Բջջային Լիզիս BL21 բջիջների ուլտրաձայնային եղանակով
BL21 բջիջները E. coli-ի շտամ են, որոնք լայնորեն օգտագործվում են հետազոտական լաբորատորիաներում, կենսատեխնոլոգիաներում և արդյունաբերական արտադրության մեջ՝ շնորհիվ իրենց բարձր արդյունավետությամբ սպիտակուցներ արտահայտելու ունակության: Ուլտրաձայնային բջիջների խափանումը, լիզը և սպիտակուցի արդյունահանումը տարածված մեթոդ է BL21 բջիջների բջջային ներսից թիրախային սպիտակուցները մեկուսացնելու և հավաքելու համար: Ուլտրաձայնային ախտորոշումը ամբողջությամբ խաթարում է բջիջը և ազատում բոլոր թակարդված սպիտակուցները՝ հասանելի դարձնելով սպիտակուցի 100%-ը:
BL21 բջիջներ սպիտակուցի արտահայտման համար
BL21 բջիջը քիմիապես իրավասու E. coli բակտերիաների շտամ է, որը հարմար է փոխակերպման և սպիտակուցի բարձր մակարդակի արտահայտման համար՝ օգտագործելով T7 RNA պոլիմերազ-IPTG ինդուկցիոն համակարգը: BL21 բջիջները թույլ են տալիս բարձր արդյունավետությամբ սպիտակուցի արտահայտում ցանկացած գենի, որը գտնվում է T7 պրոմոտորի հսկողության տակ: E. coli շտամը BL21(DE3) T7 ՌՆԹ պոլիմերազի վրա հիմնված սպիտակուցի արտադրության շտամ է, որը զուգորդվում է T7 խթանիչի վրա հիմնված արտահայտման վեկտորների հետ և լայնորեն կիրառվում է լաբորատորիաներում և արդյունաբերության մեջ՝ ռեկոմբինանտ սպիտակուցներ արտադրելու համար: BL21(DE3)-ում ռեկոմբինանտ սպիտակուցը կոդավորող գենի էքսպրեսիան տառադարձվում է քրոմոսոմային կոդավորված T7 ՌՆԹ պոլիմերազով (T7 RNAP), որը տրանսկրիպվում է ութ անգամ ավելի արագ, քան սովորական E. coli RNAP-ն: Սա BL21(DE3) շտամը դարձնում է բարձր արդյունավետ և այն դարձնում է ամենանախընտրելի սպիտակուցային արտահայտման բջջային համակարգերից մեկը:
Արձանագրություն ուլտրաձայնային լիզիսի և BL21 բջիջներից սպիտակուցի արդյունահանման համար
BL21 բջիջների բջիջների լիզը հիմնականում իրականացվում է ուլտրաձայնային եղանակով՝ նատրիումի լաուրոյլ սարկոզինատի (նաև հայտնի է որպես սարկոզիլ) հետ համատեղ՝ որպես լիզի բուֆեր: Ուլտրաձայնային բջիջների խանգարման և սպիտակուցի արդյունահանման առավելությունները կայանում են ուլտրաձայնային սարքերի հուսալիության, վերարտադրելիության, ինչպես նաև ուլտրաձայնային սարքերի պարզ, անվտանգ և արագ աշխատանքի մեջ: Ստորև բերված արձանագրությունը տալիս է քայլ առ քայլ ուղղություն ուլտրաձայնային BL21 բջիջների լիզման համար.
- Շապերոնային սպիտակուցները հեռացնելու համար BL21 բակտերիալ գնդիկները կրկին կասեցվել են 50 մլ սառցե նատրիումի Tris-EDTA (STE) բուֆերի մեջ (բաղկացած է 10 մՄ Tris-HCL, pH 8,0, 1 մՄ EDTA, 150 մՄ NaCl՝ լրացված 100 մՄ-ով: PMSF):
- Ավելացվում է 500 մլ լիզոցիմ (10 մգ/մլ), և բջիջները 15 րոպե ինկուբացվում են սառույցի վրա:
- Այնուհետև ավելացվում է 500 մլ DTT և 7 մլ սարկոզիլ (10% (w/v) պատրաստված STE բուֆերում):
- Կարևոր է մաքրման բոլոր բուֆերները սառը վիճակում պահել և նմուշները մշտապես պահել սառույցի վրա: Հնարավորության դեպքում մաքրման բոլոր քայլերը պետք է իրականացվեն սառը սենյակում:
- Ուլտրաձայնային լուծույթի և սպիտակուցի արդյունահանման համար նմուշները հնչյունավորվում են VialTweeter MultiSample Ultrasonicator 4 x 30 վայրկյան 100% ամպլիտուդով, յուրաքանչյուր հնչյունավորման միջև 2 րոպե ընդմիջումով: Որպես այլընտրանք, զոնդի տիպի ուլտրաձայնային հոմոգենիզատոր՝ միկրո ծայրով, օրինակ. UP200Ht S26d2-ով (3 x 30 վրկ, 2 րոպե դադար ուլտրաձայնային ցիկլերի միջև, 80% ամպլիտուդ) կարող է օգտագործվել:
- Մաքրման հետագա քայլերի համար նմուշները պետք է պահվեն սառույցի վրա կամ որպես այլընտրանք պահվեն -80°C ջերմաստիճանում մինչև հետագա մշակումը:
Ուլտրաձայնային բջիջների խանգարիչ UP200St S26d2 միկրո ծայրով լիզի և սպիտակուցի արդյունահանման համար
Ուլտրաձայնային լիզիս ճշգրիտ ջերմաստիճանի հսկողության ներքո
Ջերմաստիճանի ճշգրիտ և հուսալի հսկողությունը կարևոր է կենսաբանական նմուշների հետ աշխատելիս: Բարձր ջերմաստիճանները նմուշներում սկսում են ջերմային ազդեցությամբ առաջացած սպիտակուցի քայքայումը:
Ինչպես բոլոր մեխանիկական նմուշների պատրաստման մեթոդները, այնպես էլ sononication-ը ջերմություն է ստեղծում: Այնուամենայնիվ, նմուշների ջերմաստիճանը կարելի է լավ վերահսկել VialTweeter-ն օգտագործելիս: Մենք ձեզ ենք ներկայացնում տարբեր տարբերակներ՝ վերահսկելու և վերահսկելու ձեր նմուշների ջերմաստիճանը, մինչդեռ դրանք պատրաստում եք VialTweeter-ի և VialPress-ի միջոցով վերլուծության համար:
- Նմուշի ջերմաստիճանի մոնիտորինգ. UP200St ուլտրաձայնային պրոցեսորը, որը վարում է VialTweeter-ը, հագեցած է խելացի ծրագրաշարով և խցանվող ջերմաստիճանի սենսորով: Միացրեք ջերմաստիճանի ցուցիչը UP200St-ի մեջ և տեղադրեք ջերմաստիճանի սենսորի ծայրը նմուշի խողովակներից մեկում: Թվային գունավոր սենսորային էկրանի միջոցով դուք կարող եք UP200St-ի ընտրացանկում սահմանել հատուկ ջերմաստիճանի միջակայք ձեր նմուշի ձայնային ախտահանման համար: Ուլտրաձայնային սարքը ավտոմատ կերպով կդադարի, երբ առավելագույն ջերմաստիճանը հասնի և կդադարի մինչև նմուշի ջերմաստիճանը իջնի սահմանված ջերմաստիճանի Δ-ի ցածր արժեքին: Այնուհետև նորից ինքնաբերաբար կսկսվի ձայնագրումը: Այս խելացի հատկությունը կանխում է ջերմային դեգրադացիան:
- VialTweeter բլոկը կարող է նախապես սառեցվել: Տեղադրեք VialTweeter բլոկը (միայն sonotrode-ն առանց փոխարկիչի!) սառնարանի կամ սառնարանի մեջ, որպեսզի նախապես հովացվի տիտանի բլոկը, որն օգնում է հետաձգել ջերմաստիճանի բարձրացումը նմուշում: Հնարավորության դեպքում, նմուշն ինքնին կարող է նաև նախապես սառեցնել:
- Օգտագործեք չոր սառույցը սառչելու համար՝ ձայնային ախտահանման ժամանակ: Օգտագործեք չոր սառույցով լցված մակերեսային սկուտեղ և տեղադրեք VialTweeter-ը սառույցի վրա, որպեսզի ջերմությունը արագորեն ցրվի:
Ամբողջ աշխարհում հաճախորդներն օգտագործում են VialTweeter-ը և VialPress-ը կենսաբանական, կենսաքիմիական, բժշկական և կլինիկական լաբորատորիաներում նմուշների պատրաստման իրենց ամենօրյա աշխատանքի համար: UP200St պրոցեսորի խելացի ծրագրակազմը և ջերմաստիճանի հսկողությունը, ջերմաստիճանը հուսալիորեն վերահսկվում է և խուսափում է ջերմությունից առաջացած նմուշի դեգրադացիան: Ուլտրաձայնային նմուշի պատրաստումը VialTweeter-ի և VialPress-ի միջոցով ապահովում է բարձր հուսալի և վերարտադրելի արդյունքներ:
Գտեք օպտիմալ ուլտրաձայնային խանգարիչը ձեր Lysis հավելվածի համար
Hielscher Ultrasonics-ը լաբորատորիաների, նստարանների և արդյունաբերական մասշտաբների համակարգերի համար բարձր արդյունավետության ուլտրաձայնային բջիջների խանգարողների և համասեռացուցիչների երկարամյա փորձառու արտադրող է: Ձեր բակտերիալ բջիջների կուլտուրայի չափը, ձեր հետազոտության կամ արտադրության նպատակը և մեկ ժամում կամ օրում մշակվող բջիջների ծավալը էական գործոններ են ձեր կիրառման համար ուլտրաձայնային բջիջների ճիշտ խանգարող գտնելու համար:
Hielscher Ultrasonics-ը առաջարկում է տարբեր լուծումներ բազմակի նմուշների (մինչև 10 սրվակ VialTweeter-ի հետ) և զանգվածային նմուշների (այսինքն՝ միկրոտիտրային թիթեղներ / ELISA ափսեներ UIP400MTP-ով), ինչպես նաև դասական զոնդային տիպի լաբորատոր ուլտրաձայնային սարքի միաժամանակյա արտահոսքի համար։ հզորության մակարդակները 50-ից մինչև 400 վտ մինչև լիովին արդյունաբերական ուլտրաձայնային պրոցեսորներ մինչև 16000 վտ մեկ միավորի համար առևտրային բջիջների խափանումների և սպիտակուցների արդյունահանման համար մեծ արտադրության մեջ: Hielscher-ի բոլոր ուլտրաձայնային սարքերը կառուցված են 24/7/365 աշխատանքի համար՝ լրիվ բեռի տակ: Ամուրությունն ու հուսալիությունը մեր ուլտրաձայնային սարքերի հիմնական հատկանիշներն են:
Բոլոր թվային ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորները հագեցած են խելացի ծրագրաշարով, գունավոր հպման էկրանով և տվյալների ավտոմատ արձանագրումով, որոնք ուլտրաձայնային սարքը դարձնում են հարմար աշխատանքային գործիք լաբորատորիայում և արտադրական օբյեկտներում:
Տեղեկացրեք մեզ, թե ինչպիսի բջիջներ, ինչ ծավալով, ինչ հաճախականությամբ և ինչ թիրախով պետք է մշակեք ձեր կենսաբանական նմուշները։ Մենք ձեզ խորհուրդ կտանք ուլտրաձայնային բջիջների ամենահարմար խանգարիչը ձեր գործընթացի պահանջներին համապատասխան:
Ստորև բերված աղյուսակը ցույց է տալիս մեր ուլտրաձայնային համակարգերի մոտավոր մշակման հզորությունը՝ կոմպակտ ձեռքի հոմոգենիզատորներից և MultiSample Ultrasonicators-ից մինչև արդյունաբերական ուլտրաձայնային պրոցեսորներ առևտրային կիրառությունների համար.
| Խմբաքանակի ծավալը | Հոսքի արագություն | Առաջարկվող սարքեր |
|---|---|---|
| 96 ջրհոր / միկրոտիտրային թիթեղներ | ԱԺ | UIP400MTP |
| 10 սրվակ 0,5-ից 1,5 մլ | ԱԺ | VialTweeter-ը UP200 St |
| 0.01-ից 250մլ | 5-ից 100 մլ/րոպե | UP50H |
| 0.01-ից 500մլ | 10-ից 200 մլ / րոպե | UP100H |
| 10-ից 2000 մլ | 20-ից 400 մլ / րոպե | UP200Ht, UP400 Փ |
| 0.1-ից 20լ | 0.2-ից 4լ/րոպե | UIP2000hdT |
| 10-ից 100 լ | 2-ից 10 լ / րոպե | UIP4000hdT |
| ԱԺ | 10-ից 100 լ / րոպե | UIP16000 |
| ԱԺ | ավելի մեծ | կլաստերի UIP16000 |
Կապ մեզ հետ: / Հարցրեք մեզ:
UIP400MTP ափսե sonicator 96 հորատանցքի թիթեղներում բարձր թողունակության բջիջների խանգարման համար
ուլտրաձայնային սարք UP200Ht 2 մմ S26d2 միկրոծածկով փոքր նմուշների ձայնագրման համար
Կարդացեք ավելին այն մասին, թե ինչպես կարող եք օգտագործել ձեր ուլտրաձայնային հյուսվածքների հոմոգենիզատորը բուֆերային լուծույթների արդյունավետ և հուսալի պատրաստման համար:
Փաստեր, որոնք արժե իմանալ
Escherichia coli բակտերիաներ
Escherichia coli-ն բակտերիաների տեսակ է, որը սպոր չառաջացնող, գրամ-բացասական է և բնութագրվում է ուղիղ ձողի տեսքով: E.coli բակտերիաները առկա են մարդկանց և կենդանիների շրջակա միջավայրում, սննդամթերքներում և աղիքներում: E. coli-ն սովորաբար շարժուն է` օգտագործելով պերիտրիկ դրոշակները, սակայն կան նաև ոչ շարժուն տեսակներ: E.coli-ն այսպես կոչված ֆակուլտատիվ անաէրոբ քիմոօրգանոտրոֆ օրգանիզմներ են, ինչը նշանակում է, որ նրանք ունակ են և՛ շնչառական, և՛ ֆերմենտային նյութափոխանակության: E.coli տեսակների մեծ մասը բարենպաստ են և կատարում են օգտակար գործառույթներ մարմնում, օրինակ՝ ճնշելով վնասակար բակտերիաների տեսակների աճը, սինթեզելով վիտամիններ և այլն:
Escherichia coli բակտերիաների, այսպես կոչված, B տիպի բջիջները E.coli շտամների հատուկ կատեգորիա են, որոնք լայնորեն օգտագործվում են հետազոտության մեջ՝ հետազոտելու այնպիսի մեխանիզմներ, ինչպիսիք են բակտերիոֆագի զգայունությունը կամ սահմանափակման-մոդիֆիկացիոն համակարգերը: Ավելին, E.coli բակտերիաները գնահատվում են որպես կենսատեխնոլոգիայի և կենսագիտության լաբորատորիաներում սպիտակուցների արտահայտման հուսալի գործոն: Օրինակ, E.coli-ն օգտագործվում է արդյունաբերական մասշտաբով այնպիսի միացություններ սինթեզելու համար, ինչպիսիք են սպիտակուցները և օլիգոսաքարիդները: Շնորհիվ հատուկ առանձնահատկությունների, ինչպիսիք են պրոթեզերոնի անբավարարությունը, ցածր ացետատի արտադրությունը գլյուկոզայի բարձր մակարդակում և ուժեղացված թափանցելիություն, E. coli B բջիջները հանդիսանում են ամենահաճախ օգտագործվող հյուրընկալող բջիջները գենետիկորեն մշակված սպիտակուցների արտադրության համար:
Ռեկոմբինանտ սպիտակուց
Ռեկոմբինանտ սպիտակուցները (rProt) զգալի նշանակություն են ձեռք բերում բազմազան ճյուղերում, այդ թվում՝ քիմիական արտադրության, դեղագործության, կոսմետիկայի, մարդու և կենդանիների բժշկության, գյուղատնտեսության, սննդի, ինչպես նաև թափոնների մշակման արդյունաբերության մեջ:
Ռեկոմբինանտ սպիտակուցի արտադրությունը պահանջում է արտահայտման համակարգի օգտագործում: Որպես ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ի արտադրության համար արտահայտող բջջային համակարգեր, կարող են օգտագործվել ինչպես պրոկարիոտ, այնպես էլ էուկարիոտ բջիջներ: Մինչ բակտերիաների բջիջները առավել լայնորեն օգտագործվում են սպիտակուցների արտահայտման համար՝ պայմանավորված այնպիսի գործոններով, ինչպիսիք են ցածր արժեքը, հեշտ մասշտաբայնությունը և միջավայրի պարզ պայմանները, կաթնասունների, խմորիչի, ջրիմուռների, միջատների և բջիջներից զերծ համակարգերը հաստատված այլընտրանքներ են: Սպիտակուցի տեսակը, ֆունկցիոնալ ակտիվությունը, ինչպես նաև արտահայտված սպիտակուցի պահանջվող ելքը ազդում են սպիտակուցի արտահայտման համար օգտագործվող բջջային համակարգի ընտրության վրա:
Ռեկոմբինանտ սպիտակուցը արտահայտելու համար որոշակի բջիջ պետք է փոխակերպվի ԴՆԹ վեկտորով, որը պարունակում է ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ի ձևանմուշ: Այնուհետև կաղապարով փոխակերպված բջիջները մշակվում են: Բջջային մեխանիզմի արդյունքում բջիջները տառադարձում և թարգմանում են հետաքրքրող սպիտակուցը՝ դրանով իսկ արտադրելով թիրախային սպիտակուցը:
Քանի որ արտահայտված սպիտակուցները թակարդված են բջջային մատրիցով, բջիջը պետք է լիզվի (խաթարվի և կոտրվի) սպիտակուցներն ազատելու համար: Հետագա մաքրման փուլում սպիտակուցը առանձնացվում և մաքրվում է:
Բուժման մեջ օգտագործված առաջին ռեկոմբինանտ սպիտակուցը 1982 թվականին ռեկոմբինանտ մարդկային ինսուլինն էր: Այսօր աշխարհում բժշկական բուժման համար արտադրվում է ավելի քան 170 տեսակի ռեկոմբինանտ սպիտակուց: Բժշկության մեջ օգտագործվող ռեկոմբինանտ սպիտակուցներն են, օրինակ՝ ռեկոմբինանտ հորմոնները, ինտերֆերոնները, ինտերլեյկինները, աճի գործոնները, ուռուցքային նեկրոզի գործոնները, արյան մակարդման գործոնները, թրոմբոլիտիկ դեղամիջոցները և ֆերմենտները, ինչպիսիք են շաքարախտը, գաճաճությունը, սրտամկանի ինֆարկտը, սրտի անբավարարությունը: ուղեղային ապոպլեքսիա, բազմակի սկլերոզ, նեյտրոպենիա, թրոմբոցիտոպենիա, անեմիա, հեպատիտ, ռևմատոիդ արթրիտ, ասթմա, Կրոնի հիվանդություն և քաղցկեղի բուժում: (տես Phuc V. Pham, Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
Գրականություն / Հղումներ
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
VialTweeter sonicator 10 նմուշների միաժամանակյա ձայնագրման համար, օրինակ՝ BL21 բջիջները խաթարելու համար
Բարձր արդյունավետությամբ ուլտրաձայնային սարքավորումներ: Hielscher-ի արտադրանքի տեսականին ընդգրկում է ամբողջ սպեկտրը՝ սկսած կոմպակտ լաբորատոր ուլտրաձայնային սարքից մինչև նստարանային սարքերի վրա տեղադրված լիարժեք արդյունաբերական ուլտրաձայնային համակարգեր: