Proteomic Workflows with High-Throught Protein Digestion
Proteomics-ը կենսաբանական պրոցեսների և համակարգերի ըմբռնման կարևոր ոլորտ է, որտեղ սպիտակուցի մարսումը կարևոր քայլ է կազմում նրա աշխատանքային հոսքերում: Ավանդաբար, սպիտակուցի մարսումն իրականացվում է լուծույթում՝ օգտագործելով պրոտեոլիտիկ ֆերմենտներ, ինչպիսին է տրիփսինը, որը հատուկ հիդրոլիզացնում է պեպտիդային կապերը լիզինի և արգինինի մնացորդներում: Այս գործընթացը առաջացնում է պեպտիդներ, որոնք լավ հարմար են զանգվածային սպեկտրոմետրիայի (MS) կիրառություններում իոնացման և մասնատման համար: Այնուամենայնիվ, մարսողության ավանդական մեթոդները պահանջում են 12-24 ժամ ավարտին հասնելու համար՝ ստեղծելով զգալի խոչընդոտներ պրոտեոմային աշխատանքային հոսքերում:
Ուլտրաձայնային հետազոտությունն առաջարկում է հզոր այլընտրանք՝ կտրուկ կրճատելով մարսողության ժամանակը ժամերից մինչև ընդամենը մի քանի րոպե: Երբ զուգակցվում են առաջադեմ բազմակի նմուշների ձայնային սարքերի հետ, ինչպիսիք են Hielscher CupHorn-ը, VialTweeter-ը և 96-հորանոց ափսեի UIP400MTP-ի ձայնային սարքը, ուլտրաձայնային ախտորոշումը հնարավորություն է տալիս արագացված, բարձր թողունակության պրոտեոմիկա: Այս տեխնոլոգիաները պարզեցնում են աշխատանքային հոսքերը՝ նվազեցնելով նմուշների պատրաստման ժամանակը և բարձրացնելով արդյունավետությունը՝ չվնասելով վերարտադրելիությունը կամ տվյալների որակը:
Ուլտրաձայնային էներգիայի դերը սպիտակուցների մարսողության մեջ
Ultrasonication-ը օգտագործում է կենտրոնացված ուլտրաձայնային ալիքներ՝ ստեղծելու կավիտացիա՝ տեղայնացված միկրոփուչիկներ, որոնք փլուզվում են՝ առաջացնելով ինտենսիվ կտրող ուժեր: Այս երևույթը ուժեղացնում է զանգվածի փոխանցումը, նպաստում է ֆերմենտների խառնմանը սուբստրատների հետ և բացում սպիտակուցային կառուցվածքները՝ ճեղքման վայրերը ենթարկելով պրոտեոլիտիկ ֆերմենտների, ինչպիսին է տրիպսինը:
Արդյունքը. Մարսողության ժամանակի զգալի կրճատում՝ առանց արդյունավետության կամ վերարտադրելիության վտանգի:
Ուլտրաձայնային ուժեղացված պրոտեոլիտիկ մարսողություն. մեթոդաբանություն և արդյունքներ
Արագացված մարսողության արձանագրություն
Ուլտրաձայնային օգնությամբ մարսողությունը համատեղում է պրոտեոլիտիկ ֆերմենտները և ուլտրաձայնային էներգիան՝ արագացնելու աշխատանքային հոսքերը: Օրինակ, օգտագործելով Hielscher UP200St-CupHorn-ը (200 Վտ, 26 կՀց), մարսողության աշխատանքային հոսքն ընթանում է հետևյալ կերպ.
- Կրճատում. Սպիտակուցի նմուշները (0,5 մգ/մլ, 20 µL) մշակվում են DTT-ով (2 µL, 110 մՄ) ամոնիումի բիկարբոնատային բուֆերում (12,5 մՄ): Sonication կիրառվում է 50% ամպլիտուդով 5 րոպե:
- Ալկիլացում. IAA (2 µL, 400 մՄ) ավելացումից հետո կրկնվում է հնչյունավորումը նույն պայմաններում:
- Մարսում. Նմուշները նոսրացվում և ինկուբացվում են անշարժացված տրիփսինի նանոմասնիկներով: Sonication-ի վերջին փուլը (5 րոպե) ավարտում է մարսողությունը: Պեպտիդներն առանձնացվում են, չորանում և պահվում MS վերլուծության համար:
Այս ուլտրաձայնային մեթոդը նվազեցնում է պատրաստման ընդհանուր ժամանակը 12 ժամից մինչև 30 րոպե: Չնայած արագացված գործընթացին, պեպտիդների բերքատվությունը և որակը մնում են համահունչ ավանդական մեկ գիշերվա մեթոդներին:
Ուլտրաձայնային սպիտակուցի մարսողության արդյունավետությունը
E. coli պրոտեոմների օգտագործմամբ համեմատական ուսումնասիրություններում.
- Սպիտակուցի նույնականացում. Ուլտրաձայնային մարսված նմուշները 5 րոպեում հայտնաբերել են 777 սպիտակուց՝ 12 ժամվա ընթացքում 817-ի դիմաց: Ընդհանուր սպիտակուցի նույնականացումը գերազանցել է 70%-ը:
- Վերարտադրելիություն: Կրկնվող վերլուծությունները ցույց են տվել, որ հարաբերակցության արժեքները 98%-ից բարձր են յուրաքանչյուր մեթոդի շրջանակներում՝ ցույց տալով հուսալիություն:
- Ընտրողականություն: Որոշ սպիտակուցներ գերադասելիորեն մարսվում էին յուրաքանչյուր մեթոդով, ընդ որում ուլտրաձայնային մարսումը նպաստում էր 65 սպիտակուցի, իսկ գիշերվա մարսողությանը՝ 54 սպիտակուցի: Նման նրբերանգ տարբերությունները ընդգծում են հատուկ կիրառությունների համար ուլտրաձայնային ախտահանման եզակի ներուժը:
E. coli-ի մեջ յոթ սպիտակուցների քանակական պիտակավորման արդյունքները
նմուշ. Հետևյալ սպիտակուցները ավելացվել են երկու տարբեր մակարդակներում, ինչպես նշված է սյունակում
անվանվել է «Theo Ratio»: Theo Ratio-ն սա երկու մակարդակների տեսական հարաբերակցությունն է
փորձ. Տավարի շիճուկի ալբումին (ALBU), β-լակտոգլոբուլին (LACB), α-S1 կազեին (CASA1),
α-S2 կազեին (CASA2), ցիտոքրոմ c (CYC), օվալբումին (OVAL) և ածխածնի անհիդրազ 2
(CAH2): Հարաբերակցությունները հաշվարկվել են՝ օգտագործելով MaxQuant-ից ստացված LFQ սպիտակուցի ինտենսիվությունը
վերլուծություն։ Ուսանողի t թեստը կիրառվել է յուրաքանչյուր մեթոդով ստացված արժեքները համեմատելու համար (p>0.01, n=3, t-տեսական=4.6):
Ուսումնասիրություն և գրաֆիկա՝ © Martins et al., 2019)
Նանոմասնիկներ-անշարժացված տրիպսին
Տրիպսինի անշարժացված նանոմասնիկների (օրինակ՝ T-FMNPs) ինտեգրումը ուլտրաձայնային ախտորոշման հետ ավելի է ուժեղացնում պրոտեոմիկայի աշխատանքի հոսքերը: Այս նանոմասնիկները մեծ մակերես են ապահովում ֆերմենտ-սուբստրատ փոխազդեցության համար՝ բարձրացնելով արդյունավետությունը: Երբ կիրառվում է բարդ պրոտեոմների վրա, ինչպիսին է E. coli-ն, համակցված մեթոդը հասնում է.
- Արագություն: Ամբողջական մարսողությունը 5 րոպեի ընթացքում։
- Ճշգրտություն: Սպիտակուցի քանակական որոշումը համեմատելի է ավանդական մեթոդների հետ (p > 0.01, n=3):
- Մասշտաբայնություն: UIP400MTP-ի նման բազմահոր հարթակներին հարմարվելը թույլ է տալիս բարձր թողունակության մշակում:
Սեղմեք այստեղ մանրամասն արձանագրության համար՝ քայլ առ քայլ հրահանգներով:
(տես Martins et al., 2019)
Պրոտեոլիտիկ մարսում բարձր արագությամբ և բարձր թողունակությամբ Hielscher sonicators-ով
Լավագույն Sonicator մոդելները Proteomics-ի համար
Hielscher Ultrasonics-ն առաջարկում է ձայնային սարքերի տարբեր մոդելներ միաժամանակյա բազմակի նմուշների պատրաստման համար՝ հեշտացնելով բարձր թողունակության աշխատանքային հոսքերը: Անկախ նրանից՝ դուք աշխատում եք սրվակներով, փորձանոթներով, բազմափոր թիթեղներով (օրինակ՝ 6-, 24-, 96-հորանոց ափսեներով) կամ Պետրի ափսեներով – մենք առաջարկում ենք ձեզ իդեալական ձայնային սարքեր ձեր փորձերի համար:
UIP400MTP բազմաբնակարան ափսեի ձայնավորիչ
Առավելագույն թողունակության համար UIP400MTP-ն ապահովում է 96 ջրհորի թիթեղները ուլտրաձայնային եղանակով մշակելու հնարավորություն: Համատեղելի ցանկացած ստանդարտ միկրոափսեի հետ՝ UIP400MTP-ը չի պահանջում թանկարժեք միանգամյա օգտագործման պիտույքներ և ձեզ ազատություն է տալիս ընտրել լավագույն բազմահոր ափսեը ձեր հետազոտության համար: Միատեսակ էներգիա փոխանցելով ափսեի միջով, այն հնարավորություն է տալիս արագ կրճատել, ալկիլացում և մարսել մինչև 200 բարդ պրոտեոմներ ընդամենը 1 ժամում: Ավտոմատացման և արդյունավետության այս մակարդակը կարևոր է բարձր թողունակության պրոտեոմիկայի և կլինիկական կիրառությունների համար: Իմացեք ավելին բազմաբնակարան ափսեի ձայնային սարքի մասին:
VialTweeter
VialTweeter-ը հարմարեցված է լաբորատորիաների համար, որոնք պահանջում են մինչև 10 սրվակի կամ փորձանոթների միաժամանակյա ձայնագրում: Դրա ոչ ինվազիվ մոտեցումը վերացնում է խաչաձեւ աղտոտման ռիսկերը՝ միաժամանակ ապահովելով վերարտադրվող սպիտակուցի մարսողությունը: Այս սարքը իդեալական է հետազոտողների համար, ովքեր աշխատում են նմուշների սահմանափակ ծավալներով կամ տարբեր տեսակի նմուշներով:
Իմացեք ավելին VialTweeter բազմախողովակային sonicator-ի մասին:
Hielscher UP200St-CupHorn
CupHorn sonicator-ը հզոր սարք է, որը նախատեսված է փակ տարաներում բազմաթիվ նմուշների միաժամանակյա մշակման համար: Այն ապահովում է միասնական ուլտրաձայնային էներգիայի բաշխում և ճշգրիտ ջերմաստիճանի վերահսկում: Մինչև հինգ նմուշ միաժամանակ մշակելու ունակությունը, որը զուգորդվում է կրճատված, ալկիլացված և մարսվող աշխատանքային հոսքերի հետ համատեղելիությամբ, CupHorn-ը դարձնում է հուսալի գործիք MS-ի վրա հիմնված պրոտեոմիկայի համար:
Իմացեք ավելին CupHorn SonoReactor-ի մասին:
The UIP400MTP is not an ultrasonic bath. It'a a high intensity cup horn for focused sonication. This powerful non-contact sonicator delivers a uniform sonication across all wells of your standard well-plate. You have precise control over amplitude, power, and pulsing. A built-in timer and temperature probe ensures consistent results. The UIP400MTP plate sonicator cools samples with water bath (external chiller optional).
The UIP400MTP is not an ultrasonic bath. It'a a high intensity cup horn for focused sonication. This powerful non-contact sonicator delivers a uniform sonication across all wells of your standard well-plate. You have precise control over amplitude, power, and pulsing. A built-in timer and temperature probe ensures consistent results. The UIP400MTP plate sonicator cools samples with water bath (external chiller optional).
Քայլ առ քայլ արձանագրություն ուլտրաձայնային օգնությամբ պրոտեոլիտիկ մարսողության համար՝ օգտագործելով նանոմասնիկներով անշարժացված տրիպսին
Մարտինսի և այլքների այս արձանագրությունը: (2019) օպտիմիզացված է սպիտակուցների արագ մարսման համար՝ օգտագործելով ուլտրաձայնային էներգիան և նանոմասնիկներով անշարժացված տրիպսինը (T-FMNPs): Նշված քայլերը ապահովում են արդյունավետ նվազեցում, ալկիլացում և պրոտեոլիզ, որը հարմար է զանգվածային սպեկտրոմետրիայի (MS) կիրառությունների համար:
Արձանագրության քայլեր
- Դիսուլֆիդային կապերի կրճատում
- AmBic բուֆերում ավելացրեք 2 µL DTT լուծույթ (110 մՄ) 20 µL սպիտակուցի նմուշին (0,5 մգ/մլ):
- Տեղադրեք նմուշի խողովակը UP200St-CupHorn սոնորեակտորում:
- Նմուշը 2,5 րոպեի ընթացքում 50% ամպլիտուդով (200 Վտ, 26 կՀց) ներծծում են ձայնով:
- Դադարեցրեք կարճ ընդմիջումով, որպեսզի սառչեք, ապա նույն պայմաններում ևս 2,5 րոպե հնչյունավորեք:
- Նվազեցված ցիստեինի մնացորդների ալկիլացում
- Կրճատված սպիտակուցի նմուշին ավելացրեք 2 µL IAA լուծույթ (400 մՄ):
- Ալկիլացումը հեշտացնելու համար 2,5 րոպե 50% ամպլիտուդով քսել ձայնով:
- Դադարեցրեք սառեցման համար, այնուհետև լրացուցիչ 2,5 րոպե հնչյունավորեք:
Նշում. Նվազագույնի հասցրեք ալկիլացված նմուշի ազդեցությունը լույսի ներքո՝ IAA-ի քայքայումը կանխելու համար:
- Նմուշի նոսրացում
- Ալկիլացված սպիտակուցի նմուշը նոսրացրեք մինչև 100 µL վերջնական ծավալ՝ օգտագործելով 25 մՄ AmBic բուֆեր, որը պարունակում է 4% ացետոնիտրիլ (v/v):
- Մանրակրկիտ խառնել՝ նուրբ խողովակով:
- Պրոտեոլիտիկ մարսողություն նանոմասնիկների կողմից անշարժացված տրիփսինով
- Նոսրացված սպիտակուցի նմուշին ավելացրեք 20 µL T-FMNP լուծույթ (3 մգ/մլ):
- Խառնուրդը սոնորեակտորում 2,5 րոպեով 50% ամպլիտուդով լուծեք:
- Դադարեցրեք սառեցման համար, այնուհետև նույն պայմաններում ևս 2,5 րոպե հնչյունավորեք:
- Տրիպսինի նանոմասնիկների տարանջատում
- Օգտագործեք մագնիս՝ T-FMNP-ները մարսված պեպտիդներ պարունակող վերին նյութից առանձնացնելու համար:
- Վերցրած նյութը տեղափոխեք նոր միկրոցենտրիֆուգային խողովակի մեջ:
- Պեպտիդային պատրաստում MS վերլուծության համար
- Պեպտիդներ պարունակող գերնույն նյութը չորացրեք վակուումային ցենտրիֆուգայում:
- Պահպանեք չորացրած պեպտիդները -20°C-ում մինչև զանգվածային սպեկտրաչափով հետագա վերլուծությունը:
Գրականություն / Հղումներ
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet VialTweeter Multi-Tube Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Gonçalo Martins, Javier Fernández-Lodeiro, Jamila Djafari, Carlos Lodeiro, J.L. Capelo, Hugo M. Santos (2019): Label-free protein quantification after ultrafast digestion of complex proteomes using ultrasonic energy and immobilized-trypsin magnetic nanoparticles. Talanta, Volume 196, 2019. 262-270.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
Հաճախակի տրվող հարցեր
Որո՞նք են պրոտեոմի վերլուծության 5 քայլերը:
Պրոտեոմի վերլուծության հինգ քայլերն են՝ (1) սպիտակուցի արդյունահանումը, որտեղ սպիտակուցները մեկուսացվում են կենսաբանական նմուշներից՝ օգտագործելով լիզի բուֆերներ. (2) սպիտակուցների տարանջատում, որը սովորաբար ձեռք է բերվում այնպիսի տեխնիկայի միջոցով, ինչպիսին է գելային էլեկտրոֆորեզը կամ հեղուկ քրոմատագրությունը՝ բարդ խառնուրդները լուծելու համար. (3) սպիտակուցների մարսողություն, որտեղ սպիտակուցները ֆերմենտորեն բաժանվում են պեպտիդների՝ հաճախ օգտագործելով տրիպսին. (4) զանգվածային սպեկտրաչափական վերլուծություն, որտեղ պեպտիդները իոնացվում են, մասնատվում և վերլուծվում դրանց զանգվածը և հաջորդականությունը որոշելու համար. և (5) տվյալների վերլուծություն, որտեղ բիոինֆորմատիկայի գործիքները հայտնաբերում և քանակականացնում են սպիտակուցները՝ հիմնվելով զանգվածային սպեկտրոմետրիայի տվյալների վրա՝ ապահովելով պրոտեոմի վերաբերյալ պատկերացումներ:
Ի՞նչ է պրոտեոլիտիկ մարսողությունը:
Պրոտեոլիտիկ մարսողությունը ֆերմենտային գործընթաց է, որի միջոցով սպիտակուցները հիդրոլիզացվում են ավելի փոքր պեպտիդների կամ ամինաթթուների՝ պեպտիդային կապերի ճեղքման միջոցով, որը սովորաբար հեշտացնում է պրոտեոլիտիկ ֆերմենտները:
Որո՞նք են 3 պրոտեոլիտիկ ֆերմենտները:
Երեք հիմնական պրոտեոլիտիկ ֆերմենտներն են տրիպսինը, քիմոտրիպսինը և պեպսինը, որոնցից յուրաքանչյուրն ունի հատուկ սուբստրատի առանձնահատկություններ և գործունեության օպտիմալ պայմաններ:
Որո՞նք են պրոտեոլիզի մեթոդները:
Պրոտեոլիզի մեթոդները ներառում են ֆերմենտային մարսողություն (օրինակ՝ օգտագործելով տրիպսին կամ այլ պրոտեազներ), քիմիական տարանջատում (օր.՝ ցիանոգենի բրոմիդ՝ մեթիոնինի մնացորդների համար) և ֆիզիկական մեթոդներ, ինչպիսիք են ուլտրաձայնայինացումը՝ ֆերմենտային ակտիվությունը բարձրացնելու համար:
Ի՞նչն է խանգարում պրոտեոլիզին:
Պրոտեոլիզը կարող է արգելակվել պրոթեզերոնի ինհիբիտորներով, ինչպիսիք են ֆենիլմեթիլսուլֆոնիլ ֆտորիդը (PMSF) կամ էթիլենդիամինտետրաքացախաթթուն (EDTA), շրջակա միջավայրի գործոններով, ինչպիսիք են ծայրահեղ pH-ը կամ ջերմաստիճանը, կամ պրոթեզերոնի ակտիվության համար անհրաժեշտ կոֆակտորների բացակայությամբ:
Hielscher Ultrasonics-ը արտադրում է բարձր արդյունավետության ուլտրաձայնային հոմոգենիզատորներ լաբորատորիա դեպի արդյունաբերական չափս.