Ուլտրաձայնային լիզիզ Western Blotting- ի համար

  • Արեւմտյան չորացնել վերլուծական կարգը հայտնաբերման հատուկ սպիտակուցներ մի նմուշ հյուսվածքների homogenate կամ բջջային քաղվածքների.
  • Է առաջադրվել արեւմտյան չորացնել կամ չափել enzyme գործունեություն, շատ assays պահանջում մուտք դեպի նյութերի (օրինակ սպիտակուցներ, ԴՆԹ, subcellular դրվագներ) խճճվել է խցում:
  • Sonication է հուսալի եւ հեշտ-ի բռնակի մեթոդ վերահսկվող բջջային կազմալուծման եւ lysis:

Ուլտրաձայնային Բջջային կազմալուծման

Սպիտակուցը հանույթ հյուսվածքների եւ կուլտուրական բջիջների առաջին քայլն է շատ կենսաբանական, կենսաքիմիական եւ վերլուծական մեթոդների (էջ, արեւմտյան blotting, Elisa, զանգվածային սպեկտրաչափության, եւ այլն) կամ սպիտակուցային մաքրման. Ստանալու բարձր սպիտակուցը եկամտաբերություն, բջջային նյութական եւ հյուսվածք պետք է արդյունավետ դադարեցրեցին / lysed: Անկախ նրանից, թե բուսական բջջի կամ կենդանական հյուսվածքի, sonication մեթոդը պատրաստել ձեր բջջային lysate հեշտ է եւ արագ:

Առավելությունները sonication

  • արագ & էֆեկտիվ
  • հեշտ շահագործում
  • բարձր սպիտակուցը եկամտաբերությունը
  • reproducible / պարբերաբար
  • ճիշտ վերահսկվող
  • ընդլայնելի

Տեղեկատվության պահանջ





Hielscher's VialTweeter is ideal for the lysis of multiple samples

VialTweeter sonicator Ուլտրաձայնային նմուշի պատրաստման համար, ինչպիսիք են բջիջների խանգարումը և սպիտակուցի մեկուսացումը

Immunoprecipitation արձանագրություն Արեւմտյան Immunoblotting

Ա Ռեակտիվ

Պատրաստման համար լուծումների, օգտագործել զտած ջուր, ինչպիսիք են Միլլի-Q:

  • 1X ֆոսֆատ բուֆերացված Saline (PBS)
  • 1X Բջջային Lysis բուֆերային: 20 մմ Tris (pH 7.5), 150 մմ NaCl, 1 մմ EDTA, 1 մմ EGTA, 1% Triton X-100, 2.5 մմ Նատրիումի պիրոֆոսֆատ, 1 մմ β-glycerophosphate, 1 մմ Na3VO4, 1 մկգ / մլ Leupeptin
    Կարեւոր է: ավելացնել 1 մմ PMSF անմիջապես առաջ է օգտագործել.
  • 15 մկլ Protein A + 15 մկլ Protein G համար բավարար IP, սակայն դա կարող է կախված լինել ձեր առաջնային antibody եւ նմուշի ծավալը: Դուք կարող եք նաեւ օգտագործել նախընտրական խառը սպիտակուցը A / G agarose (օրինակ Սպիտակուցներ A նապաստակի IgG քաշեք ներքեւ եւ Սպիտակուցներ G համար մկնիկի IgG քաշեք ներքեւ)
  • 3X SDS Sample բուֆերային: 187,5 մմ Tris-HCl (pH 6,8-ին, 25 ° C), 6% w / վ SDS, 30% գլիցերինի, 150 մմ DTT, 0.03% w / v bromophenol կապույտ

