Ուլտրաձայնային Լիզիս Western Blotting-ի համար

• Վեսթերն բլոտը վերլուծական պրոցեդուրա է հյուսվածքների միաձուլման կամ բջջային էքստրակտի նմուշում հատուկ սպիտակուցների հայտնաբերման համար:
• Վեսթերն բլոտ անցկացնելու կամ ֆերմենտի ակտիվությունը չափելու համար շատ փորձարկումներ պահանջում են մուտք դեպի բջջում փակված նյութեր (օրինակ՝ սպիտակուցներ, ԴՆԹ, ենթաբջջային բեկորներ):
• Sonication-ը հուսալի և հեշտ կառավարելի մեթոդ է բջիջների վերահսկվող խանգարման և լիզիսի համար:

Ուլտրաձայնային բջիջների խանգարում

Հյուսվածքներից և աճեցված բջիջներից սպիտակուցի արդյունահանումը առաջին քայլն է բազմաթիվ կենսաբանական, կենսաքիմիական և անալիտիկ մեթոդների համար (PAGE, Western blotting, ELISA, զանգվածային սպեկտրոմետրիա և այլն) կամ սպիտակուցների մաքրման համար: Բարձր սպիտակուցային ելք ստանալու համար բջիջների նյութը և հյուսվածքը պետք է արդյունավետ կերպով խափանվեն/լիզացվեն: Անկախ նրանից, թե բույսերի բջիջները կամ կենդանական հյուսվածքները, sonication-ը ձեր բջիջների լիզատը հեշտ և արագ պատրաստելու մեթոդ է:

Sonication-ի առավելությունները

• Արագ & Արդյունավետ
• Հեշտ շահագործում
• սպիտակուցի բարձր եկամտաբերություն
• վերարտադրելի/կրկնվող
• ճշգրիտ վերահսկվող
• մասշտաբային

Արևմտյան իմունոբլոտինգի իմունոպրեցիպիտացիայի արձանագրություն

A. Ռեակտիվներ

Լուծույթների պատրաստման համար օգտագործեք մաքրված ջուր, ինչպիսին Milli-Q-ն է:

• 1X ֆոսֆատ բուֆերացված ֆիզիոլոգիական լուծույթ (PBS)
• 1X Բջջային լիզի բուֆեր՝ 20 մՄ Տրիս (pH 7,5), 150 մՄ NaCl, 1 մՄ EDTA, 1 մՄ EGTA, 1% Տրիտոն X-100, 2,5 մՄ Նատրիումի պիրոֆոսֆատ, 1 մՄ β-գլիցերոֆոսֆատ, 1 մՄ բ-գլիցերոֆոսֆատ, 1 մՄ մկՎգ/Օ3 մլ Լեյպեպտին
  Կարևոր է. Օգտագործելուց անմիջապես առաջ ավելացրեք 1 մմ PMSF:
• 15 մկլ սպիտակուց A+15 մկլ սպիտակուց G-ը բավարար է IP-ի համար, բայց դա կարող է կախված լինել ձեր առաջնային հակամարմիններից և նմուշի ծավալից: Դուք կարող եք նաև օգտագործել նախապես խառը սպիտակուց A/G ագարոզա (օրինակ՝ A Protein-ը նապաստակի IgG-ի համար և Protein G-ը մկնիկի IgG-ի համար)
• 3X SDS Նմուշի բուֆեր՝ 187,5 մՄ Տրիս-HCl (pH 6,8 25°C-ում), 6% w/v SDS, 30% գլիցերին, 150 մՄ DTT, 0,03% w/v բրոմֆենոլ կապույտ

Բ. Բջջային լիզատների պատրաստում

• Հավաքեք բջիջները: Բջիջները չդենատուրացնող պայմաններում հավաքելու համար հեռացրեք միջավայրը և մեկ անգամ ողողեք բջիջները սառցե PBS-ով:
• Հեռացրեք PBS-ը և յուրաքանչյուր թիթեղին (10 սմ) ավելացրեք 0,5 մլ սառույցով սառը 1X բջիջների լիզի բուֆեր և 5 րոպե ինկուբացրեք թիթեղները սառույցի վրա:
• Մաքրեք բջիջները թիթեղներից և տեղափոխեք միկրոցենտրիֆուգային խողովակներ: Պահպանեք սառույցի վրա:
• Երկու անգամ 10 վայրկյանի ընթացքում արտահոսքավորեք սառույցով իմունային նստվածքային բուֆերի մեջ (IP բուֆեր՝ 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40 և պրոթեզերոնի ինհիբիտորների խառնուրդ): Համար sonication, որ VialTweeter կամ զոնդ ուլտրաձայնային սարք, ինչպիսին է UP100H կամ UP200Ht առավել հարմար են.
• Լիզատները ցենտրիֆուգեք 15000 գ-ում 10 րոպե 4°C-ում:
• Տեղափոխեք վերին նյութը նոր խողովակի մեջ: (Անհրաժեշտության դեպքում լիզատը կարող է պահվել –80°C ջերմաստիճանում):
• Ավելացրեք առաջնային հակամարմինը վերին նյութին: Առաջնային հակամարմինով գերնաթանը ինկուբացվում է 1 ժամ 4°C-ում թեթև հուզման ներքո: Առաջնային հակամարմինները սովորաբար ավելացվում են 10 անգամ ավելի խտացված քանակությամբ, քան օգտագործվում է western blotting-ի համար: (Դուք կարող եք սկսել 1մկգ 100մլ-ից):
• Այնուհետև ավելորդ նյութը ինկուբացվում է նույն քանակությամբ սպիտակուց A-agarose (Invitrogen) և Protein G ագարոզայի խառնուրդով ևս 1 ժամ:
• Լվացեք ագարոզայի գնդիկները երեք անգամ IP բուֆերով: Այնուհետև արդյունահանեք կապակցված սպիտակուցները SDS-PAGE բեռնման բուֆերով՝ տաքացնելով 95°C-ում 5 րոպե:

C. Իմունային տեղումներ

• Վերցրեք 200 մկլ բջջային լիզատ և ավելացրեք առաջնային հակամարմին: Ինկուբացնել մեղմ ճոճելով գիշերը 4°C ջերմաստիճանում:
• Ավելացրեք սպիտակուց A կամ G ագարոզայի ուլունքներ (20 մկլ 50% բշտիկի փոշի): Ինկուբացնել մեղմ օրորումներով 1–3 ժամ 4°C ջերմաստիճանում:
• Միկրոցենտրիֆուգեք 30 վայրկյան 4°C-ում: Լվացեք գնդիկը հինգ անգամ 500 մկլ 1X բջիջների լիզի բուֆերով: Լվացքի ժամանակ պահել սառույցի վրա։
• Գնդիկը նորից կասեցրեք 20 մկլ 3X SDS նմուշի բուֆերով: Vortex, ապա միկրոցենտրիֆուգ 30 վայրկյան:
• Նմուշը տաքացրեք մինչև 95–100°C 2–5 րոպե և միկրոցենտրիֆուգեք 1 րոպե 14000 X գ ջերմաստիճանում։
• Նմուշը (15–30 մկլ) լցրեք SDS-PAGE գելի վրա (12–15%)։
• Վերլուծեք նմուշը Western blotting-ով:

Western Blot վերլուծություն Sonicator UP50H-ով

Kriebisch et al-ի ուսումնասիրության ժամանակ օգտագործվել է զոնդի տիպի UP50H ձայնային սարքի օգտագործմամբ հետևյալ արձանագրությունը: (2011):
Ընդհանուր սպիտակուցը մեկուսացվել է MC3T3-E1 բջիջներից, որոնք վերաբերվել են 1,25(OH)₂Դ₃ (10⁻⁸ Մ) կամ տրանսպորտային միջոց: Բջիջները լիզվել են 50 մՄ տրիս HCl պարունակող բուֆերով, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 մՄ NaCl (Fisher Scientific); 0.1% նատրիումի դոդեցիլ սուլֆատ (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) և 0.5% նատրիումի դեզօքսիքոլատ (Merck): Բջջային լիզատը 2 × 10 վրկ 1 ցիկլով և 80 ամպլիտուդով սոնիկացվել է UP50H ուլտրաձայնային պրոցեսոր (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Գերմանիա): Այնուհետև նյութը ցենտրիֆուգվել է 10 րոպե 14,000 պտտ/րոպե արագությամբ, և վերը նշված նյութն օգտագործվել է Western blotting-ի համար: Քսանհինգ մկգ սպիտակուցը եփվել է նմուշի բուֆերի և վերականգնող նյութի մեջ (Invitrogen) և այնուհետև առանձնացվել SDS-PAGE-ով՝ օգտագործելով 4–12% պոլիակրիլամիդ գելեր (Invitrogen) և տեղափոխվել նիտրոցելյուլոզային թաղանթ (GE health care): Մեմբրանը 1 ժամով արգելափակվել է TBS-ով (10 mM Tris-HCl; pH 7.6; 150 mM NaCl), որը պարունակում է 1% կազեին (Sigma-Aldrich) և 1% Tris (1 M): Արգելափակումից հետո թաղանթը թեթև հուզմունքով ինկուբացվել է գիշերը 4°C ջերմաստիճանում առաջնային հակամարմինով (նապաստակի հակամարդկային CBS 1/500, մշակված պրոֆ. Ռ. Բաներջիի լաբորատորիայում, Էն Արբոր, MI, ԱՄՆ): Ինկուբացիա ծովաբողկի պերօքսիդազի (HPR) կոնյուգացված երկրորդական հակամարմինով (Dako) կատարվել է 1 ժամ սենյակային ջերմաստիճանում: Բոլոր բլոտները մշակվել են ուժեղացված քիմիլյումինեսցենտով (Perkin Elmer):
 

Կտտացրեք այստեղ՝ ավելին կարդալու ուլտրաձայնային բջիջների լիզման և արդյունահանման լավագույն փորձի, լիզատի պատրաստման և գործընթացի բարելավման վերաբերյալ առաջարկությունների մասին:
 
Ստորև բերված աղյուսակը ցույց է տալիս մեր լաբորատոր չափի ուլտրաձայնային սարքերի մոտավոր մշակման հզորությունը.

Գրականություն / Հղումներ