Պլազմիդների պատրաստում ուլտրաձայնային մշակմամբ
Ուլտրաձայնային մշակումը պլազմիդային ԴՆԹ-ի ֆրագմենտավորման հուսալի մեթոդ է։ Ճշգրիտ կարգավորվող ամպլիտուդը, իմպուլսային ռեժիմը և ջերմաստիճանի վերահսկումը պլազմիդների՝ առանց վնասման ֆրագմենտավորման համար նախատեսված ուլտրաձայնային սարքի ամենակարևոր հատկանիշներն են։ Բացի այդ, որոշ նյութերի օգտագործումն օգնում է պաշտպանել պլազմիդները քայքայումից։ Hielscher Ultrasonics ընկերությունն առաջարկում է պլազմիդների վերահսկվող ֆրագմենտավորման տարբեր լուծումներ՝ առանձին սրվակներից մինչև բազմաթիվ նմուշների, ինչպես նաև բազմահոր թիթեղների միաժամանակյա ուլտրաձայնային մշակում։ Իմացե՛ք ավելին պլազմիդների հաջող ուլտրաձայնային ֆրագմենտավորման մասին։
UIP400MTP հնարավորություն է տալիս իրականացնել բազմահոր թիթեղների ճշգրիտ վերահսկվող ուլտրաձայնային մշակում։ UIP400MTP սարքի կիրառություններից մեկը պլազմիդային ԴՆԹ-ի ֆրագմենտավորումն է՝ նպատակադրված որոշակի երկարությամբ ֆրագմենտներ ստանալու համար։
Պլազմիդների կտրատում ուլտրաձայնային մշակմամբ
Երբ ԴՆԹ-ի նմուշները ենթարկվում են ուլտրաձայնային ալիքների ազդեցությանը, ուլտրաձայնով առաջացած տատանումները հեղուկում ստեղծում են ակուստիկ կավիտացիա, որը մեխանիկական ուժերի միջոցով կտրատում կամ կոտրում է ԴՆԹ-ի բարձր մոլեկուլային զանգված ունեցող մոլեկուլները։ Ուլտրաձայնային մշակումը մեծ քանակությամբ ԴՆԹ-ի կտրատման փորձերում ամենալայն կիրառվող մեթոդն է, այդ թվում՝ քրոմատինի իմունապրეცիպիտացիայի (ChIP) նման կիրառություններում, որոնց դեպքում ֆրագմենտների փոքր չափերը բացարձակապես վճռորոշ են բարձր լուծաչափ ստանալու համար։ (Տե՛ս Tseng et al., 2012)
Պլազմիդային ԴՆԹ-ն (pDNA) ԴՆԹ-ի հատուկ ձև է, որը բնութագրվում է օղակաձև կառուցվածքով և հանդիպում է բակտերիաներում ու որոշ էուկարիոտներում։
Գերպարուրված pDNA-ն պլազմիդային ԴՆԹ-ի ցանկալի ձևն է, քանի որ այն լավագույն արդյունքներն է տալիս հետագա գործընթացներում, ինչպիսիք են ավտոմատացված սեքվենավորումը և տրանսֆեկցիան։ Ուլտրաձայնային մշակումը հարմար է pDNA-ի, այդ թվում՝ գերպարուրված pDNA-ի հաջող ֆրագմենտավորման համար։
Thompson et al. (2008) ցույց են տվել, որ պլազմիդների ուլտրաձայնային մշակումը, որը, ինչպես հայտնի է, ֆրագմենտավորում է գերպարուրված ԴՆԹ-ն, հաջորդականության phred20 ընթերցումների երկարությունները բարելավելու արդյունավետ միջոց է՝ հասցնելով այն մակարդակին, որ դրանք էականորեն չեն տարբերվում Beckman Coulter ընկերության ստուգիչ մատրիցից կամ ֆերմենտային եղանակով գծայնացված պլազմիդներից ստացված ընթերցումների երկարություններից։
- Ճշգրիտ վերահսկելիություն
- Վերարտադրելի արդյունքներ
- Կարգավորման հնարավորություն՝ ԴՆԹ-ի ֆրագմենտների նպատակային երկարություններին համապատասխան
- Ջերմաստիճանի վերահսկում
- Մասշտաբի մեծացման հնարավորություն՝ ցանկացած չափի նմուշների համար
Պլազմիդային վեկտորների օգտագործում
Պլազմիդները հաճախ օգտագործվում են որպես գեների կլոնավորման, տեղափոխման և փոփոխման գործիքներ։ Երբ պլազմիդները փորձարարական նպատակներով օգտագործվում են այս գործառույթների համար, դրանք կոչվում են վեկտորներ։ ԴՆԹ-ի ֆրագմենտները կամ գեները կարող են ներդրվել պլազմիդային վեկտորի մեջ՝ ստեղծելով այսպես կոչված ռեկոմբինանտ պլազմիդ։ Պլազմիդային վեկտորներն օգտագործվում են որպես ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ն տեր բջիջ ներմուծելու փոխադրիչներ և մոլեկուլային կլոնավորման առանցքային բաղադրիչ են։
«Ոչ վիրուսային վեկտորները լայնորեն ուսումնասիրվում են՝ տարբեր բարդ հիվանդությունների բուժման նպատակով գենային թերապիայում դրանց հնարավոր կիրառության համար։ Ոչ վիրուսային վեկտորները պլազմիդային ԴՆԹ-ն պաշտպանում են ֆիզիկական, քիմիական և ֆերմենտային քայքայումից և ԴՆԹ-ի մոլեկուլը հասցնում են թիրախային տեղամաս։ Օրինակ՝ կատիոնային լիպոսոմները, խիտոզանը և այլ դրական լիցքավորված նանոմասնիկները էլեկտրաստատիկ փոխազդեցությունների միջոցով համալիրներ են առաջացնում պլազմիդային ԴՆԹ-ի հետ։ Սակայն հեշտությամբ առաջացող կատիոնային լիպոսոմներ/պլազմիդային ԴՆԹ համալիրները համեմատաբար մեծ են (այսինքն՝ 300–400 nm) և իրենց բնույթով տարասեռ, ինչը դժվարացնում է դրանց օգտագործումը դեղագործական կիրառություններում։ Ուլտրաձայնային մշակմամբ պլազմիդային ԴՆԹ/լիպոսոմներ, պլազմիդային ԴՆԹ/աերոզոլներ և պլազմիդային ԴՆԹ/պեպտիդներ մեծ ու տարասեռ համալիրները կարող են փոքրացվել՝ վերածվելով ավելի փոքր և համասեռ մասնիկների»։ (Sarker et al., 2019)
Պլազմիդային վեկտորների օգտագործման ակնառու օրինակ է CRISPR–Cas9 համակարգը։ CRISPR–Cas9 համակարգը սովորաբար բջիջներ է ներմուծվում մեկ մեծ պլազմիդի կամ մի քանի ավելի փոքր պլազմիդների ձևով, որոնք կոդավորում են թիրախային հաջորդականություն, CRISPR ուղղորդիչ և Cas9։
ԴՆԹ պարունակող PLGA նանոմասնիկների ուլտրաձայնային պատրաստում նանոնստեցմամբ
Jo et al. (2020) հետազոտության հեղինակներն օգտագործել են պոլի(կաթնաթթու-կո-գլիկոլաթթու) (PLGA)՝ նանոմասնիկային կրիչ ձևավորելու համար՝ մոդելային CRISPR–Cas9 պլազմիդը ոսկրածուծից ստացված առաջնային մակրոֆագների մեջ ներմուծելու նպատակով։ PLGA նանոմասնիկների նանոնստեցման համար օգտագործվել է երկու տարբեր ծայրային խմբերով (էսթերային և ամինային խմբեր) PLGA՝ նպատակ ունենալով, որ դրական լիցքավորված ամինային ծայրային խմբերը բարձրացնեն պատիճավորման արդյունավետությունն ու բեռնվածությունը՝ դրանց և ԴՆԹ-ի բացասական լիցքավորված հիմնական շղթայի միջև լիցքային փոխազդեցությունների շնորհիվ։ 50 mL ծավալով պոլիպրոպիլենային կոնաձև ցենտրիֆուգային փորձանոթում 100 mg Pluronic F127 լուծվել է 20 mL ավտոկլավացված դեիոնացված ջրում՝ հորձանուտային խառնմամբ, որին հաջորդել է 30 min մեղմ ուլտրաձայնային մշակում՝ ուլտրաձայնային բաղնիքի միջոցով (տե՛ս CupHorn)։ Ավելացվել է ավտոկլավացված մագնիսական խառնիչ ձողիկ, և լուծույթը խառնվել է 600 RPM արագությամբ 30 min ընթացքում, մինչ պատրաստվել են մյուս լուծույթները։ Ամբողջ ընթացքում ապակյա լաբորատոր պարագաների փոխարեն օգտագործվել են պլաստիկ պարագաներ՝ ԴՆԹ-ի ոչ սպեցիֆիկ ադսորբցիան նվազագույնի հասցնելու համար։ Առանձին պատրաստվել են DMF լուծիչում լուծված PLGA պարունակող լուծույթը (44,48 mg/ ml) և THF լուծիչում լուծված TIPS պենտացեն պարունակող լուծույթը (0,667 mg/ml)։ PLGA նյութը 30 min հանգիստ թողնվել է DMF լուծիչում՝ թրջվելու համար, այնուհետև ենթարկվել է ուլտրաձայնային մշակման 30 min ընթացքում։ (Ամբողջական ընթացակարգի համար տե՛ս Jo et al., 2020)
- ԴՆԹ-ի արդյունահանում
- ԴՆԹ-ի պատիճավորում
- Նանոմասնիկներով պատված ԴՆԹ-ի դիսպերսում
- Պլազմիդային ԴՆԹ-ի ներմուծում բջիջների մեջ
UP200St CupHorn սարքը՝ նմուշների անուղղակի ուլտրաձայնային մշակման համար, օրինակ՝ ԴՆԹ-ի արդյունահանման և ֆրագմենտացման նպատակով։
Պլազմիդային ԴՆԹ-ի պաշտպանությունն ուլտրաձայնային մշակման ընթացքում
ԴՆԹ-ն, ներառյալ պլազմիդներն ու գերպարուրված պլազմիդները, խիստ զգայուն է քայքայման նկատմամբ։ Ֆրագմենտացման բոլոր առկա մեթոդներն ունեն որոշակի հայտնի թերություններ։ ԴՆԹ-ի ուլտրաձայնային ֆրագմենտացումը նախընտրելի մեթոդներից մեկն է, քանի որ վերահսկվող ուլտրաձայնային մշակումը՝ պաշտպանիչ միջոցների հետ համատեղ, թույլ է տալիս նվազեցնել սահքով և ջերմությամբ պայմանավորված՝ ԴՆԹ-ի շղթաների վնասումը։
ԴՆԹ-ի ուլտրաձայնային սահքային մասնատման ընթացքում ցածր ամպլիտուդի կարգավորումներից, իմպուլսային ռեժիմից և ջերմաստիճանի վերահսկումից բացի, որոշ նյութերի օգտագործումը նշանակալի պաշտպանիչ ազդեցություն է ցույց տվել ԴՆԹ-ի քայքայման դեմ։ Օրինակ՝ տարբեր պոլիմերներ, պեպտիդներ և լիպիդներ պաշտպանում են պլազմիդային ԴՆԹ-ն ուլտրաձայնային մշակման ընթացքում։
Պլազմիդային ԴՆԹ-ի և պլազմիդային ԴՆԹ/IL նանոհամալիրների կայունությունն ուլտրաձայնային սահքի լարման նկատմամբ հետազոտվել է ագարոզային գելում էլեկտրոֆորեզի մեթոդով։ Ե՛վ պլազմիդային ԴՆԹ-ն, և՛ պլազմիդային ԴՆԹ/IL նանոհամալիրները ենթարկվել են ուլտրաձայնային սահքի լարման՝ տարբեր տևողություններով։ Պլազմիդային ԴՆԹ-ն ենթարկվել է ուլտրաձայնային սահքի լարման 0, 10, 20, 30 և 40 րոպե տևողությամբ։ Սակայն պլազմիդային ԴՆԹ/IL նանոհամալիրները ենթարկվել են ուլտրաձայնային սահքի լարման 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 և 120 րոպե տևողությամբ։
(հետազոտությունը և պատկերը՝ ©Sarker et al., 2019)
Sarker et al. (2019) հետազոտության հեղինակները ցույց են տվել, որ երբ պլազմիդային ԴՆԹ / իոնային հեղուկ (pDNA/IL) նանոկառուցվածքները ենթարկվել են ուլտրաձայնային սահքի լարման 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 և 120 min տևողությամբ և համալիրներ են կազմել առևտրային հասանելի՝ գեների ներմուծման կատիոնային լիպոֆեկտամին նյութի հետ, ֆլուորեսցենտային դրական բջիջների տոկոսը կազմել է համապատասխանաբար 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% և 50% (տե՛ս ստորև բերված գծապատկերը)։ Ֆլուորեսցենտային դրական բջիջների տոկոսն աճել է, երբ նանոկառուցվածքները ենթարկվել են ուլտրաձայնային սահքի լարման 10 և 20 min տևողությամբ, իսկ դրանից հետո դանդաղ նվազել է։
Իոնային հեղուկի ( [Bmim][PF6] ) ազդեցությունը COS7 բջիջների մեջ պլազմիդային ԴՆԹ-ի ներմուծման վրա։ Պլազմիդային ԴՆԹ/IL (իոնային հեղուկ) նանոհամալիրները ենթարկվել են ուլտրաձայնային սահքի լարման մինչև 120 րոպե տևողությամբ և համալիրներ են կազմել LA նյութի հետ՝ նախքան COS7 բջիջների մեջ ներմուծվելը։ Տվյալները ցույց են տալիս 10 տարբեր մանրադիտակային տեսադաշտերում հաշվված՝ GFP-դրական HeLa բջիջների միջին թիվը (%)․ փորձը կատարվել է բազմիցս՝ երեք տարբեր օրերի ընթացքում։ (Հետազոտությունը և գծապատկերը՝ ©Sarker et al., 2019)
Պլազմիդային ԴՆԹ-ն կարելի է պաշտպանել՝ ուլտրաձայնային ֆրագմենտացումից առաջ նյութ ավելացնելով. ուլտրաձայնային մշակմամբ հարուցված քայքայում՝ մերկ pDNA (A) և 1,5 mM CaCl2 ու 20 % (v/v) t-butanol պարունակող բաղադրության մեջ ներառված pDNA (B)
Նմուշները մշակվել են ուլտրաձայնով՝ 20W զոնդով մինչև 120s տևողությամբ, ինչպես նշված է յուրաքանչյուր ուղու վերևում։ H ուղին համապատասխանում է Hyperladder I ™️ մարկերին։ Նշված են OC և SC պլազմիդային շերտերը։
(հետազոտությունը և նկարները՝ ©Wu et al., 2009)
Լիզատի ուլտրաձայնային պատրաստում
Բջիջների ուլտրաձայնային լիզիսի արձանագրություն
Սկսեք բջիջների հարստացված նմուշից, որը պատրաստվել է բջիջների բաժանման մեթոդով (օրինակ՝ բջիջների իմունամագնիսական բաժանում, ֆլուորեսցենցիայով ակտիվացվող բջիջների տեսակավորում (FACS), խտության գրադիենտով ցենտրիֆուգում, բջիջների իմունախտային մեկուսացում)։
Բջջային նմուշները պետք է պարունակեն լիզիսի բուֆերի այնպիսի ծավալ, որը համապատասխանում է փորձի նպատակին և զոնդային ուլտրաձայնային սարքին։
Նախընտրելի են հիպոտոնիկ բուֆերները, քանի որ դրանք ուժեղացնում են բջիջների ուլտրաձայնային լիզիսը։ Կարևոր է պատշաճ կերպով կիրառել հավելումները և ընտրել աղի կոնցենտրացիան։
Ընտրեք ուլտրաձայնային լիզիսի ձեր սարքը. սրվակների անուղղակի ուլտրաձայնային մշակման համար խորհուրդ են տրվում VialTweeter կամ CupHorn սարքերը։ Բազմահորիկ թիթեղների համար UIP400MTP սարքն իդեալական ուլտրաձայնային սարք է։ Իսկ դասական զոնդային ուլտրաձայնային մշակման համար առավել հարմար է միկրոծայրով ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորը, օրինակ՝ UP100H կամ UP200Ht։
Զոնդային ուլտրաձայնային մշակման արձանագրություն. Ուլտրաձայնային սարքի զոնդը տեղադրեք միկրոցենտրիֆուգային փորձանոթում գտնվող նմուշի ծավալի մեջ և մշակեք ուլտրաձայնով մոտ 10 վայրկյան։ Կախված ԴՆԹ-ի նմուշից՝ ուլտրաձայնային մշակումը կարող է կրկնվել ևս մեկ կամ երկու անգամ։ Անհրաժեշտ ուլտրաձայնային էներգիայի ներմուծումը (Ws/mL) կախված է նմուշի մածուցիկությունից և ԴՆԹ-ի տեսակից։ Սառցային բաղնիքով սառեցումը և ուլտրաձայնային սարքի իմպուլսային ռեժիմն օգնում են կանխել նմուշի ջերմային քայքայումը։
Ուլտրաձայնային լիզիսից հետո նմուշը ցենտրիֆուգվում է՝ նստվածքային մնացորդներն առանձնացնելու համար (որոնք պարունակում են լիզիսի չենթարկված բջիջներ, կորիզներ և լիզիսի չենթարկված օրգանելներ)։
Եթե նմուշն անմիջապես չի ենթարկվում հետագա մշակման, այն կարելի է, կարելի է պահել համապատասխան ջերմաստիճանում՝ դրա կենսունակությունը պահպանելու համար։
Ուլտրաձայնային սարքեր ԴՆԹ-ի ֆրագմենտացման համար
Hielscher Ultrasonics ընկերությունն առաջարկում է ուլտրաձայնի վրա հիմնված տարբեր հարթակներ՝ ԴՆԹ-ի, ՌՆԹ-ի և քրոմատինի ֆրագմենտացման համար։ Այս տարբեր հարթակները ներառում են ուլտրաձայնային զոնդեր (սոնոտրոդներ), բազմաթիվ փորձանոթներում կամ բազմահորիկ թիթեղներում նմուշների միաժամանակյա պատրաստման համար անուղղակի ուլտրաձայնային մշակման լուծումներ (օրինակ՝ 96 հորիկով թիթեղներ, միկրոտիտրային թիթեղներ), սոնոռեակտորներ և ուլտրաձայնային cuphorns սարքեր։ ԴՆԹ-ի սահքային մասնատման բոլոր հարթակներն աշխատում են հաճախականությամբ կարգաբերված, բարձր արդյունավետությամբ ուլտրաձայնային պրոցեսորներով, որոնք ճշգրիտ կառավարելի են և ապահովում են վերարտադրելի արդյունքներ։
Ուլտրաձայնային պրոցեսորներ ցանկացած քանակի և չափի նմուշների համար
Hielscher ընկերության՝ բազմաթիվ նմուշների համար նախատեսված VialTweeter (մինչև 10 փորձանոթի համար) և UIP400MTP (միկրոթիթեղների/բազմահորիկ թիթեղների համար) ուլտրաձայնային սարքերով հեշտությամբ հնարավոր է կրճատել նմուշների մշակման ժամանակը՝ ինտենսիվ և ճշգրիտ կառավարելի ուլտրաձայնային մշակման շնորհիվ՝ միաժամանակ ստանալով ԴՆԹ-ի ֆրագմենտների չափերի ցանկալի բաշխումն ու ելքը։ ԴՆԹ-ի ուլտրաձայնային ֆրագմենտացումը պլազմիդների պատրաստման փուլերը դարձնում է արդյունավետ, հուսալի և մասշտաբը մեծացնելու համար հարմար։ Ուլտրաձայնի հաստատուն պարամետրեր կիրառելով՝ արձանագրությունների մասշտաբը կարելի է գծային կերպով մեծացնել՝ մեկ նմուշից անցնելով բազմաթիվ նմուշների։
Մեկից հինգ մատ ունեցող զոնդային ուլտրաձայնային սարքերն իդեալական են ավելի փոքր քանակի նմուշների պատրաստման համար։ Hielscher ընկերության լաբորատոր ուլտրաձայնային սարքերը հասանելի են հզորության տարբեր մակարդակներով, որպեսզի կարողանաք ընտրել իդեալական ուլտրաձայնային քայքայիչ սարքը ԴՆԹ-ի հետ կապված ձեր կիրառության համար։
Նմուշների բազմակի պատրաստման VialTweeter ուլտրաձայնային սարքը հնարավորություն է տալիս միաժամանակ ուլտրաձայնով մշակել մինչև 10 սրվակ։ VialPress սեղմակային սարքի միջոցով մինչև 4 լրացուցիչ փորձանոթ կարելի է սեղմել առջևի հատվածին՝ ինտենսիվ ուլտրաձայնային մշակման համար։
Գործընթացի ճշգրիտ կառավարում
Ուլտրաձայնային մշակման ճշգրիտ կարգավորվող պարամետրերը վճռորոշ նշանակություն ունեն, քանի որ չափազանց ինտենսիվ ուլտրաձայնային մշակումը կարող է քայքայել ԴՆԹ-ն, ՌՆԹ-ն և քրոմատինը, իսկ անբավարար ուլտրաձայնային սահքային ազդեցության հետևանքով առաջանում են ԴՆԹ-ի և քրոմատինի չափազանց երկար բեկորներ։ Hielscher ընկերության թվային ուլտրաձայնային սարքերում հեշտությամբ կարելի է սահմանել ուլտրաձայնային մշակման ճշգրիտ պարամետրեր։ Ուլտրաձայնային մշակման որոշակի կարգավորումները կարելի է նաև պահպանել որպես ծրագրավորված կարգավորում՝ նույն ընթացակարգն արագ կրկնելու համար։
Ուլտրաձայնային մշակման բոլոր գործողություններն ինքնաբերաբար արձանագրվում և պահպանվում են ներկառուցված SD քարտի վրա՝ CSV ֆայլի ձևաչափով։ Սա թույլ է տալիս ճշգրիտ փաստագրել կատարված փորձերը և հեշտությամբ վերանայել ուլտրաձայնային մշակման գործողությունների գրառումները։
Բրաուզերով հեռակառավարման միջոցով բոլոր թվային ուլտրաձայնային սարքերը կարելի է կառավարել և վերահսկել ցանկացած ստանդարտ բրաուզերից։ Լրացուցիչ ծրագրային ապահովման տեղադրում չի պահանջվում, քանի որ LAN կապի կարգավորումը շատ պարզ է՝ միացրեք և օգտագործեք։
Օգտագործման առավելագույն հարմարավետություն ԴՆԹ-ի ուլտրաձայնային պատրաստման ընթացքում
Hielscher ընկերության բոլոր ուլտրաձայնային սարքերը նախագծված են բարձր արդյունավետությամբ ուլտրաձայն ապահովելու համար՝ միաժամանակ միշտ լինելով օգտագործողի համար շատ հարմար և հեշտ կառավարվող։ Բոլոր կարգավորումները հստակ կառուցվածքով դասավորված են պարզ ընտրացանկում, որը հեշտությամբ հասանելի է գունավոր սենսորային էկրանի կամ բրաուզերով հեռակառավարման միջոցով։ Ծրագրավորվող կարգավորումներով և տվյալների ինքնաբերական գրանցմամբ խելացի ծրագրային ապահովումը երաշխավորում է ուլտրաձայնային մշակման օպտիմալ կարգավորումներ՝ հուսալի և վերարտադրելի արդյունքներ ստանալու համար։ Ընտրացանկի պարզ և հեշտ օգտագործվող միջերեսը Hielscher ընկերության ուլտրաձայնային սարքերը դարձնում է օգտագործողի համար հարմար և արդյունավետ։
Ստորև բերված աղյուսակը պատկերացում է տալիս բջիջների լիզիսի և ԴՆԹ-ի բեկորացման համար մեր լաբորատոր ուլտրաձայնային սարքերի մոտավոր մշակման հզորության մասին։
| Մեկ խմբաքանակի ծավալը | Հոսքի ծավալային արագությունը | Առաջարկվող սարքեր |
|---|---|---|
| բազմահոր թիթեղներ | կիրառելի չէ | UIP400MTP |
| սրվակներ, փոքր քիմիական բաժակ | կիրառելի չէ | Ուլտրաձայնային CupHorn |
| մինչև 10 սրվակ | կիրառելի չէ | VialTweeter |
| 1-ից մինչև 500mL | 10-ից մինչև 200mL/min | UP100H |
| 10-ից մինչև 2000mL | 20-ից մինչև 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
Կապվե՛ք մեզ հետ։ / Հարցրե՛ք մեզ։
Գրականություն / Հղումներ
- Mark D. Thompson, Kelly G. Aukema, Dana M. O’Bryan, Stephen D. Rader, Brent W. Murray (2008): Plasmid sonication improves sequencing efficiency and quality in the Beckman Coulter CEQ system. BioTechniques 2008, 45:3, 327-329
- Fykse, Else; Olsen, Jaran; Skogan, Gunnar (2003): Application of sonication to release DNA from Bacillus cereus for quantitative detection by real-time PCR. Journal of microbiological methods 55, 2003. 1-10.
- Ming L. Wu; Sindélia S. Freitas; Gabriel A. Monteiro; Duarte M. F. Prazeres; José A. L. Santos (2009). Stabilization of naked and condensed plasmid DNA against degradation induced by ultrasounds and high-shear vortices. Biotechnology Applied Biochemistry 53(4), 2009.
- Sarker, Satya Ranjan; Ball, Andrew S.; Bhargava, Suresh Kumar; Soni., Sarvesh K. (2019): Evaluation of plasmid DNA stability against ultrasonic shear stress and its in vitro delivery efficiency using ionic liquid [Bmim][PF6]. RSC Advances 9, 2019. 29225-29231.
- Miguel Larguinho, Hugo M. Santos, Gonçalo Doria, H. Scholz, Pedro V. Baptista, José L. Capelo (2010): Development of a fast and efficient ultrasonic-based strategy for DNA fragmentation. Talanta, Volume 81, Issue 3, 2010. 881-886.
- Julie Ann Wyber; Julie Andrews; Antony D’Emanuele (1997): The Use of Sonication for the Efficient Delivery of Plasmid DNA into Cells. Pharmaceutical Research 14(6), 1997. 750–756.
Փաստեր, որոնք արժե իմանալ
Ի՞նչ են պլազմիդները։
Պլազմիդը ԴՆԹ-ի փոքր օղակաձև մոլեկուլ է, որը ֆիզիկապես առանձնացված է քրոմոսոմային ԴՆԹ-ից և ինքնուրույն է կրկնապատկվում։ Պլազմիդները հաճախ կապված են գեների հետ, որոնք նպաստում են օրգանիզմի գոյատևմանը և տալիս են որոշակի առավելություններ, օրինակ՝ հակաբիոտիկների նկատմամբ կայունություն։ Պլազմիդներն առավել հաճախ հանդիպում են բակտերիաներում՝ որպես ԴՆԹ-ի փոքր օղակաձև, երկշղթա մոլեկուլներ, սակայն երբեմն առկա են նաև արքեաներում և էուկարիոտ օրգանիզմներում։ Պլազմիդները կարևոր գործիքներ են մոլեկուլային կենսաբանության, գենետիկայի, կենսաքիմիայի և կյանքի մասին գիտությունների ոլորտներում։ Գենային ճարտարագիտության մեջ հայտնի լինելով որպես վեկտորներ՝ պլազմիդներն օգտագործվում են որոշակի գեների կրկնապատկման կամ էքսպրեսիայի համար։ Վեկտորի նպատակային փոփոխությունը կոչվում է վեկտորի նախագծում։
GFP վերլուծությունը բջջային հետազոտություններում
Կանաչ ֆլուորեսցենտ սպիտակուցը (GFP) բազմակիրառելի կենսաբանական մարկեր է՝ ֆիզիոլոգիական գործընթացների մշտադիտարկման, սպիտակուցի տեղակայման տեսապատկերման և կենդանի օրգանիզմում տրանսգենային էքսպրեսիայի հայտնաբերման համար։ GFP սպիտակուցը կարելի է գրգռել լազերի 488 nm սպեկտրային գծով, իսկ դրա օպտիմալ հայտնաբերումը կատարվում է 510 nm ալիքի երկարության դեպքում։
Hielscher Ultrasonics ընկերությունն արտադրում է բարձր արդյունավետությամբ ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորներ՝ սկսած լաբորատոր չափերից մինչև արդյունաբերական չափեր։