Բ պատրաստում Բջջային Lysates

  • Բերքի բջիջները: Բերքը բջիջները տակ nondenaturing պայմաններում, հեռացնել լրատվամիջոցներին եւ ողողել բջիջները մեկ անգամ Ice-cold PBS.
  • Հեռացնել PBS եւ ավելացնել 0.5 մլ Ice-cold 1x բջջային lysis բուֆեր, յուրաքանչյուր ափսեի (10 սմ) եւ թուխս նստել թիթեղները վրա սառույցի համար 5 րոպե:
  • Քսել բջիջների դուրս սալերի եւ փոխանցել microcentrifuge խողովակներ. Պահպանեք վրա սառույցի.
  • Sonicate երկու անգամ 10 վայրկյան է սառույցի սառը immunoprecipitation բուֆերում (IP բուֆերի 50 մմ Tris-HCl [pH 7.4], 150 մմ NaCl, 5 մմ EDTA, 0.1% NP-40 եւ պրոտեազների արգելակիչ խառնուրդ): Համար sonication, որ VialTweeter- ը կամ զոնդ ultrasonicator, ինչպիսիք են UP100H կամ Uf200 ः տ առավել հարմար.
  • Ցենտրիֆուգ է lysates 15000 g 10 րոպե 4 ° C:
  • Փոխանցում է supernatant է նոր խողովակի. (Անհրաժեշտության դեպքում, lysate կարող են պահվել է -80 ° C):
  • Ավելացնել հիմնական antibody է supernatant: The supernatant հետ առաջնային antibody է հիմնադրամի համար 1 ժ 4 ° C ջերմաստիճանի պայմաններում թեթեւ քարոզչությունից: Առաջնային antibody է, որպես կանոն ավելացված գումարի 10x ավելի կենտրոնացված է, քան օգտագործվում է արեւմտյան blotting. (Դուք կարող եք սկսել 1μg մեկ 100μL)
  • The supernatant ապա ինկուբացման հետագա հետ խառնուրդից հավասար քանակությամբ սպիտակուց-agarose (Invitrogen) եւ Protein G agarose համար եւս 1 ժ.
  • Լվանում է agarose կարկուտ երեք անգամ IP բուֆերի: Այնուհետեւ, արդյունահանման պարտավորված սպիտակուցներ հետ SDS-էջի բեռնման բուֆերում կողմից ջեռուցման 95 ° C է 5 րոպե.

C. Իմունոպրիտիտացիա

  • Վերցրեք 200 մկլ բջջային lysate եւ ավելացնել առաջնային antibody: Աճեցնելհասունանալ հետ նուրբ ճոճվող գիշերում է 4 ° C:
  • Ավելացնել կամ սպիտակուցային կամ G agarose beads (20 մկլ 50% կաթիլ slurry): Աճեցնելհասունանալ հետ նուրբ ճոճվող համար 1-3 ժամ 4 ° C:
  • Microcentrifuge է 30 վայրկյան 4 ° C: Լվանալ գնդիկ հինգ անգամ 500 մկլ է 1x բջջային lysis բուֆերի: Պահպանեք վրա սառույցի ընթացքում լվանում.
  • Resuspend գնդիկ հետ 20 մկլ 3X SDS ընտրանքային բուֆերի: Vortex, ապա microcentrifuge համար 30 վայրկյան:
  • Տաքացնել նմուշ 95-100 ° C է 2-5 րոպե եւ microcentrifuge 1 րոպեի 14000 X գ.
  • Բեռնել նմուշը (15-30 մկլ) վրա SDS-PAGE գել (12-15%):
  • Վերլուծել նմուշը արեւմտյան blotting:

Western Blot վերլուծություն Sonicator UP50H-ով

Kriebisch et al-ի ուսումնասիրության ժամանակ օգտագործվել է զոնդի տիպի UP50H ձայնային սարքի օգտագործմամբ հետևյալ արձանագրությունը: (2011):
Ուլտրաձայնային զոնդի տիպի հոմոգենիզատոր UP50H սովորաբար օգտագործվում է բջիջների խզման և սպիտակուցի մեկուսացման համար՝ որպես նմուշի պատրաստման քայլ՝ նախքան Western Blotting-ը:Ընդհանուր սպիտակուցը մեկուսացված է եղել MC3T3-E1 բջիջների վերաբերվում 1,25 (OH)2Դ3 (10-8 M) կամ մեքենան. Խցերը lysed հետ բուֆերի պարունակում է 50 մմ Tris HCl, pH 8 (Սիգմա-Aldrich). 150 մմ NaCl (Fisher Scientific). 0.1% նատրիումի dodecyl sulfate (SDS) (Fisher Scientific). 1% IGEPAL CA-630 (Սիգմա-Aldrich) եւ 0.5% նատրիումի deoxycholate (Merck): Այդ խուցը lysate էր sonicated է 2 × 10 վ է ցիկլի 1 եւ առատություն 80 հետ UP50H Ուլտրաձայնային Processor (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Գերմանիա): Դրանից հետո նյութը ցենտրիֆուգավորվում էր 14.000 ռ / ժ-ով 10 րոպեով, իսկ արեւայրուկը օգտագործվում էր արեւմտյան բլոտման համար: Քսանհինգ մկգ սպիտակուցը խառնվել է նմուշային բուֆերի եւ նվազեցնող նյութի (Invitrogen) եւ հետագայում բաժանվել SDS-PAGE- ի միջոցով, օգտագործելով 4-12% polyacrylamide gels (Invitrogen) եւ փոխանցվել մի nitrocellulose մեմբրանի (GE առողջապահության): Մեմբրանը 1 րոպե արգելափակվեց TBS- ի հետ (10 մմ Tris-HCl, pH 7.6, 150 մմ NaCl), որը պարունակում է 1% քազին (Sigma-Aldrich) եւ 1% Tris (1 M): Արգելափակելուց հետո մեմբրանը քերծվեց մի փոքր խառնվացումով 4 ° C- ով, առաջնային հակամարմիններով (ճարպային հակահայկական CBS 1/500, որը մշակվել է պրոֆեսոր Ռ.Բանեերիի, Էնն Արբորի, MI, ԱՄՆ): Անջրանցիկ ծովային պերօքսիդազով (HPR) - համակցված երկրորդային հակաբորբի (Dako) ինկուբացիան կատարվեց սենյակային ջերմաստիճանում 1 ժամ: Բոլոր բլոտները մշակվել են ուժեղացված chemiluminescence (Perkin Elmer) կողմից:
 

Այս ձեռնարկը բացատրում է, թե որ տեսակի sonicator-ն է լավագույնը ձեր նմուշի պատրաստման առաջադրանքների համար, ինչպիսիք են լիզիսը, բջիջների խանգարումը, սպիտակուցի մեկուսացումը, ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի մասնատումը լաբորատորիաներում, վերլուծություններ և հետազոտություններ: Ընտրեք իդեալական sonicator տեսակը ձեր դիմումի, նմուշի ծավալի, նմուշի համարի և թողունակության համար: Hielscher Ultrasonics-ը ձեզ համար ունի իդեալական ուլտրաձայնային հոմոգենիզատոր:

Ինչպես գտնել կատարյալ Sonicator բջիջների խանգարման և սպիտակուցի արդյունահանման համար գիտության և վերլուծության մեջ

Տեսանյութի մանրապատկեր

 

Կտտացրեք այստեղ՝ ավելին կարդալու ուլտրաձայնային բջիջների լիզման և արդյունահանման լավագույն փորձի, լիզատի պատրաստման և գործընթացի բարելավման վերաբերյալ առաջարկությունների մասին:
 
Ստորև բերված աղյուսակը ցույց է տալիս մեր լաբորատոր չափի ուլտրաձայնային սարքերի մոտավոր մշակման հզորությունը.

Առաջարկվող սարքեր խմբաքանակի Volume Ծախսի Rate
UIP400MTP 96- Well Plate Sonicator բազմաբնակարան հորատանցք / միկրոտիտրային թիթեղներ na
Ուլտրաձայնային cuphorn CupHorn սրվակների կամ բաժակի համար na
GDmini2 ուլտրաձայնային միկրո հոսքի ռեակտոր na
VialTweeter- ը 0.5-ից մինչեւ 1.5 մկ na
UP100H 1-ից 500 մլ 10-ից մինչեւ 200 մլ / վրկ
Uf200 ः տ,, UP200St 10-ից 1000 մլ 20-ից 200 մլ / րոպե
UP400St 10-ից մինչեւ 2000 մլ 20-ից 400 մլ / վրկ
ուլտրաձայնային մաղով թափահարող na na

Կապ մեզ հետ | / Հարցրեք մեզ!

