Բիոինժեներական եղանակով ստացված բջիջների ուլտրաձայնային լիզիսը արդյունաբերական արտադրությունում

Բիոինժեներական եղանակով ստացված բակտերիաների տեսակները, օրինակ՝ E. coli, ինչպես նաև կաթնասունների և բույսերի գենետիկորեն ձևափոխված բջջատեսակները լայնորեն օգտագործվում են կենսատեխնոլոգիայում՝ մոլեկուլների էքսպրեսիայի համար։ Սինթեզված այս կենսամոլեկուլներն ազատելու համար անհրաժեշտ է բջիջների քայքայման հուսալի տեխնոլոգիա։ Բարձր արդյունավետությամբ ուլտրաձայնային մշակումը բջիջների արդյունավետ և հուսալի լիզիսի ապացուցված մեթոդ է, որը հեշտությամբ կարելի է մասշտաբավորել դեպի մշակման ավելի բարձր արտադրողականություն։ Hielscher Ultrasonics ընկերությունն առաջարկում է բարձր արդյունավետությամբ ուլտրաձայնային սարքավորումներ՝ բջիջների արդյունավետ լիզիսի միջոցով մեծ ծավալներով բարձրորակ կենսամոլեկուլներ արտադրելու համար։

Մոլեկուլների էքստրակցիան բջջային գործարաններից

Կենսամոլեկուլների լայն տեսականի արտադրելու համար տարբեր ինժեներական եղանակներով ձևափոխված միկրոօրգանիզմներ և բուսական բջիջներ կարող են օգտագործվել որպես մանրէային բջջային գործարաններ, այդ թվում՝ Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana, ջրիմուռներ և բազմաթիվ այլ օրգանիզմներ։ Այս բջջային գործարանները կարող են արտադրել սպիտակուցներ, լիպիդներ, կենսաքիմիական նյութեր, պոլիմերներ, կենսավառելիքներ և յուղաքիմիական նյութեր, որոնք օգտագործվում են որպես սնունդ կամ արդյունաբերական կիրառությունների հումք։ Որպես բջջային գործարաններ օգտագործվող բջիջները կուլտիվացվում են փակ կենսառեակտորներում, որտեղ դրանք կարող են ապահովել բարձր արդյունավետություն, յուրահատկություն և էներգիայի ցածր պահանջարկ։
Բիոինժեներական եղանակով ստացված բջջային կուլտուրաներից թիրախային մոլեկուլներն առանձնացնելու համար բջիջները պետք է քայքայվեն, որպեսզի ներբջջային նյութն ազատվի։ Բջիջների ուլտրաձայնային քայքայիչների կիրառումը լավ հաստատված, խիստ հուսալի և արդյունավետ տեխնոլոգիա է՝ բջիջների քայքայման և միացությունների ազատման համար։

Մանրէային բջջային գործարանները նյութափոխանակային ինժեներիայի միջոցով ձևափոխված բջիջներ են, որոնք օգտագործվում են տարբեր արժեքավոր միացությունների սինթեզի համար։ Բջիջների ուլտրաձայնային քայքայումը բջջի ներսից արժեքավոր միացություններն ազատելու արդյունավետ և հուսալի մեթոդ է։
հետազոտություն և գծապատկեր՝ ©Villaverde, 2010.

Բջիջների ուլտրաձայնային քայքայիչների առավելությունները

Որպես ոչ ջերմային, մեղմ, սակայն բարձր արդյունավետությամբ տեխնոլոգիա՝ ուլտրաձայնային քայքայիչներն օգտագործվում են լաբորատորիայում և արդյունաբերությունում՝ բջիջների լիզիսի և բարձրորակ էքստրակտների ստացման համար, օրինակ՝ բջջային գործարաններից մոլեկուլներ առանձնացնելու նպատակով։

Բարձր հզորության ուլտրաձայն՝ մանրէային բջջային գործարանների արդյունավետ քայքայման համար

Բջիջների ուլտրաձայնային քայքայիչների մեխանիզմը և ազդեցությունները.
Բջիջների ուլտրաձայնային քայքայումն օգտագործում է ուլտրաձայնային ալիքների ուժը։ Ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորը / բջջաքայքայիչը հագեցած է տիտանի համաձուլվածքից պատրաստված զոնդով (որը նաև կոչվում է սոնոտրոդ), որը տատանվում է մոտավորապես 20 kHz բարձր հաճախականությամբ։ Սա նշանակում է, որ ուլտրաձայնային զոնդը վայրկյանում 20 000 տատանում է հաղորդում ուլտրաձայնով մշակվող հեղուկին։ Հեղուկին հաղորդվող ուլտրաձայնային ալիքները բնութագրվում են բարձր ճնշման / ցածր ճնշման հերթագայվող ցիկլերով։ Ցածր ճնշման ցիկլի ընթացքում հեղուկն ընդարձակվում է, և առաջանում են վակուումային մանր պղպջակներ։ Այս շատ փոքր պղպջակներն աճում են ճնշման մի քանի հերթագայվող ցիկլերի ընթացքում, մինչև այլևս չեն կարողանում լրացուցիչ էներգիա կլանել։ Այդ պահին կավիտացիոն պղպջակները կտրուկ ներպայթում են և տեղայնորեն ստեղծում էներգիայի արտակարգ բարձր խտությամբ միջավայր։ Այս երևույթը հայտնի է որպես ակուստիկ կավիտացիա և բնութագրվում է տեղային շատ բարձր ջերմաստիճաններով, շատ բարձր ճնշումներով և սահքի ուժերով։ Այս սահքային լարումներն արդյունավետորեն քայքայում են բջջապատերը և մեծացնում զանգվածափոխանակությունը բջջի ներսի և շրջապատող լուծիչի միջև։ Որպես զուտ մեխանիկական մեթոդ՝ ուլտրաձայնով առաջացվող սահքի ուժերը լայնորեն կիրառվում են և առաջարկվում բակտերիալ բջիջների քայքայման, ինչպես նաև սպիտակուցների անջատման համար։ Որպես բջիջների քայքայման պարզ և արագ մեթոդ՝ ուլտրաձայնային մշակումը իդեալական է փոքր, միջին և մեծ ծավալներից նյութերի անջատման համար։ Hielscher ընկերության թվային ուլտրաձայնային սարքերը հագեցած են կարգավորումների հստակ ընտրացանկով՝ ուլտրաձայնային մշակումը ճշգրիտ կառավարելու համար։ Ուլտրաձայնային մշակման բոլոր տվյալներն ավտոմատ կերպով պահվում են ներկառուցված SD քարտում և հեշտությամբ հասանելի են։ Ուլտրաձայնային քայքայման գործընթացի ընթացքում ջերմության հեռացման կատարելագործված տարբերակները, ինչպիսիք են արտաքին սառեցումը, իմպուլսային ռեժիմով ուլտրաձայնային մշակումը և այլն, ապահովում են գործընթացի իդեալական ջերմաստիճանի պահպանումը և դրանով իսկ՝ արդյունահանված ջերմազգայուն միացությունների անվնաս մնալը։

Հետազոտությունն ընդգծում է բջիջների ուլտրաձայնային քայքայման և արդյունահանման առավելությունները

Պրոֆեսոր Chemat-ը և համահեղինակները (2017) իրենց ուսումնասիրության մեջ ամփոփում են, որ «ուլտրաձայնի օժանդակությամբ արդյունահանումը սննդամթերքի և բնական արտադրանքի մշակման ավանդական մեթոդների՝ շրջակա միջավայրի համար բարենպաստ և տնտեսապես կենսունակ այլընտրանք է։ Հիմնական առավելություններն են արդյունահանման և մշակման տևողության, օգտագործվող էներգիայի և լուծիչների քանակի, միավորային գործողությունների և CO₂ արտանետումների նվազումը»։
Gabig-Ciminska-ն և համահեղինակները (2014) իրենց ուսումնասիրության մեջ օգտագործել են բարձր ճնշման հոմոգենիզատոր և ուլտրաձայնային բջջաքայքայիչ՝ սպորների լիզիսի միջոցով ԴՆԹ-ն ազատելու համար։ Համեմատելով բջիջների քայքայման երկու մեթոդները՝ հետազոտական խումբը սպորների ԴՆԹ-ի ստացման նպատակով բջիջների լիզիսի վերաբերյալ եզրակացնում է. «Վերլուծությունն իրականացվել է բարձր ճնշման հոմոգենացման արդյունքում ստացված բջջային լիզատների օգտագործմամբ։ Այնուհետև մենք հասկացանք, որ բջիջների ուլտրաձայնային քայքայումն այս նպատակի համար բացառիկ առավելություններ ունի։ Այն բավականին արագ է և կարող է իրականացվել փոքր ծավալով նմուշների համար»։ (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Բջջային գործարաններից ստացվող կենսամոլեկուլներ՝ սննդամթերքի արտադրության համար

Մանրէային բջջային գործարանները կենսունակ և արդյունավետ արտադրական մեթոդաբանություն են, որն օգտագործում է մանրէային օրգանիզմներ՝ բակտերիաների, խմորասնկերի, սնկերի և այլ մանրէային միկրոօրգանիզմների նյութափոխանակային կենսաճարտարագիտության միջոցով դրանց բնորոշ և ոչ բնորոշ մետաբոլիտների բարձր ելքեր ստանալու համար։ Մեծածավալ արտադրվող ֆերմենտները, օրինակ, ստացվում են այնպիսի միկրոօրգանիզմների օգտագործմամբ, ինչպիսիք են Aspergillus oryzae, սնկերը և բակտերիաները։ Այդ ֆերմենտներն օգտագործվում են սննդամթերքի և ըմպելիքների արտադրության մեջ, ինչպես նաև գյուղատնտեսության, կենսաէներգետիկայի և կենցաղային խնամքի ոլորտներում։
Որոշ բակտերիաներ, օրինակ՝ Acetobacter xylinum և Gluconacetobacter xylinus, խմորման գործընթացում արտադրում են ցելյուլոզ, ընդ որում՝ նանոմանրաթելերը սինթեզվում են «ներքևից վերև» գործընթացով։ Բակտերիալ ցելյուլոզը (հայտնի է նաև որպես մանրէային ցելյուլոզ) քիմիական առումով համարժեք է բուսական ցելյուլոզին, սակայն ունի բյուրեղայնության բարձր աստիճան և բարձր մաքրություն (չի պարունակում լիգնին, հեմիցելյուլոզ, պեկտին և այլ կենսածին բաղադրիչներ), ինչպես նաև ցելյուլոզի նանոմանրաթելերից հյուսված եռաչափ (3D) ցանցի յուրահատուկ կառուցվածք։ (cf. Zhong, 2020) Բուսական ծագման ցելյուլոզի համեմատ՝ բակտերիալ ցելյուլոզն ավելի կայուն է բնապահպանական առումով, իսկ արտադրված ցելյուլոզը մաքուր է և չի պահանջում մաքրման բարդ փուլեր։ Ուլտրաձայնային մշակումը և լուծիչային էքստրակցիան՝ NaOH կամ SDS (նատրիումի դոդեցիլսուլֆատ) օգտագործելով, շատ արդյունավետ են բակտերիալ բջիջներից բակտերիալ ցելյուլոզի անջատման համար։

Բջջային գործարաններից ստացվող կենսամոլեկուլներ՝ դեղագործական արտադրանքի և պատվաստանյութերի արտադրության համար

Բջջային գործարաններից ստացվող ամենանշանավոր դեղագործական արտադրանքներից մեկը մարդու ինսուլինն է։ Կենսաճարտարագիտական եղանակով ինսուլինի արտադրության համար հիմնականում օգտագործվում են E. coli և Saccharomyces cerevisiae։ Քանի որ կենսասինթեզված նանոչափային մոլեկուլներն ունեն բարձր կենսահամատեղելիություն, ֆերիտինի նման կենսաբանական նանոմասնիկները նպաստավոր են կենսաարտադրության բազմաթիվ կիրառությունների համար։ Բացի այդ, նյութափոխանակային ինժեներիայի միջոցով փոփոխված մանրէներում արտադրությունը հաճախ զգալիորեն ավելի արդյունավետ է ստացվող ելքերի առումով։ Օրինակ՝ արտեմիզինաթթվի, ռեսվերատրոլի և լիկոպենի արտադրությունն աճել է տասնապատիկից մինչև մի քանի հարյուրապատիկ, և արդյունաբերական մասշտաբով արտադրությունն արդեն հաստատված է կամ մշակման փուլում է։ (cf. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
Օրինակ՝ ինքնահավաքման հատկություններով սպիտակուցային հիմքով նանոչափային կենսամոլեկուլները, ինչպիսիք են ֆերիտինը և վիրուսանման մասնիկները, հատկապես հետաքրքիր են պատվաստանյութերի մշակման համար, քանի որ նմանակում են ախտածինների և՛ չափը, և՛ կառուցվածքը, իսկ դրանց մակերեսին հնարավոր է կոնյուգացնել հակածիններ՝ իմունային բջիջների հետ փոխազդեցությունը խթանելու համար։ Այդպիսի մոլեկուլներն էքսպրեսիայի են ենթարկվում այսպես կոչված բջջային գործարաններում (օրինակ՝ ինժեներական եղանակով փոփոխված E. coli շտամներում), որոնք արտադրում են որոշակի թիրախային մոլեկուլ։

Ֆերիտինի ազատման համար E. coli BL21 շտամի ուլտրաձայնային լիզիսի արձանագրություն

Ֆերիտինը սպիտակուց է, որի հիմնական գործառույթը երկաթի պահեստավորումն է։ Ֆերիտինը խոստումնալից հնարավորություններ է ցուցաբերում որպես ինքնահավաքվող նանոմասնիկներ պատվաստանյութերում, որտեղ այն օգտագործվում է որպես պատվաստանյութի առաքման միջոց (օրինակ՝ SARS-Cov-2 սպայկային սպիտակուցներ)։ Sun et. al. (2016) գիտական հետազոտությունը ցույց է տալիս, որ ռեկոմբինանտ ֆերիտինը կարող է լուծելի ձևով ազատվել Escherichia coli բջիջներից՝ NaCl ցածր կոնցենտրացիաների դեպքում (≤50 mmol/L)։ E. coli BL21 շտամում ֆերիտինն էքսպրեսիայի ենթարկելու և այն ազատելու համար հաջողությամբ կիրառվել է հետևյալ արձանագրությունը։ Ռեկոմբինանտ pET-28a/ferritin պլազմիդը տրանսֆորմացիայի միջոցով ներմուծվել է E coli BL21 (DE3) շտամի մեջ։ Ֆերիտին արտադրող E coli BL21 (DE3) բջիջները կուլտիվացվել են 0,5% կանամիցին պարունակող LB աճեցման միջավայրում՝ 37°C ջերմաստիճանում, և OD600 ցուցանիշի 0,6 արժեքի դեպքում ինդուկցիայի են ենթարկվել 0,4% իզոպրոպիլ-β-D-թիոգալակտոպիրանոզիդով՝ 3 ժամ տևողությամբ, 37°C ջերմաստիճանում։ Այնուհետև վերջնական կուլտուրան հավաքվել է ցենտրիֆուգմամբ՝ 8000g պայմաններում, 10 րոպե տևողությամբ, 4°C ջերմաստիճանում, և նստվածքը հավաքվել է։ Այնուհետև նստվածքը կրկին սուսպենդացվել է LB միջավայրում (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% խմորասնկային էքստրակտ)/լիզիսի բուֆերում (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) և NaCl լուծույթի տարբեր կոնցենտրացիաներում (0, 50, 100, 170 և 300 mmol/L), համապատասխանաբար։ Բակտերիալ բջիջների լիզիսի համար ուլտրաձայնային մշակումը կիրառվել է իմպուլսային ռեժիմով՝ օրինակ՝ օգտագործելով UP400St ուլտրաձայնային սարքը 100% ամպլիտուդով՝ 5 վայրկյան միացված, 10 վայրկյան անջատված աշխատանքային ցիկլով, 40 ցիկլի ընթացքում), այնուհետև ցենտրիֆուգվել է 10 000g պայմաններում՝ 15 րոպե, 4°C ջերմաստիճանում։ Վերնստվածքային հեղուկն ու նստվածքը վերլուծվել են նատրիումի դոդեցիլսուլֆատով պոլիակրիլամիդային գելային էլեկտրոֆորեզի (SDS-PAGE) միջոցով։ Նատրիումի դոդեցիլսուլֆատով ներկված բոլոր գելերը սկանավորվել են բարձր լուծաչափով սկաներով։ Գելերի պատկերները վերլուծվել են Magic Chemi 1D ծրագրաշարի միջոցով։ Օպտիմալ հստակության համար սպիտակուցային շերտերը հայտնաբերվել են պարամետրերի կարգավորմամբ։ Շերտերի տվյալները ստացվել են տեխնիկական եռակի կրկնություններից։ (հմմտ. Sun et al., 2016)

Բջջային գործարանների արդյունաբերական լիզիսի համար ուլտրաձայնային բջջաքայքայիչներ

Ուլտրաձայնային լիզիսն ու արդյունահանումը բջջային գործարաններից մետաբոլիտների ազատման հուսալի և հարմար մեթոդ են՝ դրանով նպաստելով թիրախային մոլեկուլների արդյունավետ արտադրությանը։ Ուլտրաձայնային բջջաքայքայիչները հասանելի են լաբորատորից մինչև արդյունաբերական չափերով, իսկ գործընթացները կարող են մասշտաբավորվել դեպի ավելի մեծ ծավալներ՝ ամբողջովին գծային կերպով։
Hielscher Ultrasonics ընկերությունը բարձր արդյունավետությամբ ուլտրաձայնային քայքայիչների հարցում ձեր փորձառու գործընկերն է և ունի սեղանադիր ու արդյունաբերական պայմաններում ուլտրաձայնային համակարգերի տեղադրման երկարամյա փորձ։
Առաջադեմ սարքաշարի և ծրագրաշարի առումով Hielscher Ultrasonics ընկերության բջիջների քայքայման համակարգերը բավարարում են գործընթացի օպտիմալ վերահսկման, հեշտ շահագործման և օգտագործման հարմարավետության բոլոր պահանջները։ Hielscher ուլտրաձայնային սարքերի հաճախորդներն ու օգտագործողները գնահատում են այն առավելությունը, որ Hielscher ուլտրաձայնային բջջաքայքայիչներն ու արդյունահանիչները հնարավորություն են տալիս ճշգրիտ մշտադիտարկել և կառավարել գործընթացը՝ թվային սենսորային էկրանի և զննարկիչով հեռակառավարման միջոցով։ Ուլտրաձայնային մշակման բոլոր կարևոր տվյալները (օրինակ՝ զուտ էներգիան, ընդհանուր էներգիան, ամպլիտուդը, տևողությունը, ջերմաստիճանը, ճնշումը) ինքնաբերաբար պահպանվում են որպես CSV ֆայլ՝ ներկառուցված SD քարտի վրա։ Սա օգնում է ստանալ վերարտադրելի և կրկնելի արդյունքներ ու հեշտացնում է գործընթացի ստանդարտացումը, ինչպես նաև Պատշաճ արտադրական գործելակերպի (cGMP) պահանջների կատարումը։
Իհարկե, Hielscher ուլտրաձայնային պրոցեսորները նախատեսված են լրիվ բեռնվածությամբ 24/7 աշխատանքի համար, ուստի կարող են հուսալիորեն շահագործվել արդյունաբերական արտադրության պայմաններում։ Բարձր դիմացկունության և տեխնիկական սպասարկման փոքր պահանջի շնորհիվ ուլտրաձայնային սարքավորումների պարապուրդն իսկապես փոքր է։ CIP (մաքրում տեղում) և SIP (մանրէազերծում տեղում) գործառույթները նվազագույնի են հասցնում աշխատատար մաքրումը, հատկապես քանի որ հեղուկի հետ շփվող բոլոր մասերն ունեն հարթ մետաղական մակերեսներ (առանց թաքնված անցքերի կամ վարդակների)։

Ստորև բերված աղյուսակը պատկերացում է տալիս մեր ուլտրաձայնային սարքերի մոտավոր մշակման արտադրողականության մասին․