BL21 բջիջների բջիջների վերլուծություն ՝ ուլտրաձայնային միջոցով
BL21 բջիջներ սպիտակուցների արտահայտման համար
BL21 բջիջը քիմիապես որակյալ E. coli բակտերիալ շտամ է, որը հարմար է վերափոխման և բարձր մակարդակի սպիտակուցների արտահայտման համար `օգտագործելով T7 RNA պոլիմերազ- IPTG ինդուկցիոն համակարգ: BL21 բջիջները թույլ են տալիս բարձր արդյունավետության սպիտակուցային արտահայտություն ցանկացած գենի, որը գտնվում է T7 պրոմոուտերի վերահսկողության տակ: E. coli շտամը BL21 (DE3) - T7 RNA պոլիմերազի վրա հիմնված սպիտակուցի արտադրողական շտամ է, որը զուգորդվում է T7 պրոմոուտերի վրա հիմնված արտահայտիչ վեկտորների հետ և լայնորեն կիրառվում է լաբորատորիաներում և արդյունաբերությունում ՝ նորածին սպիտակուցներ արտադրելու համար: BL21- ում (DE3), վերամշակված սպիտակուցը կոդավորող գենի արտահայտությունը արտագրվում է քրոմոսոմային կերպով կոդավորված T7 RNA պոլիմերազով (T7 RNAP), որն արտագրում է ութ անգամ ավելի արագ, քան սովորական E. coli RNAP: Սա BL21 (DE3) շտամը բարձր արդյունավետություն է հաղորդում և վերածում այն սպիտակուցների արտահայտման բջիջների առավել նախընտրելի համակարգերից մեկի:
Արձանագրություն ուլտրաձայնային լիզի և BL21 բջիջներից սպիտակուցի արդյունահանման համար
BL21 բջիջների բջիջների լիզիզացումը հիմնականում իրականացվում է ուլտրաձայնային միջոցով `նատրիումի լաուրոյլ սարկոսինատի (հայտնի է նաև որպես սարկոզիլ) հետ միասին` որպես լիզի բուֆեր: Ուլտրաձայնային բջիջների խզման և սպիտակուցների արդյունահանման առավելությունները կայանում են ուլտրաձայնային սարքերի հուսալիության, վերարտադրելիության, ինչպես նաև պարզ, անվտանգ և արագ աշխատանքի մեջ: Ստորև բերված արձանագրությունը տալիս է քայլ առ քայլ ուղղություն ուլտրաձայնային BL21 բջիջների լիզացման համար.
Ուլտրաձայնային բջիջների խանգարող UP200St միկրո հուշող S26d2- ով `լիզիզմի և սպիտակուցի արդյունահանման համար
- Չապերոնային սպիտակուցները հեռացնելու համար BL21 մանրեային հատիկները վերակոդավորվել են 50 մլ սառցե սառը նատրիումի Tris-EDTA (STE) բուֆերում (բաղկացած է 10 մմ Tris-HCL, pH 8.0, 1 մմ EDTA, 150 մմ NaCl լրացված 100 մմ PMSF):
- Ավելացվում է 500 լիտր լիզոցիմը (10 մգ / մլ) և բջիջները 15 րոպե սառեցվում են սառույցի վրա:
- Դրանից հետո ավելացվում են 500 ul DTT և 7 մլ sarkosyl (10% (վտ / վ), որոնք կազմում են STE բուֆեր):
- Անհրաժեշտ է մաքրման բոլոր բուֆերները սառույցով պահել և նմուշները մշտապես պահպանել սառույցի վրա: Մաքրման բոլոր քայլերը հնարավորության դեպքում պետք է իրականացվեն սառը սենյակում:
- Ուլտրաձայնային լիզի և սպիտակուցի արդյունահանման համար նմուշները մոնտաժվում են VialTweeter MultiSample Ultrasonicator 4 x 30 վրկ-ի համար 100% ամպլիտուդայով `յուրաքանչյուր ձայնազերծման միջև 2 րոպե ընդմիջումով: Այլընտրանքորեն, զոնդային տիպի ուլտրաձայնային հոմոգենացուցիչ միկրո հուշումով, օրինակ, Uf200 ः տ կարող է օգտագործվել S26d2- ով (3 x 30 վրկ., 2 րոպե. դադար ուլտրաձայնային ցիկլերի միջև, 80% ամպլիտուդ):
- Մաքրման հետագա քայլերի համար նմուշները պետք է պահվեն սառույցի վրա կամ այլընտրանք պահվեն -80 ° C ջերմաստիճանում մինչև հետագա մշակումը:
Ուլտրաձայնային քսուկը նախասահմանված ջերմաստիճանի վերահսկողության ներքո
