Hielscher ուլտրաձայնային տեխնոլոգիա

Ուլտրաձայնային լիզիզ Western Blotting- ի համար

  • Արեւմտյան չորացնել վերլուծական կարգը հայտնաբերման հատուկ սպիտակուցներ մի նմուշ հյուսվածքների homogenate կամ բջջային քաղվածքների.
  • Է առաջադրվել արեւմտյան չորացնել կամ չափել enzyme գործունեություն, շատ assays պահանջում մուտք դեպի նյութերի (օրինակ սպիտակուցներ, ԴՆԹ, subcellular դրվագներ) խճճվել է խցում:
  • Sonication է հուսալի եւ հեշտ-ի բռնակի մեթոդ վերահսկվող բջջային կազմալուծման եւ lysis:

Ուլտրաձայնային Բջջային կազմալուծման

Սպիտակուցը հանույթ հյուսվածքների եւ կուլտուրական բջիջների առաջին քայլն է շատ կենսաբանական, կենսաքիմիական եւ վերլուծական մեթոդների (էջ, արեւմտյան blotting, Elisa, զանգվածային սպեկտրաչափության, եւ այլն) կամ սպիտակուցային մաքրման. Ստանալու բարձր սպիտակուցը եկամտաբերություն, բջջային նյութական եւ հյուսվածք պետք է արդյունավետ դադարեցրեցին / lysed: Անկախ նրանից, թե բուսական բջջի կամ կենդանական հյուսվածքի, sonication մեթոդը պատրաստել ձեր բջջային lysate հեշտ է եւ արագ:

Առավելությունները sonication

  • արագ & էֆեկտիվ
  • հեշտ շահագործում
  • բարձր սպիտակուցը եկամտաբերությունը
  • reproducible / պարբերաբար
  • ճիշտ վերահսկվող
  • ընդլայնելի

Immunoprecipitation արձանագրություն Արեւմտյան Immunoblotting

Ա Ռեակտիվ

Պատրաստման համար լուծումների, օգտագործել զտած ջուր, ինչպիսիք են Միլլի-Q:

  • 1X ֆոսֆատ բուֆերացված Saline (PBS)
  • 1X Բջջային Lysis բուֆերային: 20 մմ Tris (pH 7.5), 150 մմ NaCl, 1 մմ EDTA, 1 մմ EGTA, 1% Triton X-100, 2.5 մմ Նատրիումի պիրոֆոսֆատ, 1 մմ β-glycerophosphate, 1 մմ Na3VO4, 1 մկգ / մլ Leupeptin
    Կարեւոր է: ավելացնել 1 մմ PMSF անմիջապես առաջ է օգտագործել.
  • 15 մկլ Protein A + 15 մկլ Protein G համար բավարար IP, սակայն դա կարող է կախված լինել ձեր առաջնային antibody եւ նմուշի ծավալը: Դուք կարող եք նաեւ օգտագործել նախընտրական խառը սպիտակուցը A / G agarose (օրինակ Սպիտակուցներ A նապաստակի IgG քաշեք ներքեւ եւ Սպիտակուցներ G համար մկնիկի IgG քաշեք ներքեւ)
  • 3X SDS Sample բուֆերային: 187,5 մմ Tris-HCl (pH 6,8-ին, 25 ° C), 6% w / վ SDS, 30% գլիցերինի, 150 մմ DTT, 0.03% w / v bromophenol կապույտ
Hielscher's VialTweeter is is´deal for the lysis of multiple samples

VialTweeter- ը ուլտրաձայնային ընտրանքային Prep

Կապ մեզ հետ | / Հարցրեք մեզ!





Խնդրում ենք նկատի ունենալ մեր Գաղտնիության քաղաքականություն,


Sonication է կարեւոր քայլ է ժամանակ ընտրանքային նախապատրաստման

UP200St միկրո-tip համար ընտրանքային sonication

Բ պատրաստում Բջջային Lysates

  • Բերքի բջիջները: Բերքը բջիջները տակ nondenaturing պայմաններում, հեռացնել լրատվամիջոցներին եւ ողողել բջիջները մեկ անգամ Ice-cold PBS.
  • Հեռացնել PBS եւ ավելացնել 0.5 մլ Ice-cold 1x բջջային lysis բուֆեր, յուրաքանչյուր ափսեի (10 սմ) եւ թուխս նստել թիթեղները վրա սառույցի համար 5 րոպե:
  • Քսել բջիջների դուրս սալերի եւ փոխանցել microcentrifuge խողովակներ. Պահպանեք վրա սառույցի.
  • Sonicate երկու անգամ 10 վայրկյան է սառույցի սառը immunoprecipitation բուֆերում (IP բուֆերի 50 մմ Tris-HCl [pH 7.4], 150 մմ NaCl, 5 մմ EDTA, 0.1% NP-40 եւ պրոտեազների արգելակիչ խառնուրդ): Համար sonication, որ VialTweeter- ը կամ զոնդ ultrasonicator, ինչպիսիք են UP100H կամ Uf200 ः տ առավել հարմար.
  • Ցենտրիֆուգ է lysates 15000 g 10 րոպե 4 ° C:
  • Փոխանցում է supernatant է նոր խողովակի. (Անհրաժեշտության դեպքում, lysate կարող են պահվել է -80 ° C):
  • Ավելացնել հիմնական antibody է supernatant: The supernatant հետ առաջնային antibody է հիմնադրամի համար 1 ժ 4 ° C ջերմաստիճանի պայմաններում թեթեւ քարոզչությունից: Առաջնային antibody է, որպես կանոն ավելացված գումարի 10x ավելի կենտրոնացված է, քան օգտագործվում է արեւմտյան blotting. (Դուք կարող եք սկսել 1μg մեկ 100μL)
  • The supernatant ապա ինկուբացման հետագա հետ խառնուրդից հավասար քանակությամբ սպիտակուց-agarose (Invitrogen) եւ Protein G agarose համար եւս 1 ժ.
  • Լվանում է agarose կարկուտ երեք անգամ IP բուֆերի: Այնուհետեւ, արդյունահանման պարտավորված սպիտակուցներ հետ SDS-էջի բեռնման բուֆերում կողմից ջեռուցման 95 ° C է 5 րոպե.

C. Իմունոպրիտիտացիա

  • Վերցրեք 200 մկլ բջջային lysate եւ ավելացնել առաջնային antibody: Աճեցնելհասունանալ հետ նուրբ ճոճվող գիշերում է 4 ° C:
  • Ավելացնել կամ սպիտակուցային կամ G agarose beads (20 մկլ 50% կաթիլ slurry): Աճեցնելհասունանալ հետ նուրբ ճոճվող համար 1-3 ժամ 4 ° C:
  • Microcentrifuge է 30 վայրկյան 4 ° C: Լվանալ գնդիկ հինգ անգամ 500 մկլ է 1x բջջային lysis բուֆերի: Պահպանեք վրա սառույցի ընթացքում լվանում.
  • Resuspend գնդիկ հետ 20 մկլ 3X SDS ընտրանքային բուֆերի: Vortex, ապա microcentrifuge համար 30 վայրկյան:
  • Տաքացնել նմուշ 95-100 ° C է 2-5 րոպե եւ microcentrifuge 1 րոպեի 14000 X գ.
  • Բեռնել նմուշը (15-30 մկլ) վրա SDS-PAGE գել (12-15%):
  • Վերլուծել նմուշը արեւմտյան blotting:

Հետադարձ կապ / Հարցրեք ավելի շատ տեղեկությունների համար

Խոսեք մեզ ձեր վերամշակող պահանջներին. Մենք խորհուրդ ենք տալիս, որ ամենահարմար setup եւ վերամշակման պարամետրերի ձեր նախագծին.





Խնդրում ենք նկատի ունենալ մեր Գաղտնիության քաղաքականություն,


Լրացուցիչ sonication արձանագրությունները

Արեւմտյան Բլոտ վերլուծություն ultrasonicator UP50H

Հետեւելով արձանագրությունը օգտագործվում է ուսումնասիրության Kriebisch et al. (2011 թ.):
Ընդհանուր սպիտակուցը մեկուսացված է եղել MC3T3-E1 բջիջների վերաբերվում 1,25 (OH)2Դ3 (10-8 M) կամ մեքենան. Խցերը lysed հետ բուֆերի պարունակում է 50 մմ Tris HCl, pH 8 (Սիգմա-Aldrich). 150 մմ NaCl (Fisher Scientific). 0.1% նատրիումի dodecyl sulfate (SDS) (Fisher Scientific). 1% IGEPAL CA-630 (Սիգմա-Aldrich) եւ 0.5% նատրիումի deoxycholate (Merck): Այդ խուցը lysate էր sonicated է 2 × 10 վ է ցիկլի 1 եւ առատություն 80 հետ UP50H Ուլտրաձայնային Processor (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Գերմանիա): Դրանից հետո նյութը ցենտրիֆուգավորվում էր 14.000 ռ / ժ-ով 10 րոպեով, իսկ արեւայրուկը օգտագործվում էր արեւմտյան բլոտման համար: Քսանհինգ մկգ սպիտակուցը խառնվել է նմուշային բուֆերի եւ նվազեցնող նյութի (Invitrogen) եւ հետագայում բաժանվել SDS-PAGE- ի միջոցով, օգտագործելով 4-12% polyacrylamide gels (Invitrogen) եւ փոխանցվել մի nitrocellulose մեմբրանի (GE առողջապահության): Մեմբրանը 1 րոպե արգելափակվեց TBS- ի հետ (10 մմ Tris-HCl, pH 7.6, 150 մմ NaCl), որը պարունակում է 1% քազին (Sigma-Aldrich) եւ 1% Tris (1 M): Արգելափակելուց հետո մեմբրանը քերծվեց մի փոքր խառնվացումով 4 ° C- ով, առաջնային հակամարմիններով (ճարպային հակահայկական CBS 1/500, որը մշակվել է պրոֆեսոր Ռ.Բանեերիի, Էնն Արբորի, MI, ԱՄՆ): Անջրանցիկ ծովային պերօքսիդազով (HPR) - համակցված երկրորդային հակաբորբի (Dako) ինկուբացիան կատարվեց սենյակային ջերմաստիճանում 1 ժամ: Բոլոր բլոտները մշակվել են ուժեղացված chemiluminescence (Perkin Elmer) կողմից:

Գրականություն / հղումներ



Արեւմտյան blotting

Blots են վերլուծական ընթացակարգեր, որտեղ ԴՆԹ, ՌՆԹ-ի եւ սպիտակուցներ են տեղափոխել կրիչի այնպես, որ նրանք կարող են առանձնացվել:
Որ Հարավային բիծ համար օգտագործվում է հայտնաբերման ԴՆԹ, Հյուսիսային blot համար RNA եւ Արեւմտյան blot համար սպիտակուցներ:
Արեւմտյան blotting կոչվում է նաեւ սպիտակուցային immunoblotting, քանի որ antibody, որն օգտագործվում է հատուկ հայտնաբերելու իր անտիգեն: The Western blotting մեկն է առավել կարեւոր վերլուծության մեթոդների հայտնաբերելու հատուկ սպիտակուցներ նմուշի. Արեւմտյան blot, սպիտակուցներ են immobilized վրա մեմբրաններ է հայտնաբերել դրանք օգտագործելով մոնոկլոնային կամ polyclonal հակամարմիններ:
SDS-polyacrylamide գել էլեկտրոֆոռեզով (SDS-PAGE) բնիկ սպիտակուցները բաժանվում են 3-D կառուցվածքով կամ դիատրատիզացված սպիտակուցներով `պոլիպեպտիդի երկարությամբ: Այնուհետեւ սպիտակուցները փոխանցվում են մեմբրանի (սովորաբար, nitrocellulose կամ PVDF), որտեղ նրանք գունատ են թիրախային սպիտակուցին հատուկ հակամարմիններով: Գել էլեկտրաֆորեզի քայլը ներառված է արեւմտյան բլոտի անալիզի մեջ `հակատոկիների խաչաձեւ ռեակտիվության խնդրի լուծման համար:
Այնուհետեւ, առանձնացված սպիտակուցները blotted վրա matrix (հիմնականում մի nitrocellulose կամ PVDF մեմբրանի), որտեղ նրանք վիտրաժներ են հակամարմինների. Հակամարմինները գործում են որպես զոնդ եւ ընտրվում են հատուկ թիրախային սպիտակուցին: Վերոհիշյալ ռեակցիայի տեղանքի եւ ինտենսիվության վերլուծությունը ցույց է տալիս տվյալ նմուշի թիրախային սպիտակուցների արտահայտման մանրամասները: Western blotting- ը կարող է հայտնաբերել թիրախային սպիտակուցը, որն այնքան ցածր է, քան 1 նչը, քանի որ գել էլեկտրոֆորեզի բարձր հստակության եւ իմունային ինֆեկցիայի բարձր հստակության եւ բարձր զգայունության պատճառով: Western blot մեթոդը օգտագործվում է մոլեկուլյար կենսաբանության, կենսաքիմիայի, իմունոգենետիկայի եւ այլ մոլեկուլային հետազոտությունների ոլորտներում:
Այլ հարակից մեթոդներից են dot blot վերլուծություն, immunohistochemistry եւ immunocytochemistry որտեղ հակամարմիններ են օգտագործվել է հայտնաբերել սպիտակուցներ հյուսվածքների եւ բջիջների կողմից immunostaining, եւ enzyme կապված immunosorbent պարունակությամբ (Elisa):