Ինչպես կարող է ուլտրաձայնային մշակումը կտրուկ բարձրացնել լիզոցիմի արդյունավետությունը բակտերիալ բջիջների լիզիսի համար
, Kathrin Hielscher, հրապարակված է Hielscher-ի նորությունները բաժնում
Բակտերիալ բջիջների քայքայումը կարևոր քայլ է կենսատեխնոլոգիայում, դեղագործական հետազոտություններում և սպիտակուցների արտադրության մեջ։ Այս նպատակի համար ամենատարածված միջոցներից մեկը լիզոցիմն է՝ ֆերմենտ, որը թուլացնում է բակտերիալ բջջապատերը։ Սակայն, թեև լիզոցիմն արդյունավետ է, այն հաճախ ինքնուրույն բավարար արագ կամ հզոր ազդեցություն չի ցուցաբերում՝ հատկապես խիտ կուլտուրաների կամ սպիտակուցների գերարտահայտման համար գենետիկորեն փոփոխված բակտերիաների դեպքում։
Այստեղ օգնության է գալիս ուլտրաձայնային մշակումը։ Հետազոտողներն ավելի ու ավելի հաճախ են օգտվում ուլտրաձայնային մշակումից՝ լիզոցիմի վրա հիմնված բջջային լիզիսը կտրուկ բարելավելու համար։ Համատեղ կիրառման դեպքում լիզոցիմն ու ուլտրաձայնային մշակումը կազմում են բարձր արդյունավետությամբ, փոխլրացնող համակարգ, որն ապահովում է ավելի արագ, ավելի ամբողջական և ավելի վերարտադրելի արդյունքներ։
Ինչու միայն լիզոցիմը հաճախ բավարար չէ
Լիզոցիմը գործում է՝ քայքայելով պեպտիդոգլիկանը՝ բակտերիալ բջջապատերի հիմնական կառուցվածքային բաղադրիչներից մեկը։ Այս ֆերմենտային մոտեցումը մեղմ է և լայնորեն կիրառվում է, հատկապես E. coli բակտերիաների համար։ Սակայն իրական լաբորատոր պայմաններում միայն լիզոցիմով մշակումը կարող է սահմանափակ հնարավորություններ ունենալ։
Տարածված դժվարություններից են՝
- Բջիջների ոչ ամբողջական քայքայումը բարձր խտությամբ կամ ագրեգացված կուլտուրաներում
- Ինկուբացիայի երկար տևողությունը
- Նվազած արդյունավետությունը սպիտակուցներ գերարտահայտող կամ սթրեսին հարմարված բակտերիաների դեպքում
- Խմբաքանակից խմբաքանակ փոփոխականությունը
Այս սահմանափակումները կարող են բացասաբար ազդել հետագա գործընթացների վրա, ինչպիսիք են սպիտակուցների արդյունահանումը, պարզեցումը և մաքրումը՝ ի վերջո նվազեցնելով ելքն ու արդյունքների կայունությունը։
Լիզոցիմի և ուլտրաձայնային մշակման սիներգիայի գիտական հիմքերը
Ուլտրաձայնային մշակմամբ հեղուկ նմուշի մեջ ներմուծվում են բարձր ինտենսիվության ուլտրաձայնային ալիքներ։ Այս ալիքներն առաջացնում են մանրադիտակային պղպջակներ, որոնք արագ փլուզվում են կավիտացիա կոչվող գործընթացում։ Արդյունքում առաջացող սահքի ուժերը, ճնշման փոփոխությունները և միկրոշիթերը ֆիզիկապես քայքայում են բջջային կառուցվածքները։
Երբ ուլտրաձայնային մշակումը կիրառվում է լիզոցիմով մշակումից հետո կամ դրա հետ միաժամանակ, երկու մեթոդները փոխադարձաբար ուժեղացնում են միմյանց ազդեցությունը մի քանի կարևոր եղանակով՝
- Ավելի հեշտ հասանելիություն բջջապատին
Լիզոցիմը թուլացնում է բակտերիալ բջջապատը՝ այն դարձնելով շատ ավելի խոցելի ուլտրաձայնի առաջացրած մեխանիկական ուժերի նկատմամբ։ - Բջիջների ավելի արագ լիզիս
Ուլտրաձայնային էներգիան կտրուկ կրճատում է բջիջների ամբողջական քայքայման համար անհրաժեշտ ժամանակը՝ միայն ֆերմենտային մշակման համեմատ։ - Ավելի համաչափ մշակում
Ուլտրաձայնային մշակումը բարելավում է խառնումը՝ ապահովելով, որ բոլոր բջիջները համաչափ ենթարկվեն թե՛ լիզոցիմի, թե՛ մեխանիկական լարման ազդեցությանը։ - Սպիտակուցների ավելի բարձր ելք
Ավելի ամբողջական լիզիսը նշանակում է ներբջջային սպիտակուցների, ֆերմենտների և մետաբոլիտների ավելի մեծ քանակի ազատում՝ բարելավելով ընդհանուր կորզումը։
Լիզոցիմի օժանդակությամբ ուլտրաձայնային մշակման տիպիկ աշխատանքային ընթացակարգ
Սպիտակուցներ գերարտահայտող բակտերիալ շտամների հետ աշխատող լաբորատորիաներում լավ հաստատված աշխատանքային ընթացակարգը համատեղում է ֆերմենտային և ուլտրաձայնային լիզիսը՝
- Բջիջների վերասուսպենդացում
Հավաքված բակտերիալ նստվածքները կրկին սուսպենդացվում են լիզոցիմ պարունակող համապատասխան լիզիսի բուֆերային լուծույթում՝ սովորաբար 0,1–1 mg/mL կոնցենտրացիաներով։ Մեղմ ուլտրաձայնային մշակումը նպաստում է բջիջների արագ և համաչափ վերասուսպենդացմանը։ - Ֆերմենտային նախամշակում
Սուսպենզիան ինկուբացվում է 10–30 րոպե՝ վերահսկվող ջերմաստիճաններում (սովորաբար 4 °C և 25 °C միջակայքում)՝ հնարավորություն տալով լիզոցիմին թուլացնել բջջապատը։ - Ուլտրաձայնային քայքայում
Նախամշակված սուսպենզիան ենթարկվում է ուլտրաձայնային մշակման՝ Hielscher ուլտրաձայնային պրոցեսորի միջոցով, օպտիմալացված ամպլիտուդով, իմպուլսային ռեժիմով և սառեցմամբ։ - Պարզեցում
Բջջային մնացորդները հեռացվում են ցենտրիֆուգմամբ կամ ֆիլտրմամբ՝ թողնելով թիրախային սպիտակուցներով հարուստ պարզեցված լիզատ։
Ինչու են հետազոտողներն ընտրում Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը
Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը հատկապես հարմար են լիզոցիմի օժանդակությամբ բջջային լիզիսի համար՝ շնորհիվ իրենց ճշգրտության և ճկունության։ Հիմնական առավելություններն են՝
- Կարգավորվող ամպլիտուդ և ներմուծվող էներգիա՝ վերարտադրելի մշակման համար
- Աշխատանք իմպուլսային ռեժիմով՝ ջերմության կուտակումը նվազեցնելու համար
- Արդյունավետ կավիտացիա ծավալների և մածուցիկությունների լայն տիրույթում
- Մասշտաբի հեշտ մեծացում՝ միկրոլիտրային լաբորատոր նմուշներից մինչև արդյունաբերական արտադրություն
Այս համադրությունը Hielscher համակարգերը դարձնում է արժեքավոր գործիքներ ինչպես հետազոտական լաբորատորիաներում, այնպես էլ լայնածավալ արտադրական միջավայրերում։
UIP400MTP բազմահորատ թիթեղների ուլտրաձայնային սարք ՝ մեծ թվով նմուշների բարձր արտադրողականությամբ պատրաստման համար
Արդյունքների օպտիմալացման հիմնական գործոնները
Լիզոցիմի օժանդակությամբ ուլտրաձայնային մշակումից առավելագույն արդյունք ստանալու համար հետազոտողները մանրակրկիտ կարգավորում են մի քանի պարամետր՝
- Լիզոցիմի կոնցենտրացիա․ Օգտագործեք ամենացածր արդյունավետ դոզան՝ ծախսերը վերահսկելու և հետագա գործընթացներին միջամտությունը նվազագույնի հասցնելու համար։
- Ուլտրաձայնային էներգիա․ Կիրառեք բավարար հզորություն՝ ամբողջական լիզիս ապահովելու համար՝ առանց զգայուն սպիտակուցները վնասելու։
- Ջերմաստիճանի կառավարում․ Սառեցման համակարգերը կամ սառցային բաղնիքներն օգնում են պաշտպանել ջերմազգայուն թիրախային բաղադրիչները։
- Իմպուլսային ռեժիմի կարգավորումներ․ Ընդհատվող ուլտրաձայնային մշակումը բարելավում է կավիտացիայի արդյունավետությունը և նմուշի կայունությունը։
Բարձրացրեք լիզոցիմների արդյունավետությունը ուլտրաձայնային մշակմամբ։
Լիզոցիմի համատեղումը ուլտրաձայնային քայքայման հետ առաջարկում է հուսալի, բարձր արդյունավետությամբ լուծում բակտերիալ բջիջների լիզիսի համար։ Ուլտրաձայնային մշակումը բարձրացնում է ֆերմենտային մշակման արդյունավետությունը՝ ապահովելով ավելի արագ մշակում, ավելի ամբողջական քայքայում և ներբջջային նյութերի ավելի բարձր ելք։
Ճշգրիտ կառավարելի և մասշտաբի մեծացման հնարավորություն ունեցող ուլտրաձայնային համակարգերով, ինչպիսիք են Hielscher համակարգերը, հետազոտողները կարող են ճշգրիտ կարգավորել իրենց աշխատանքային ընթացակարգերը՝ ժամանակակից կենսատեխնոլոգիայի պահանջները բավարարելու համար՝ լինի դա փոքր լաբորատորիայում, թե արդյունաբերական արտադրական գծում։
Բակտերիաների լիզիս՝ մեծ թվով նմուշների բարձր արտադրողականությամբ մշակմամբ ՝ UIP400MTP միկրոթիթեղների ուլտրաձայնային սարքի միջոցով
Գրականություն / Հղումներ
- Ghosh, A., Bhar, K. & Siddhanta, A. (2019): Oxygen sequestration by Leghemoglobin is positively regulated via its interaction with another late nodulin, Nlj16 of Lotus japonicus. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology 28, 2019. 414–423.
- Hannah K. Lembke; Adeline Espinasse; Mckenna G. Hanson; Christian J. Grimme;Zhe Tan; Theresa M. Reineke; Erin E. Carlson (2023): Cationic Polymers Enable Internalization of Negatively Charged Chemical Probes into Bacteria. ACS Chem Biol . 2023 September 15; 18(9): 2063–2072.
- Müller MRA, Ehrmann MA, Vogel RF (2000): Multiplex PCR for the Detection ofLactobacillus pontis and Two Related Species in a Sourdough Fermentation. Applied Environmental Microbiology 66, 2000.
- Di Giosia, Matteo; Bomans, Paul; Bottoni, Andrea; Cantelli, Andrea; Falini, Giuseppe; Franchi, Paola; Guarracino, Giuseppe; Friedrich, Heiner; Lucarini, Marco; Paolucci, Francesco; Rapino, Stefania; Sommerdijk, Nico; Soldà, Alice; valle, Francesco ; Zerbetto, Francesco; Calvaresi, Matteo (2018): Proteins as Supramolecular Hosts for C60: A True Solution of C60 in Water. Nanoscale 10(21); 2018.
Հաճախ տրվող հարցեր
Ի՞նչ են լիզոցիմները
Լիզոցիմները հակամանրէային ֆերմենտներ են, որոնք կատալիզում են β(1→4) գլիկոզիդային կապերի հիդրոլիզը պեպտիդոգլիկանում՝ բակտերիալ բջջապատերի հիմնական կառուցվածքային բաղադրիչներից մեկում՝ հանգեցնելով բջջապատի թուլացման և լիզիսի, հատկապես գրամդրական բակտերիաների և թափանցելի դարձված գրամբացասական բջիջների դեպքում։
Որո՞նք են լիզոսոմների կիրառմամբ բջջային լիզիսի առավելություններն ու սահմանափակումները
Լիզոցիմների կիրառմամբ բջջային լիզիսն ունի այնպիսի առավելություններ, ինչպիսիք են ռեակցիայի մեղմ պայմանները, սպիտակուցների գործառական հատկությունների պահպանումը և ցածր մեխանիկական լարումը, սակայն այն սահմանափակվում է դանդաղ կինետիկայով, խիտ կամ դիմացկուն բակտերիալ կուլտուրաներում ոչ ամբողջական լիզիսով, գրամբացասական բակտերիաների չվնասված արտաքին թաղանթների նկատմամբ նվազած արդյունավետությամբ և բջիջների ֆիզիոլոգիայից ու աճի պայմաններից կախված փոփոխականությամբ։
Ինչպե՞ս է ուլտրաձայնային մշակումն ուժեղացնում լիզոցիմների ազդեցությունը
Ուլտրաձայնային մշակումը բարձրացնում է լիզոցիմի ակտիվությունը՝ կավիտացիայի առաջացրած սահքի ուժերի միջոցով մեխանիկորեն քայքայելով և թափանցելի դարձնելով բակտերիալ բջջապատերը, ինչն ընդլայնում է ֆերմենտի հասանելիությունը պեպտիդոգլիկանին, արագացնում լիզիսի կինետիկան և հանգեցնում բջիջների ավելի ամբողջական ու համաչափ քայքայման։
Hielscher բազմանմուշ ուլտրաձայնային սարքերի մոդելները՝ UIP400MTP՝ միկրոթիթեղների համար, VialTweeter և CupHorn․ նմուշների բարձր արագությամբ և բարձր արտադրողականությամբ պատրաստում