվակիր երիտասարդ հերմաֆրոդիտներին սպիտակեցնող նյութով մշակելու միջոցով, և սառույցի վրա ենթարկվել են ուլտրաձայնային մշակման (ցիկլ՝ 0,5 s, ամպլիտուդ՝ 40–45%, յուրաքանչյուր սեանսում՝ 5 իմպուլս, 5 սեանս, սեանսների միջև ընդմիջում՝ 30 s․ կիրառված սարքը՝ UP200S ուլտրաձայնային պրոցեսոր S26d2 միկրոծայրակալով (Hielscher Ultrasonics GmbH)) լիզիսի բուֆերում (ընդհանուր ծավալը՝ ∼600 μl․ 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% գլիցերին, պրոտեազների ինհիբիտորների խառնուրդ, 0,1% Nonidet P-40 Substitute)։ Ուլտրաձայնային մշակումից հետո ավելացվել է Nonidet P-40 Substitute՝ մինչև 1%, և լիզատները ինկուբացվել են ծայրից ծայր շրջապտույտով՝ 4°C ջերմաստիճանում, 30 min տևողությամբ, որից հետո ցենտրիֆուգվել են 20 000 × g պայմաններում՝ 20 min տևողությամբ, 4°C ջերմաստիճանում։ Այնուհետև պարզեցված լիզատը ասպիրացվել է՝ առանց վերին լիպիդային շերտը խախտելու, և բաժանվել է երկու հավասար մասի, որոնք ավելացվել են համապատասխանաբար anti-GFP ագարոզային հատիկներին կամ բլոկավորված ստուգիչ հատիկներին (40–50 μl)։ 4°C ջերմաստիճանում 60–90 min տևողությամբ ծայրից ծայր շրջապտույտից հետո հատիկները մեկ անգամ լվացվել են 0,1% Nonidet P-40 Substitute պարունակող լիզիսի բուֆերով, որից հետո երկու անգամ լվացվել են կամ բուֆեր I-ով (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2), կամ բուֆեր II-ով (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2), կամ երկուսով էլ։ GFP:MBK-2 աֆինային նստեցումների համար կատարվել է երկու առանձին փորձ՝ լվացման տարբեր պայմաններում։ Սպիտակուցները էլյուցվել են սենյակային ջերմաստիճանում ուղեծրային թափահարմամբ՝ 50 μl ծավալով 6 m միզանյութի/2 M թիոմիզանյութի լուծույթում։ MBK-1::GFP աֆինային նստեցման փորձերի համար սպիտակուցները երկու անգամ էլյուցվել են թափահարմամբ՝ 50μl ծավալով 8 m գուանիդինիումի քլորիդի լուծույթում, 90°C ջերմաստիճանում, որից հետո նստեցվել են էթանոլով։ Այնուհետև էլյուցված սպիտակուցային նմուշները ենթարկվել են լուծույթում մարսման։
(տե՛ս Chen et al., 2016)

Որդերի ուլտրաձայնային հոմոգենացում և լիզիս

C.elegans նմուշների լիզիսի և սպիտակուցների արդյունահանման ընթացակարգի համար յուրաքանչյուր նմուշի հաշվով հավաքվել է համապատասխան զարգացման փուլում գտնվող 30 000 նեմատոդ, որոնք լվացվել են սառցասառը S-basal միջավայրով, խտացվել՝ 1500 rpm արագությամբ 2 min. ցենտրիֆուգմամբ, վեց անգամ լվացվել սառցասառը S-basal միջավայրով՝ մնացորդային բակտերիաները հեռացնելու համար, ապա պահվել սառույցի վրա մինչև օգտագործման պատրաստ լինելը։ Սպիտակուցների արդյունահանման համար վերջին՝ S-basal միջավայրով լվացումից հետո ձվակիր հասուն որդերին թույլ է տրվել ձևավորել խիտ նստվածք։ Այնուհետև որդերի նստվածքները վերասուսպենզավորվել են 1 ml սառցասառը արդյունահանման բուֆերում [20 mM կալիումի ֆոսֆատ, pH 7,4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, պրոտեազների ինհիբիտորներ (Sigma P2714)] և անմիջապես մշակվել։
∼30 000 ձվակիր հասուն որդ (համապատասխանում է ∼100 mg թաց զանգվածի) սառույցի վրա ուլտրաձայնային մշակման է ենթարկվել զոնդային ուլտրաձայնային սարքով (օրինակ՝ UP50H՝ MS2 միկրոծայրակալով), 40% ամպլիտուդով, 10 ցիկլով՝ 3 sec միացված և 30 sec անջատված ռեժիմով, 1 ml սառցասառը արդյունահանման բուֆերում։ (տե՛ս Baskharan et al. 2012)

Լիպիդների ուլտրաձայնային արդյունահանում C. elegans նմուշներից

Լիպիդոմիկայում՝ մետաբոլոմիկայի ճյուղերից մեկում, բնութագրվում և վերլուծվում է կենսաբանական համակարգերի լիպիդների ամբողջությունը։ C. elegans նեմատոդները լայնորեն օգտագործվում են լիպիդոմիկայում՝ նյութափոխանակային լիպիդների փոխազդեցությունը և առողջության ու կյանքի տևողության վրա դրանց ազդեցություններն ուսումնասիրելու համար։
Ուլտրաձայնային լիզիսն ու արդյունահանումն օգտագործվում են C. elegans սաղմերից, թրթուրներից և հասուն որդերից լիպիդներ, օրինակ՝ սֆինգոլիպիդներ ազատելու համար։ Ուլտրաձայնային մշակումն օգտագործվում է որդերի հոմոգենատներ պատրաստելու, այնուհետև նմուշից լիպիդներն արդյունահանելու համար։
C. elegans նմուշներից լիպիդների ուլտրաձայնային արդյունահանման արձանագրություն
C. elegans նստվածքը հալեցրեք սառույցի վրա և վերասուսպենզավորեք 0,5 ml ultrawater ջրով։ C. elegans նմուշները ենթարկեք ուլտրաձայնային մշակման 1,5mL փորձանոթներում՝ նմուշները մշտապես պահելով սառույցի վրա։
Ուլտրաձայնային մշակումը կարելի է կատարել՝ օգտագործելով զոնդային ուլտրաձայնային սարք, օրինակ՝ UP200Ht, նմուշների ուլտրաձայնային պատրաստման սարքը՝ VialTweeter (10 նմուշի միաժամանակյա ուլտրաձայնային մշակում), կամ UIP400MTP (բազմահորիկ թիթեղների, օրինակ՝ 96-հորիկ թիթեղների ուլտրաձայնային մշակման համար)։ UP200Ht սարքով ուլտրաձայնային լիզիսի համար օգտագործեք S26d2 միկրոծայրակալը։ Թվային ընտրացանկում նախապես սահմանեք ուլտրաձայնային ցիկլի ռեժիմը։ Ամպլիտուդը սահմանեք 10%, իսկ ուլտրաձայնային մշակման ցիկլի ռեժիմը՝ 20 ցիկլ՝ 2 sec իմպուլսներով և յուրաքանչյուր ուլտրաձայնային իմպուլսային պոռթկման միջև 30 sec. դադարով։
Վերնստվածքային հեղուկները տեղափոխեք պտուտակավոր կափարիչով ապակե փորձանոթների մեջ։ Կատարեք Ֆոլչի մեթոդով արդյունահանում՝ յուրաքանչյուր ապակե փորձանոթի մեջ ավելացնելով 1 ml ultrawater ջուր, ապա յուրաքանչյուր ապակե փորձանոթի մեջ ավելացնելով 6 ml քլորոֆորմի/մեթանոլի խառնուրդ (հարաբերակցությունը = 2:1)։
Յուրաքանչյուր ապակե փորձանոթը վորտեքսային խառնիչով խառնեք 4 անգամ՝ ամեն անգամ 30 sec։ Ֆազերի տարանջատումն էլ ավելի ուժեղացնելու համար փորձանոթները ցենտրիֆուգեք 1 258 x g պայմաններում՝ 15 min (Eppendorf, 5810 R)։ Ստորին հիդրոֆոբ ֆրակցիան ապակե Պաստերի պիպետով տեղափոխեք մաքուր ապակե փորձանոթի մեջ։ Ստորին հիդրոֆոբ ֆրակցիան չորացրեք ազոտի հոսքի տակ՝ ազոտային գոլորշացուցիչում։ Չորացրած նստվածքը մինչև օգտագործումը պահեք -80 °C սառցարանում։ 


Որդերի լիզատների ուլտրաձայնային պատրաստում

Որդերի լիզատ. L4 փուլում գտնվող որդերը հավաքվել և երեք անգամ լվացվել են M9 բուֆերով (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl և 0,87 mM MgSO₄)՝ բոլոր բակտերիաները հեռացնելու համար։ M9 բուֆերը հնարավորինս հեռացնելուց հետո որդերը կրկին սուսպենդացրել են լիզիսի բուֆերում՝ 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM ֆոսֆատ β-գլիցերոլ, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM նատրիումի ֆտորիդ, 1 mM նատրիումի օրթովանադատ, 5 mM նատրիումի պիրոֆոսֆատ, 0,2 mM ֆենիլմեթանսուլֆոնիլֆտորիդ և պրոտեազի ինհիբիտոր։ Որդերը երեք անգամ սառեցրել են հեղուկ ազոտում և հալեցրել 37°C ջերմաստիճանում, այնուհետև չոր սառույցի վրա ենթարկել են ուլտրաձայնային մշակման՝ օգտագործելով 10 նմուշային փորձանոթների միաժամանակյա պատրաստման համար նախատեսված ուլտրաձայնային VialTweeter սարքը։ Ուլտրաձայնային մշակումն իրականացրել են 50% ամպլիտուդով՝ 2 sec. տևողությամբ 10 ցիկլով, ուլտրաձայնային իմպուլսների շարքերի միջև 30 sec դադարով։ Այնուհետև նմուշները ցենտրիֆուգել են 12 000 rpm արագությամբ, 4°C ջերմաստիճանում՝ 15 min։ Վերնստվածքային հեղուկը հավաքել և պահել են -70°C ջերմաստիճանում։ Մեկ ալիքվոտ օգտագործել են Բրեդֆորդի մեթոդով սպիտակուցի քանակական որոշման համար։
Ընդհանուր գլուտաթիոնի, GSH և GSSG քանակական որոշում. գլուտաթիոնի քանակական որոշման համար լիզատների պատրաստումն ու որոշումն իրականացրել են նույն օրը։ Գլյուկոզայով սնուցված և ստուգիչ L4 թրթուրները հավաքել և երեք անգամ լվացել են M9 բուֆերով։ M9 բուֆերը հնարավորինս հեռացնելուց հետո որդերը կրկին սուսպենդացրել են սառցասառը մետաֆոսֆորական թթվում (5% w/v), այնուհետև սառույցի մեջ ենթարկել են ուլտրաձայնային մշակման՝ օգտագործելով ուլտրաձայնային VialTweeter սարքը 50% ամպլիտուդով, 2 sec. տևողությամբ տասը ուլտրաձայնային ցիկլով՝ յուրաքանչյուր ցիկլի միջև 30 sec. դադարով։ Այնուհետև ցենտրիֆուգել են 12 000 rpm արագությամբ, 4 ̊C ջերմաստիճանում՝ 15 min։
(տե՛ս Alcántar-Fernández et al., 2018)

C. elegans նմուշների պատրաստումը իմունոպրեցիպիտացիայից և վեստերն բլոթինգից առաջ

Համառոտ՝ սաղմնային էքստրակտներ ստանալու համար C. elegans տեսակի L1 թրթուրներն աճեցրել են մեծածավալ հեղուկ S-միջավայրի կուլտուրաներում մինչև հասուն փուլը։ Սաղմները հավաքել են սպիտակեցնող նյութով մշակման ստանդարտ մեթոդով և սուսպենդացրել լիզիսի բուֆերում (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% գլիցերոլ, 0,05% NP-40, 1􏰅 պրոտեազի ինհիբիտորների խառնուրդ և 1􏰅 ֆոսֆատազի ինհիբիտորների I և II խառնուրդներ), արագ սառեցրել հեղուկ ազոտում և լիզիսի ենթարկել բջիջների ուլտրաձայնային քայքայմամբ՝ օգտագործելով միկրոծայրով ուլտրաձայնային սարք, օրինակ՝ UP200Ht սարքը՝ S26d2 միկրոծայրով, 10 s ընթացքում 10 իմպուլսով՝ 30% ամպլիտուդով։ Եթե անհրաժեշտ է պատրաստել ավելի մեծ թվով նմուշներ, խորհուրդ է տրվում օգտագործել ուլտրաձայնային VialTweeter սարքը կամ հորատավոր թիթեղների համար նախատեսված բազմանմուշ ուլտրաձայնային UIP400MTP սարքը։ Ուլտրաձայնային մշակումից հետո էքստրակտները նախապես պարզեցվել են ցենտրիֆուգմամբ՝ 30 000g պայմաններում, 20 min, 4°C ջերմաստիճանում։ Նախապես պարզեցված էքստրակտը (300µg ընդհանուր սպիտակուց) ինկուբացվել է սպիտակուց A-ագարոզին խաչաձև կապակցված, աֆինային մաքրմամբ ստացված 40µ􏰂g anti-CDC-25.1 հակամարմնի հետ (այս հետազոտություն), կամ որպես ստուգիչ օգտագործվել է սպիտակուց A-ագարոզին խաչաձև կապակցված նապաստակի իմունոգլոբուլին (Ig)G՝ նմանատիպ քանակությամբ, լիզիսի բուֆերի 200µl ընդհանուր ծավալում, որը պարունակում էր 1% NP-40։ Դրա ներառումը նվազեցրել է սպիտակուցների ոչ սպեցիֆիկ կապումը մատրիքսին։ Նմուշները պտտվել են 1 h՝ 4°C ջերմաստիճանում, հատիկները երեք անգամ լվացվել են լիզիսի բուֆերով և էլյուցվել 30µl գլիցին/HCl ու 200 mM NaCl լուծույթով՝ pH 2,2։ Իմունոպրեցիպիտացիայից հետո էլյուատները նոսրացվել են 30µ􏰂l SDS նմուշային բուֆերում, տաքացվել մինչև 95°C՝ 4 min, և սովորաբար ընդհանուր քանակի 3%-ը՝ որպես ելանյութ, իսկ էլյուատների 30%-ը կիրառվել են SDS-PAGE մեթոդով բաժանման համար, որին հաջորդել է վեստերն բլոթինգը anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubiquitin (1:1000), anti-GSK3􏰁 (1:500) կամ anti-􏰁β-actin (1:2000) հակամարմիններով։ Այն դեպքերում, երբ էքստրակտները չեն ենթարկվել իմունոպրեցիպիտացիայի, այդ էքստրակտներից ստացված ընդհանուր սպիտակուցի նույն քանակը վերասուսպենզավորվել է SDS նմուշային բուֆերում, տաքացվել մինչև 95°C, այնուհետև անմիջապես կիրառվել SDS-PAGE մեթոդով բաժանման համար և վերլուծվել վեստերն բլոթինգով։ (տե՛ս Segref et al. 2020)

Ուլտրաձայնային լիզիս՝ ջերմաստիճանի ճշգրիտ վերահսկմամբ

Կենսաբանական նմուշների հետ աշխատելիս ջերմաստիճանի ճշգրիտ և հուսալի վերահսկումը վճռորոշ նշանակություն ունի։ Բարձր ջերմաստիճանները նմուշներում հարուցում են սպիտակուցների ջերմային քայքայում։
Ինչպես նմուշների պատրաստման բոլոր մեխանիկական մեթոդները, ուլտրաձայնային մշակումը նույնպես ջերմություն է առաջացնում։ Սակայն VialTweeter օգտագործելիս նմուշների ջերմաստիճանը կարելի է լավ վերահսկել։ Ներկայացնում ենք նմուշների ջերմաստիճանի դիտարկման և վերահսկման տարբեր հնարավորություններ՝ վերլուծության համար դրանք VialTweeter և VialPress սարքերով պատրաստելիս։

1. Նմուշի ջերմաստիճանի դիտարկում. UP200St ուլտրաձայնային պրոցեսորը, որը գործարկում է VialTweeter սարքը, հագեցած է խելացի ծրագրային ապահովմամբ և միացվող ջերմաստիճանային տվիչով։ Ջերմաստիճանային տվիչը միացրեք UP200St սարքին և տվիչի ծայրը մտցրեք նմուշի փորձանոթներից մեկի մեջ։ Թվային գունավոր սենսորային էկրանի միջոցով UP200St սարքի ընտրացանկում կարող եք սահմանել ջերմաստիճանի որոշակի միջակայք՝ ձեր նմուշի ուլտրաձայնային մշակման համար։ Առավելագույն ջերմաստիճանին հասնելիս ուլտրաձայնային սարքն ինքնաբերաբար կկանգնի և կմնա դադարի վիճակում, մինչև նմուշի ջերմաստիճանը նվազի մինչև սահմանված ջերմաստիճանային ∆ միջակայքի ստորին արժեքը։ Այնուհետև ուլտրաձայնային մշակումն ինքնաբերաբար կվերսկսվի։ Այս խելացի գործառույթը կանխում է ջերմությամբ հարուցված քայքայումը։
2. VialTweeter բլոկը կարելի է նախապես սառեցնել։ VialTweeter բլոկը (միայն սոնոտրոդը՝ առանց փոխակերպիչի՛) դրեք սառնարանի կամ սառցախցիկի մեջ. տիտանե բլոկի նախնական սառեցումն օգնում է հետաձգել նմուշի ջերմաստիճանի բարձրացումը։ Հնարավորության դեպքում կարելի է նախապես սառեցնել նաև հենց նմուշը։
3. Ուլտրաձայնային մշակման ընթացքում սառեցման համար օգտագործեք չոր սառույց։ Օգտագործեք չոր սառույցով լցված ծանծաղ սկուտեղ և VialTweeter սարքը տեղադրեք չոր սառույցի վրա, որպեսզի ջերմությունը կարողանա արագ հեռանալ։

Գտեք բջիջների քայքայման օպտիմալ ուլտրաձայնային սարքը՝ լիզիսի ձեր կիրառության համար

Hielscher Ultrasonics ընկերությունը լաբորատորիաների, լաբորատոր սեղանի վրա տեղադրվող և արդյունաբերական մասշտաբի համակարգերի համար բարձր արտադրողականությամբ բջիջների քայքայման ուլտրաձայնային սարքերի և հոմոգենիզատորների արտադրության երկարամյա փորձ ունի։ Ձեր բակտերիալ բջջային կուլտուրայի չափը, հետազոտության կամ արտադրության նպատակը և մեկ ժամում կամ օրում մշակվող բջիջների ծավալը էական գործոններ են՝ ձեր կիրառության համար բջիջների քայքայման ճիշտ ուլտրաձայնային սարքը գտնելու համար։
Hielscher Ultrasonics ընկերությունն առաջարկում է տարբեր լուծումներ մի քանի նմուշների (մինչև 10 սրվակ), ինչպես նաև մեծաքանակ նմուշների (այսինքն՝ միկրոտիտրային թիթեղների / 96 հորատանցքով թիթեղների) միաժամանակյա ուլտրաձայնային մշակման համար՝ դասական զոնդային լաբորատոր ուլտրաձայնային սարքերից, որոնց հզորության տարբեր մակարդակները կազմում են 50-ից մինչև 400 վատտ, մինչև ամբողջովին արդյունաբերական ուլտրաձայնային պրոցեսորներ՝ յուրաքանչյուր սարքի համար մինչև 16 000 վատտ հզորությամբ, խոշոր արտադրությունում բջիջների առևտրային քայքայման և սպիտակուցների էքստրակցիայի համար։ Hielscher բոլոր ուլտրաձայնային սարքերը նախատեսված են լրիվ բեռնվածությամբ 24/7/365 աշխատանքի համար։ Ամրությունն ու հուսալիությունը մեր ուլտրաձայնային սարքերի հիմնական հատկանիշներն են։
Բոլոր թվային ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորները հագեցած են խելացի ծրագրային ապահովմամբ, գունավոր սենսորային էկրանով և տվյալների ավտոմատ գրանցման գործառույթով, որոնք ուլտրաձայնային սարքը դարձնում են հարմար աշխատանքային գործիք լաբորատոր և արտադրական պայմաններում։
Տեղեկացրեք մեզ, թե ինչ տեսակի բջիջներ, ինչ ծավալով, ինչ հաճախականությամբ և ինչ նպատակով պետք է մշակեք ձեր կենսաբանական նմուշներում։ Մենք ձեզ կառաջարկենք բջիջների քայքայման այն ուլտրաձայնային սարքը, որն ամենից հարմար է ձեր գործընթացի պահանջներին։

Ստորև բերված աղյուսակը պատկերացում է տալիս մեր ուլտրաձայնային համակարգերի մոտավոր մշակման կարողության մասին՝ կոմպակտ ձեռքի հոմոգենիզատորներից և բազմանմուշ ուլտրաձայնային սարքերից մինչև առևտրային կիրառությունների համար նախատեսված արդյունաբերական ուլտրաձայնային պրոցեսորներ.