Ուլտրաձայնային լիզիս վեստերն բլոթինգի համար

• Վեստերն բլոթը վերլուծական ընթացակարգ է՝ հյուսվածքային հոմոգենատի կամ բջջային էքստրակտի նմուշում որոշակի սպիտակուցների հայտնաբերման համար։
• Վեստերն բլոթ կատարելու կամ ֆերմենտային ակտիվությունը չափելու համար բազմաթիվ հետազոտություններ պահանջում են բջջի ներսում պարփակված նյութերի (օրինակ՝ սպիտակուցների, ԴՆԹ-ի, ենթաբջջային հատվածների) հասանելիություն։
• Ուլտրաձայնային մշակումը բջիջների վերահսկվող քայքայման և լիզիսի հուսալի ու հեշտ կիրառելի մեթոդ է։

Բջիջների ուլտրաձայնային քայքայում

Հյուսվածքներից և կուլտիվացված բջիջներից սպիտակուցների էքստրակցիան բազմաթիվ կենսաբանական, կենսաքիմիական և վերլուծական մեթոդների (PAGE, վեստերն բլոթինգ, ELISA, զանգվածային սպեկտրաչափություն և այլն) կամ սպիտակուցների մաքրման առաջին քայլն է։ Սպիտակուցի բարձր ելք ստանալու համար բջջային նյութն ու հյուսվածքը պետք է արդյունավետորեն քայքայվեն/լիզիսի ենթարկվեն։ Լինի բուսական բջիջ, թե կենդանական հյուսվածք՝ ուլտրաձայնային մշակումը ձեր բջջային լիզատը հեշտ և արագ պատրաստելու մեթոդն է։

Ուլտրաձայնային մշակման առավելությունները

• արագ և արդյունավետ
• հեշտ գործարկում
• սպիտակուցի բարձր ելք
• վերարտադրելի/կրկնելի
• ճշգրիտ վերահսկվող
• մասշտաբը մեծացնելու հնարավորություն

Իմունապրեցիպիտացիայի արձանագրություն վեստերն իմունաբլոթինգի համար

A. Ռեագենտներ

Լուծույթների պատրաստման համար օգտագործեք մաքրված ջուր, օրինակ՝ Milli-Q։

• 1X ֆոսֆատային բուֆերային աղային լուծույթ (PBS)
• 1X բջջային լիզիսի բուֆեր՝ 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM նատրիումի պիրոֆոսֆատ, 1 mM β-գլիցերոֆոսֆատ, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml լեյուպեպտին
  Կարևոր է՝ օգտագործելուց անմիջապես առաջ ավելացրեք 1 mM PMSF։
• 15 μl Protein A+15 μl Protein G քանակը բավարար է IP-ի համար, սակայն դա կարող է կախված լինել ձեր առաջնային հակամարմնից և նմուշի ծավալից։ Կարող եք նաև օգտագործել նախապես խառնված A/ G սպիտակուցներով ագարոզ (օրինակ՝ Protein A՝ ճագարի IgG-ի նստեցման և Protein G՝ մկան IgG-ի նստեցման համար)
• 3X SDS նմուշային բուֆեր՝ 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8՝ 25°C պայմաններում), 6% w/v SDS, 30% գլիցերին, 150 mM DTT, 0,03% w/v բրոմֆենոլային կապույտ

B. Բջջային լիզատների պատրաստում

• Հավաքեք բջիջները։ Բջիջները չդենատուրացնող պայմաններում հավաքելու համար հեռացրեք սննդամիջավայրերը և բջիջները մեկ անգամ լվացեք սառցային սառնության PBS լուծույթով։
• Հեռացրեք PBS լուծույթը, յուրաքանչյուր թիթեղի (10 cm) մեջ ավելացրեք 0,5 ml սառցային սառնության 1X բջջային լիզիսի բուֆեր և թիթեղները 5 րոպե ինկուբացրեք սառույցի վրա։
• Բջիջները քերելով հեռացրեք թիթեղներից և տեղափոխեք միկրոցենտրիֆուգային փորձանոթների մեջ։ Պահեք սառույցի վրա։
• Երկու անգամ՝ յուրաքանչյուրը 10 վայրկյան, ուլտրաձայնով մշակեք սառցային սառնության իմունապրեցիպիտացիայի բուֆերում (IP բուֆեր՝ 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 և պրոտեազների ինհիբիտորների խառնուրդ)։ Ուլտրաձայնային մշակման համար VialTweeter կամ զոնդային ուլտրաձայնային սարքերը, օրինակ՝ UP100H կամ UP200Ht սարքերը, առավել հարմար են։
• Լիզատները ցենտրիֆուգեք 15 000 g պայմաններում՝ 10 րոպե, 4°C ջերմաստիճանում։
• Վերնստվածքային հեղուկը տեղափոխեք նոր փորձանոթի մեջ։ (Անհրաժեշտության դեպքում լիզատը կարելի է պահել –80°C ջերմաստիճանում։)
• Վերնստվածքային հեղուկին ավելացրեք առաջնային հակամարմինը։ Առաջնային հակամարմին պարունակող վերնստվածքային հեղուկը ինկուբացնում են 1 h՝ 4°C ջերմաստիճանում, թույլ խառնելով։ Առաջնային հակամարմինը սովորաբար ավելացնում են վեստերն բլոթինգի համար օգտագործվողից 10x ավելի խտացված քանակով։ (Կարող եք սկսել յուրաքանչյուր 100μL-ի համար 1μg քանակից։)
• Այնուհետև վերնստվածքային հեղուկը ևս 1 h ինկուբացնում են հավասար քանակներով Protein A-ագարոզ (Invitrogen) և Protein G ագարոզ պարունակող խառնուրդի հետ։
• Ագարոզային նստվածքները երեք անգամ լվացեք IP բուֆերով։ Այնուհետև կապված սպիտակուցներն էքստրակցիայի ենթարկեք SDS-PAGE բեռնման բուֆերով՝ 5 րոպե տաքացնելով 95°C ջերմաստիճանում։

C. Իմունապրեցիպիտացիա

• Վերցրեք 200 μl բջջային լիզատ և ավելացրեք առաջնային հակամարմին։ Ինկուբացրեք ամբողջ գիշեր՝ մեղմ ճոճելով, 4°C ջերմաստիճանում։
• Ավելացրեք A կամ G սպիտակուցով ագարոզային հատիկներ (20 μl՝ հատիկների 50% սուսպենզիայից)։ Ինկուբացրեք 1–3 ժամ՝ մեղմ ճոճելով, 4°C ջերմաստիճանում։
• Միկրոցենտրիֆուգեք 30 վայրկյան՝ 4°C ջերմաստիճանում։ Նստվածքը հինգ անգամ լվացեք 500 µl 1X բջջային լիզիսի բուֆերով։ Լվացումների ընթացքում պահեք սառույցի վրա։
• Նստվածքը կրկին սուսպենդացրեք 20 μl 3X SDS նմուշային բուֆերում։ Խառնեք վորտեքսով, ապա միկրոցենտրիֆուգեք 30 վայրկյան։
• Նմուշը 2–5 րոպե տաքացրեք մինչև 95–100°C և միկրոցենտրիֆուգեք 1 րոպե՝ 14 000 X g պայմաններում։
• Նմուշը (15–30 μl) բեռնեք SDS-PAGE գելի վրա (12–15%)։
• Նմուշը վերլուծեք վեստերն բլոթինգով։

Վեստերն բլոթ վերլուծություն UP50H ուլտրաձայնային սարքով

Զոնդային տիպի UP50H ուլտրաձայնային սարքի կիրառմամբ հետևյալ արձանագրությունն օգտագործվել է Kriebisch և համահեղինակների հետազոտությունում (2011)՝
Ընդհանուր սպիտակուցն առանձնացվել է MC3T3-E1 բջիջներից, որոնք մշակվել էին 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) միացությամբ կամ կրիչով։ Բջիջները լիզիսի են ենթարկվել հետևյալ բաղադրիչները պարունակող բուֆերով՝ 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich), 150 mM NaCl (Fisher Scientific), 0,1% նատրիումի դոդեցիլսուլֆատ (SDS) (Fisher Scientific), 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) և 0,5% նատրիումի դեզօքսիխոլատ (Merck)։ Բջջային լիզատը մշակվել է ուլտրաձայնով 2 × 10 s՝ ցիկլը սահմանելով 1, իսկ ամպլիտուդը՝ 80, օգտագործելով UP50H ուլտրաձայնային պրոցեսորը (Hielscher, ուլտրաձայնային տեխնոլոգիա, Տելտով, Գերմանիա)։ Այնուհետև նյութը ցենտրիֆուգվել է 10 min՝ 14 000 rpm պայմաններում, և վերնստվածքային հեղուկն օգտագործվել է վեստերն բլոթինգի համար։ Քսանհինգ μg սպիտակուցը եռացվել է նմուշային բուֆերում և վերականգնիչ նյութում (Invitrogen), ապա տարանջատվել SDS-PAGE մեթոդով՝ օգտագործելով 4–12% պոլիակրիլամիդային գելեր (Invitrogen), և տեղափոխվել նիտրոցելյուլոզային թաղանթի վրա (GE health care)։ Թաղանթը բլոկավորվել է 1 h՝ 1% կազեին (Sigma-Aldrich) և 1% Tris (1 M) պարունակող TBS լուծույթով (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl)։ Բլոկավորումից հետո թաղանթը ամբողջ գիշեր ինկուբացվել է 4°C ջերմաստիճանում՝ թեթև խառնելով, առաջնային հակամարմնի հետ (ճագարի հակամարմին՝ մարդու CBS-ի նկատմամբ, 1/500, ստացված պրոֆ. R. Banerjee-ի լաբորատորիայում, Էն Արբոր, Միչիգան, ԱՄՆ)։ Ծովաբողկի պերօքսիդազի (HPR) հետ կոնյուգացված երկրորդային հակամարմնով (Dako) ինկուբացիան կատարվել է 1 h՝ սենյակային ջերմաստիճանում։ Բոլոր բլոթերը տեսանելի են դարձվել ուժեղացված քեմիլյումինեսցենցիայի միջոցով (Perkin Elmer)։
 

Սեղմեք այստեղ՝ բջիջների ուլտրաձայնային լիզիսի և էքստրակցիայի լավագույն գործելակերպերի, լիզատի պատրաստման և գործընթացի բարելավման առաջարկությունների մասին ավելին կարդալու համար։
 
Ստորև բերված աղյուսակը պատկերացում է տալիս մեր լաբորատոր չափերի ուլտրաձայնային սարքերի մոտավոր մշակման կարողության մասին՝

Գրականություն / Հղումներ

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.