Հարցրեք ավելին

Խնդրում ենք օգտագործել ստորև բերված ձևը, որպեսզի լրացուցիչ տեղեկություններ խնդրեք մեր sonicators-ի մասին՝ նախքան Western Blots-ը նմուշի պատրաստման, կիրառման մանրամասն արձանագրությունների և գնի համար: Մենք ուրախ կլինենք ձեզ հետ քննարկել ձեր նմուշի պատրաստման գործընթացը և ձեզ առաջարկել ձեր պահանջները բավարարող ուլտրաձայնային համակարգ:









Խնդրում ենք նկատի ունենալ մեր Գաղտնիության քաղաքականություն,


Միկրոափսեները, բազմաբնակարանային թիթեղները, PCR թիթեղները և 96 ջրհորների թիթեղները կարող են հարմարավետ և միատեսակ ձայնագրվել UIP400MTP ափսեի ձայնային սարքի միջոցով:

UIP400MTP Plate Sonicator 96 ջրհորի թիթեղների բարձր թողունակության ձայնային ախտահանման համար



Արեւմտյան blotting

Blots են վերլուծական ընթացակարգեր, որտեղ ԴՆԹ, ՌՆԹ-ի եւ սպիտակուցներ են տեղափոխել կրիչի այնպես, որ նրանք կարող են առանձնացվել:
Որ Հարավային բիծ համար օգտագործվում է հայտնաբերման ԴՆԹ, Հյուսիսային blot համար RNA եւ Արեւմտյան blot համար սպիտակուցներ:
Արեւմտյան blotting կոչվում է նաեւ սպիտակուցային immunoblotting, քանի որ antibody, որն օգտագործվում է հատուկ հայտնաբերելու իր անտիգեն: The Western blotting մեկն է առավել կարեւոր վերլուծության մեթոդների հայտնաբերելու հատուկ սպիտակուցներ նմուշի. Արեւմտյան blot, սպիտակուցներ են immobilized վրա մեմբրաններ է հայտնաբերել դրանք օգտագործելով մոնոկլոնային կամ polyclonal հակամարմիններ:
SDS-polyacrylamide գել էլեկտրոֆոռեզով (SDS-PAGE) բնիկ սպիտակուցները բաժանվում են 3-D կառուցվածքով կամ դիատրատիզացված սպիտակուցներով `պոլիպեպտիդի երկարությամբ: Այնուհետեւ սպիտակուցները փոխանցվում են մեմբրանի (սովորաբար, nitrocellulose կամ PVDF), որտեղ նրանք գունատ են թիրախային սպիտակուցին հատուկ հակամարմիններով: Գել էլեկտրաֆորեզի քայլը ներառված է արեւմտյան բլոտի անալիզի մեջ `հակատոկիների խաչաձեւ ռեակտիվության խնդրի լուծման համար:
Այնուհետեւ, առանձնացված սպիտակուցները blotted վրա matrix (հիմնականում մի nitrocellulose կամ PVDF մեմբրանի), որտեղ նրանք վիտրաժներ են հակամարմինների. Հակամարմինները գործում են որպես զոնդ եւ ընտրվում են հատուկ թիրախային սպիտակուցին: Վերոհիշյալ ռեակցիայի տեղանքի եւ ինտենսիվության վերլուծությունը ցույց է տալիս տվյալ նմուշի թիրախային սպիտակուցների արտահայտման մանրամասները: Western blotting- ը կարող է հայտնաբերել թիրախային սպիտակուցը, որն այնքան ցածր է, քան 1 նչը, քանի որ գել էլեկտրոֆորեզի բարձր հստակության եւ իմունային ինֆեկցիայի բարձր հստակության եւ բարձր զգայունության պատճառով: Western blot մեթոդը օգտագործվում է մոլեկուլյար կենսաբանության, կենսաքիմիայի, իմունոգենետիկայի եւ այլ մոլեկուլային հետազոտությունների ոլորտներում:
Այլ հարակից մեթոդներից են dot blot վերլուծություն, immunohistochemistry եւ immunocytochemistry որտեղ հակամարմիններ են օգտագործվել է հայտնաբերել սպիտակուցներ հյուսվածքների եւ բջիջների կողմից immunostaining, եւ enzyme կապված immunosorbent պարունակությամբ (Elisa):


Գրականություն / Հղումներ

Complete VialTweeter setup: VialTweeter sonotrode է ուլտրաձայնային պրոցեսոր UP200St

VialTweeter sonicator մի քանի սրվակների միաժամանակյա նմուշի պատրաստման համար

Կապ մեզ հետ | / Հարցրեք մեզ!





Խնդրում ենք նկատի ունենալ մեր Գաղտնիության քաղաքականություն,


Sonication է կարեւոր քայլ է ժամանակ ընտրանքային նախապատրաստման

UP200St միկրո-tip համար ընտրանքային sonication

Մենք ուրախ կլինենք քննարկել ձեր գործընթացը:

Եկեք կապ հաստատենք: