BL21 բջիջների լիզիսը ուլտրաձայնային մշակմամբ

BL21 բջիջները E. coli շտամ են, որը լայնորեն օգտագործվում է հետազոտական լաբորատորիաներում, կենսատեխնոլոգիայում և արդյունաբերական արտադրությունում՝ սպիտակուցները բարձր արդյունավետությամբ էքսպրեսիայի ենթարկելու ունակության շնորհիվ։ Բջիջների ուլտրաձայնային քայքայումը, լիզիսը և սպիտակուցների անջատումը տարածված մեթոդ են՝ BL21 բջիջների ներբջջային տարածությունից թիրախային սպիտակուցները մեկուսացնելու և հավաքելու համար։ Ուլտրաձայնային մշակումն ամբողջությամբ քայքայում է բջիջը և ազատում ներսում պարփակված բոլոր սպիտակուցները՝ հասանելի դարձնելով սպիտակուցի 100%-ը։

BL21 բջիջները՝ սպիտակուցների էքսպրեսիայի համար

BL21 բջիջը E. coli բակտերիայի քիմիապես կոմպետենտ շտամ է, որը հարմար է տրանսֆորմացիայի և սպիտակուցների բարձր մակարդակի էքսպրեսիայի համար՝ T7 ՌՆԹ պոլիմերազի և IPTG-ի վրա հիմնված ինդուկցիոն համակարգի կիրառմամբ։ BL21 բջիջները հնարավորություն են տալիս բարձր արդյունավետությամբ իրականացնել T7 պրոմոտորի հսկողության տակ գտնվող ցանկացած գենի սպիտակուցային էքսպրեսիան։ E. coli բակտերիայի BL21(DE3) շտամը T7 ՌՆԹ պոլիմերազի վրա հիմնված սպիտակուց արտադրող շտամ է՝ զուգակցված T7 պրոմոտորի վրա հիմնված էքսպրեսիոն վեկտորների հետ, և լայնորեն կիրառվում է լաբորատորիաներում ու արդյունաբերությունում՝ ռեկոմբինանտ սպիտակուցներ արտադրելու համար։ BL21(DE3) շտամում ռեկոմբինանտ սպիտակուցը կոդավորող գենի էքսպրեսիան տրանսկրիպցիայի է ենթարկվում քրոմոսոմում կոդավորված T7 ՌՆԹ պոլիմերազի (T7 RNAP) միջոցով, որը տրանսկրիպցիան իրականացնում է ութ անգամ ավելի արագ, քան E. coli բակտերիայի սովորական RNAP ֆերմենտը։ Սա BL21(DE3) շտամը դարձնում է բարձր արդյունավետ և սպիտակուցների էքսպրեսիայի առավել նախընտրելի բջջային համակարգերից մեկը։

BL21 բջիջների ուլտրաձայնային լիզիսի և սպիտակուցների անջատման արձանագրություն

BL21 բջիջների լիզիսը հիմնականում իրականացվում է ուլտրաձայնային մշակմամբ՝ համակցված նատրիումի լաուրոիլ սարկոզինատի (հայտնի է նաև որպես սարկոզիլ) հետ, որն օգտագործվում է որպես լիզիսի բուֆեր։ Բջիջների ուլտրաձայնային քայքայման և սպիտակուցների անջատման առավելություններն են հուսալիությունը, վերարտադրելիությունը, ինչպես նաև ուլտրաձայնային սարքերի պարզ, անվտանգ և արագ աշխատանքը։ Ստորև ներկայացված արձանագրությունը տալիս է BL21 բջիջների ուլտրաձայնային լիզիսի քայլ առ քայլ ցուցումներ․

• Շապերոնային սպիտակուցները հեռացնելու նպատակով BL21 բակտերիաների նստվածքները կրկին սուսպենզացվել են 50 ml սառցասառը նատրիումի Tris-EDTA (STE) բուֆերում (բաղկացած է 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl բաղադրիչներից՝ հավելված 100 mM PMSF)։
• Այնուհետև ավելացվում է 500 ul լիզոցիմ (10 mg/ ml), և բջիջները ինկուբացվում են սառույցի վրա՝ 15 min։
• Դրանից հետո ավելացվում են 500 ul DTT և 7 ml սարկոզիլ (10% (w/v)՝ պատրաստված STE բուֆերում)։
• Անհրաժեշտ է մաքրման բոլոր բուֆերները պահել սառցասառը վիճակում, իսկ նմուշները՝ մշտապես սառույցի վրա։ Հնարավորության դեպքում մաքրման բոլոր քայլերը պետք է իրականացվեն սառը սենյակում։



• Ուլտրաձայնային լիզիսի և սպիտակուցների անջատման համար նմուշները մշակվում են ուլտրաձայնով՝ օգտագործելով VialTweeter MultiSample Ultrasonicator սարքը՝ 4 x 30 sec տևողությամբ, 100% ամպլիտուդով և յուրաքանչյուր ուլտրաձայնային մշակման միջև 2 min ընդմիջումով։ Որպես այլընտրանք՝ կարելի է օգտագործել միկրոծայրակալով զոնդային տիպի ուլտրաձայնային հոմոգենիզատոր, օրինակ՝ UP200Ht սարքը՝ S26d2 ծայրակալով (3 x 30 sec, ուլտրաձայնային ցիկլերի միջև 2 min. դադար, 80% ամպլիտուդ)։
• Մաքրման հետագա քայլերի համար նմուշները պետք է պահել սառույցի վրա կամ, որպես այլընտրանք, պահպանել -80°C ջերմաստիճանում՝ մինչև հետագա մշակումը։

Ուլտրաձայնային լիզիս՝ ջերմաստիճանի ճշգրիտ վերահսկմամբ

Կենսաբանական նմուշների հետ աշխատելիս ջերմաստիճանի ճշգրիտ և հուսալի վերահսկումը վճռորոշ նշանակություն ունի։ Բարձր ջերմաստիճանները նմուշներում առաջացնում են ջերմային ազդեցությամբ պայմանավորված սպիտակուցների քայքայում։
Ինչպես նմուշների պատրաստման բոլոր մեխանիկական մեթոդները, ուլտրաձայնային մշակումը նույնպես ջերմություն է առաջացնում։ Սակայն VialTweeter սարքի կիրառման դեպքում նմուշների ջերմաստիճանը կարելի է լավ վերահսկել։ Ներկայացնում ենք նմուշների ջերմաստիճանին հետևելու և այն վերահսկելու տարբեր հնարավորություններ՝ VialTweeter և VialPress սարքերով դրանք վերլուծության համար պատրաստելիս։

1. Նմուշի ջերմաստիճանի վերահսկում. VialTweeter սարքը գործարկող UP200St ուլտրաձայնային պրոցեսորը հագեցած է խելացի ծրագրային ապահովմամբ և միացվող ջերմաստիճանի տվիչով։ Ջերմաստիճանի տվիչը միացրեք UP200St սարքին և տվիչի ծայրը մտցրեք նմուշների փորձանոթներից մեկի մեջ։ Թվային գունավոր սենսորային էկրանի միջոցով UP200St սարքի ընտրացանկում կարող եք սահմանել ձեր նմուշի ուլտրաձայնային մշակման ջերմաստիճանի որոշակի միջակայք։ Ուլտրաձայնային սարքն ինքնաբերաբար կդադարեցնի աշխատանքը առավելագույն ջերմաստիճանին հասնելիս և կմնա դադարի վիճակում, մինչև նմուշի ջերմաստիճանն իջնի սահմանված ջերմաստիճանի ∆ ստորին արժեքին։ Այնուհետև ուլտրաձայնային մշակումն ինքնաբերաբար կվերսկսվի։ Այս խելացի գործառույթը կանխում է ջերմությամբ պայմանավորված քայքայումը։
2. VialTweeter բլոկը կարելի է նախապես սառեցնել։ VialTweeter բլոկը (միայն սոնոտրոդը՝ առանց փոխակերպիչի՛) տեղադրեք սառնարանում կամ սառցախցիկում՝ տիտանե բլոկը նախապես սառեցնելու համար, ինչը կօգնի հետաձգել նմուշի ջերմաստիճանի բարձրացումը։ Հնարավորության դեպքում կարելի է նախապես սառեցնել նաև նմուշը։
3. Ուլտրաձայնային մշակման ընթացքում սառեցնելու համար օգտագործեք չոր սառույց։ Օգտագործեք չոր սառույցով լցված ծանծաղ սկուտեղ և VialTweeter սարքը տեղադրեք սառույցի վրա, որպեսզի ջերմությունը կարողանա արագ ցրվել։

Ամբողջ աշխարհում հաճախորդներն օգտագործում են VialTweeter և VialPress սարքերը կենսաբանական, կենսաքիմիական, բժշկական և կլինիկական լաբորատորիաներում նմուշների ամենօրյա նախապատրաստման աշխատանքների համար։ UP200St պրոցեսորի խելացի ծրագրային ապահովման և ջերմաստիճանի կառավարման շնորհիվ ջերմաստիճանը հուսալիորեն վերահսկվում է, և կանխվում է նմուշների՝ ջերմությամբ պայմանավորված քայքայումը։ VialTweeter և VialPress սարքերով նմուշների ուլտրաձայնային նախապատրաստումն ապահովում է խիստ հուսալի և վերարտադրելի արդյունքներ։
 

Գտեք ձեր լիզիսի կիրառության համար օպտիմալ ուլտրաձայնային քայքայիչը

Hielscher Ultrasonics ընկերությունը լաբորատորիաների, սեղանադիր և արդյունաբերական մասշտաբի համակարգերի համար բարձր արդյունավետությամբ ուլտրաձայնային բջջային քայքայիչների և հոմոգենիզատորների արտադրության երկարամյա փորձ ունի։ Ձեր բակտերիալ բջջային կուլտուրայի չափը, հետազոտության կամ արտադրության նպատակը և մեկ ժամում կամ օրում մշակվելիք բջիջների ծավալը էական գործոններ են՝ ձեր կիրառության համար համապատասխան ուլտրաձայնային բջջային քայքայիչ գտնելու համար։
Hielscher Ultrasonics ընկերությունն առաջարկում է տարբեր լուծումներ բազմաթիվ նմուշների (VialTweeter սարքով՝ մինչև 10 սրվակ) և մեծաքանակ նմուշների (այսինքն՝ միկրոտիտրային թիթեղների / ELISA թիթեղների՝ UIP400MTP սարքով) միաժամանակյա ուլտրաձայնային մշակման համար, ինչպես նաև դասական զոնդային լաբորատոր ուլտրաձայնային սարքեր՝ 50-ից մինչև 400 վատտ հզորության տարբեր մակարդակներով, և ամբողջովին արդյունաբերական ուլտրաձայնային պրոցեսորներ՝ յուրաքանչյուր սարքի համար մինչև 16 000 վատտ հզորությամբ, որոնք նախատեսված են խոշոր արտադրությունում առևտրային նպատակներով բջիջների քայքայման և սպիտակուցների արդյունահանման համար։ Hielscher ապրանքանիշի բոլոր ուլտրաձայնային սարքերը նախատեսված են լրիվ բեռնվածությամբ 24/7/365 աշխատանքի համար։ Ամրությունն ու հուսալիությունը մեր ուլտրաձայնային սարքերի հիմնական հատկանիշներն են։
Բոլոր թվային ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորները հագեցած են խելացի ծրագրային ապահովմամբ, գունավոր սենսորային էկրանով և տվյալների ավտոմատ գրանցման գործառույթով, որոնք ուլտրաձայնային սարքը դարձնում են հարմար աշխատանքային գործիք լաբորատոր և արտադրական հաստատություններում։
Տեղեկացրեք մեզ, թե ինչ տեսակի բջիջներ, ինչ ծավալով, ինչ հաճախականությամբ և ինչ նպատակով պետք է մշակեք ձեր կենսաբանական նմուշներում։ Մենք սիրով ձեզ կառաջարկենք ձեր գործընթացի պահանջներին առավել համապատասխան ուլտրաձայնային բջջային քայքայիչը։

Ստորև բերված աղյուսակը պատկերացում է տալիս մեր ուլտրաձայնային համակարգերի մոտավոր մշակման կարողության մասին՝ սկսած կոմպակտ ձեռքի հոմոգենիզատորներից և բազմաթիվ նմուշների ուլտրաձայնային սարքերից մինչև առևտրային կիրառությունների համար նախատեսված արդյունաբերական ուլտրաձայնային պրոցեսորներ։

Գրականություն / Հղումներ

• Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
• LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
• Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
• Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.