Կենսաբանական նմուշները մշակելիս կարևոր է ջերմաստիճանի ճշգրիտ և հուսալի կարգավորումը: Բարձր ջերմաստիճանը նմուշներում սկսում է ջերմորեն հարուցված սպիտակուցի քայքայումը:
Նմուշի պատրաստման բոլոր մեխանիկական տեխնիկայում, մթնեցումը ջերմություն է ստեղծում: Այնուամենայնիվ, VialTweeter- ի օգտագործման ժամանակ նմուշների ջերմաստիճանը կարելի է լավ վերահսկել: Մենք ձեզ ներկայացնում ենք տարբեր ընտրանքներ ձեր նմուշների ջերմաստիճանը վերահսկելու և վերահսկելու համար, մինչդեռ դրանք պատրաստում ենք VialTweeter- ի և VialPress- ի հետ վերլուծության համար:
- Նմուշի ջերմաստիճանի մոնիտորինգ. Ուլտրաձայնային UP200St պրոցեսորը, որը վարում է VialTweeter- ը, հագեցած է խելացի ծրագրակազմով և խցանվող ջերմաստիճանի տվիչով: Միացրեք ջերմաստիճանի տվիչը UP200St- ի մեջ և տեղադրեք ջերմաստիճանի տվիչի ծայրը նմուշի խողովակներից մեկում: Թվային գունավոր սենսորային էկրանով UP200St- ի ընտրացանկում կարող եք տեղադրել ձեր նմուշի ձայնազերծման համար նախատեսված հատուկ ջերմաստիճանի տիրույթ: Ուլտրաձայնագրիչը ավտոմատ կերպով կդադարի, երբ առավելագույն ջերմաստիճանը հասնի և դադարի, մինչև նմուշի ջերմաստիճանը իջնի սահմանված ջերմաստիճանի temperature ցածր արժեքի: Ապա վերամշակումը կրկին ավտոմատ կերպով սկսվում է: Այս խելացի առանձնահատկությունը կանխում է ջերմության պատճառով դեգրադացիան:
- VialTweeter բլոկը կարող է նախապես հովացվել: Տեղադրեք VialTweeter բլոկը (միայն սոնոտրոդը առանց փոխարկիչի!) Սառնարանի կամ սառցարանի մեջ, որպեսզի տիտանի բլոկը նախապես հովացնի, օգնում է հետաձգել նմուշի ջերմաստիճանի բարձրացումը: Հնարավորության դեպքում նմուշը կարող է նաև նախապես հովացվել:
- Օգտագործեք չոր սառույց `հովացման ընթացքում սառչելու համար: Օգտագործեք չոր սառույցով լցված մակերեսային սկուտեղ և տեղադրեք VialTweeter- ը սառույցի վրա, որպեսզի ջերմությունն արագորեն ցրվի:
Աշխարհում հաճախորդները օգտագործում են VialTweeter- ը և VialPress- ը կենսաբանական, կենսաքիմիական, բժշկական և կլինիկական լաբորատորիաներում իրենց ամենօրյա նմուշ պատրաստելու աշխատանքների համար: UP200St պրոցեսորի խելացի ծրագրակազմը և ջերմաստիճանի հսկողությունը, ջերմաստիճանը հուսալիորեն վերահսկվում է և խուսափում ջերմության պատճառով նմուշի դեգրադացիայից: Ուլտրաձայնային նմուշի պատրաստումը VialTweeter- ի և VialPress- ի միջոցով տալիս է բարձր հուսալի և վերարտադրելի արդյունքներ:
Գտեք ուլտրաձայնային օպտիմալ խանգարիչը ձեր լիզի կիրառման համար
Hielscher Ultrasonics- ը լաբորատորիաների, նստարանային և արդյունաբերական մասշտաբային համակարգերի բարձրորակ ուլտրաձայնային բջիջների խանգարիչների և միատարրացուցիչների երկար տարիների փորձառու արտադրող է: Ձեր մանրէային բջիջների մշակույթի չափը, ձեր հետազոտության կամ արտադրության նպատակը և բջիջի ծավալը, որը պետք է մշակվի մեկ ժամում կամ օրը, էական գործոններ են ՝ ձեր դիմումի համար ուլտրաձայնային բջիջների ճիշտ խանգարիչը գտնելու համար:
Hielscher Ultrasonics- ն առաջարկում է բազմազան նմուշների միաժամանակյա ձայնազերծման տարբեր լուծումներ (մինչև 10 սրվակ VialTweeter- ով) և զանգվածային նմուշներ (այսինքն `միկրոտիտր ափսեներ / ELISA ափսեներ UIP400MTP- ով), ինչպես նաև դասական զոնդային տիպի լաբորատոր ուլտրաձայնիչ` տարբեր էլեկտրաէներգիայի մակարդակը 50-ից 400 վտ-ից մինչև ամբողջությամբ արդյունաբերական ուլտրաձայնային պրոցեսորներ `մեկ արտադրամասում մինչև 16,000 վտ հզորությամբ` խոշոր արտադրության բջիջների առևտրի խափանումների և սպիտակուցների արդյունահանման համար: Բոլոր Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը կառուցված են 24/7/365 գործողության համար ՝ լիարժեք բեռի տակ: Ուժեղությունն ու հուսալիությունը մեր ուլտրաձայնային սարքերի հիմնական հատկություններն են:
Բոլոր թվային ուլտրաձայնային համասեռացուցիչները հագեցած են խելացի ծրագրակազմով, գունավոր սենսորային էկրանով և տվյալների ավտոմատ պրոտոկոլինգով, որոնք ուլտրաձայնային սարքը դարձնում են հարմար աշխատանքային գործիք լաբորատոր և արտադրական հաստատություններում:
Տեղեկացրեք մեզ, թե ինչպիսի բջիջներ, ինչ ծավալ, ինչ հաճախականությամբ և ինչ թիրախով պետք է մշակեք ձեր կենսաբանական նմուշները: Մենք ձեզ խորհուրդ կտանք ուլտրաձայնային բջիջների ամենահարմար խանգարիչը `ձեր գործընթացի պահանջների համար:
Ստորև բերված աղյուսակը ցույց է տալիս մեր ուլտրաձայնային համակարգերի մոտավոր մշակման կարողության ցուցումը կոմպակտ ձեռքի հոմոգենիզատորներից և MultiSample ուլտրաձայնիչներից մինչև արդյունաբերական ուլտրաձայնային պրոցեսորներ առևտրային ծրագրերի համար.
| խմբաքանակի Volume | Ծախսի Rate | Առաջարկվող սարքեր |
|---|---|---|
| 96 հորատանցք / միկրոտիտր ափսեներ | na | UIP400MTP |
| 10 սրվակ 0,5-ից 1,5 մլ-ով | na | VialTweeter ժամը UP200St |
| 0.01-ից 250 մլ | 5-ից 100 մլ / րոպե | UP50H- ը |
| 0.01-ից 500 մլ | 10-ից մինչեւ 200 մլ / վրկ | UP100H |
| 10-ից մինչեւ 2000 մլ | 20-ից 400 մլ / վրկ | Uf200 ः տ,, UP400St |
| 01-ից մինչեւ 20 լ | 02-ից 4 լ / րոպե | UIP2000hdT |
| 10-ից 100 լ | 2-ից 10 լ / րոպե | UIP4000hdT |
| na | 10-ից 100 լ / րոպե | UIP16000 |
| na | ավելի մեծ | Կլաստերի UIP16000 |
Կապ մեզ հետ | / Հարցրեք մեզ!
ultrasonicator Uf200 ः տ 2 մմ մանրադիտակի S26d2 փոքր նմուշների ձայնազերծման համար
Գրականություն / Հղումներ
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
Փաստեր Worth Իմանալով
Էշերիխիա Կոլի մանրէներ
Escherichia coli- ն մանրեների տեսակ է, որը ոչ սպորային, գրամ-բացասական է և բնութագրվում է ուղիղ ձողի տեսքով: E.coli բակտերիաները առկա են մարդու և կենդանիների միջավայրում, սննդում և աղիքներում: E. coli- ն սովորաբար շարժուն է `օգտագործելով ծայրամասային դրոշներ, բայց կան նաև ոչ շարժիչ տեսակներ: E.coli- ն այսպես կոչված ֆակուլտատիվ անաէրոբ քիմիորգանոտրոֆ օրգանիզմներ են, ինչը նշանակում է, որ նրանք ընդունակ են ինչպես շնչառական, այնպես էլ ֆերմենտատիվ նյութափոխանակության: E.coli տեսակների մեծամասնությունը բարորակ է և օգտակար գործառույթներ է կատարում մարմնում, օրինակ ՝ ճնշելով վնասակար մանրէների տեսակների աճը, սինթեզող վիտամիններ և այլն:
Այսպես կոչված B տիպի Escherichia coli բակտերիաների բջիջը E.coli շտամների հատուկ կատեգորիա է, որոնք լայնորեն օգտագործվում են հետազոտություններում `մանրեոֆագի զգայունության կամ սահմանափակման-փոփոխման համակարգերի մեխանիզմների ուսումնասիրության համար: Ավելին, E.coli բակտերիաները գնահատվում են որպես կենսատեխնոլոգիայի և կենսագիտության լաբորատորիաներում սպիտակուցների արտահայտման հուսալի աշխատանքային ձի: Օրինակ, E.coli- ն օգտագործվում է արդյունաբերական մասշտաբով միացություններ, ինչպիսիք են սպիտակուցները և օլիգոսախարիդները սինթեզելու համար: Հատուկ առանձնահատկությունների պատճառով, ինչպիսիք են պրոտեազի անբավարարությունը, ացետատի ցածր արտադրությունը գլյուկոզի բարձր մակարդակում և ուժեղ թափանցելիությունը, E. coli B բջիջները նա առավել հաճախ օգտագործվող ընդունող բջիջներն են գենետիկորեն մշակված սպիտակուցների արտադրության համար:
Recombinant Protein
Վերամշակվող սպիտակուցները (rProt) զգալի նշանակություն են ստանում բազմազան ճյուղերում, այդ թվում ՝ քիմիական արտադրության, դեղագործական, կոսմետիկ, մարդու և կենդանիների բժշկության, գյուղատնտեսության, սննդի, ինչպես նաև թափոնների մաքրման արդյունաբերության մեջ:
Recombinant սպիտակուցի արտադրությունը պահանջում է արտահայտման համակարգի օգտագործում: Որպես արտահայտող բջջային համակարգեր `վերամշակված ԴՆԹ-ի արտադրության համար, կարող են օգտագործվել ինչպես պրոկարիոտ, այնպես էլ էուկարիոտ բջիջներ: Մինչ բակտերիալ բջիջներն առավել լայնորեն օգտագործվում են սպիտակուցների արտահայտման համար `ելնելով այնպիսի գործոններից, ինչպիսիք են ցածր գինը, հեշտ ընդլայնումը և պարզ միջավայրը, կաթնասունների, խմորիչների, ջրիմուռների, միջատների և բջիջներից զերծ համակարգերը ստեղծվում են որպես այլընտրանքներ: Սպիտակուցի տեսակը, ֆունկցիոնալ ակտիվությունը, ինչպես նաև արտահայտված սպիտակուցի պահանջվող բերքը ազդում են սպիտակուցների արտահայտման համար օգտագործվող բջջային համակարգի ընտրության վրա:
Վերամշակված սպիտակուցը արտահայտելու համար անհրաժեշտ է, որ որոշակի բջիջ փոխներարկվի վերամշակվող ԴՆԹ-ի ձևանմուշ պարունակող ԴՆԹ վեկտորի հետ: Կաղապարով փոխափոխված բջիջները հետո մշակվում են: Բջջային մեխանիզմի արդյունքում բջիջները արտագրում և թարգմանում են հետաքրքրության սպիտակուցը ՝ դրանով իսկ արտադրելով նպատակային սպիտակուց:
Քանի որ արտահայտված սպիտակուցները փակվում են բջջային մատրիցում, բջիջները պետք է լիզացվեն (խանգարեն և կոտրվեն) ՝ սպիտակուցներն ազատելու համար: Մաքրման հետագա փուլում սպիտակուցը տարանջատվում և մաքրվում է:
Բուժման մեջ օգտագործված առաջին ռեկոմբինանտ սպիտակուցը վերամշակված մարդկային ինսուլինն էր 1982 թ.-ին: Այսօր ամբողջ աշխարհում արտադրվում է ավելի քան 170 տեսակի ռեկոմբինանտ սպիտակուց `բժշկական բուժման համար: Բժշկության մեջ սովորաբար օգտագործվող վերամշակվող սպիտակուցներն են, օրինակ, վերամիացվող հորմոնները, ինտերֆերոնները, ինտերլեյկինները, աճի գործոնները, ուռուցքի նեկրոզային գործոնները, արյան մակարդման գործոնները, թրոմբոլիտիկ դեղամիջոցները և ֆերմենտները ՝ հիմնական հիվանդությունների բուժման համար, ինչպիսիք են շաքարախտը, գաճաճությունը, սրտամկանի ինֆարկտը, սրտի գերբնակվածությունը, ուղեղային ապոպլեքսիա, բազմակի սկլերոզ, նեյտրոֆենիա, թրոմբոցիտոպենիա, անեմիա, հեպատիտ, ռևմատոիդ արթրիտ, ասթմա, Քրոնի հիվանդություն և քաղցկեղի բուժում: (տես ՝ Phuc V. Pham, Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
Բարձր կատարողական ուլտրաձայնային: Hielscher- ի արտադրանքի տեսականին ընդգրկում է կոմպակտ լաբորատոր ուլտրաձայնային համակարգիչից մինչև նստարանային ստորաբաժանումների ամբողջ արդյունաբերական ուլտրաձայնային համակարգերը: