Պրոտեոմիկական աշխատանքային գործընթացներ՝ սպիտակուցների բարձր թողունակությամբ մարսմամբ

Պրոտեոմիկան կենսաբանական գործընթացներն ու համակարգերը հասկանալու համար առանցքային ոլորտ է, որի աշխատանքային գործընթացներում սպիտակուցների մարսումը կարևոր փուլ է։ Ավանդաբար սպիտակուցների մարսումն իրականացվում է լուծույթում՝ պրոտեոլիտիկ ֆերմենտների, օրինակ՝ տրիպսինի միջոցով, որը յուրահատկորեն հիդրոլիզում է պեպտիդային կապերը լիզինի և արգինինի մնացորդների դիրքերում։ Այս գործընթացում առաջանում են պեպտիդներ, որոնք լավ են համապատասխանում զանգվածային սպեկտրաչափության (MS) կիրառություններում իոնացմանն ու ֆրագմենտացմանը։ Սակայն մարսման սովորական մեթոդներով գործընթացն ավարտելու համար պահանջվում է 12–24 ժամ, ինչը զգալի խոչընդոտներ է ստեղծում պրոտեոմիկական աշխատանքային գործընթացներում։
Ուլտրաձայնային մշակումը հզոր այլընտրանք է առաջարկում՝ կտրուկ կրճատելով մարսման տևողությունը ժամերից մինչև ընդամենը մի քանի րոպե։ Բազմաթիվ նմուշների մշակման առաջադեմ ուլտրաձայնային սարքերի, ինչպիսիք են Hielscher CupHorn, VialTweeter և 96 հորիկով թիթեղների մշակման UIP400MTP սարքերը, հետ համատեղ ուլտրաձայնային մշակումը հնարավորություն է տալիս իրականացնել արագացված, բարձր թողունակությամբ պրոտեոմիկական աշխատանքներ։ Այս տեխնոլոգիաները պարզեցնում են աշխատանքային գործընթացները՝ կրճատելով նմուշների նախապատրաստման ժամանակը և բարձրացնելով արդյունավետությունը՝ առանց վերարտադրելիությունը կամ տվյալների որակը վատթարացնելու։

Ուլտրաձայնային էներգիայի դերը սպիտակուցների մարսման մեջ

Ուլտրաձայնային մշակման ժամանակ կիրառվում են կենտրոնացված ուլտրաձայնային ալիքներ՝ կավիտացիա առաջացնելու համար՝ տեղային միկրոպղպջակների ձևավորում, որոնք փլուզվելիս առաջացնում են ինտենսիվ սահքային ուժեր։ Այս երևույթն ուժեղացնում է զանգվածափոխանակությունը, նպաստում ֆերմենտների խառնմանը սուբստրատների հետ և բացում սպիտակուցային կառուցվածքները՝ ճեղքման տեղամասերը հասանելի դարձնելով պրոտեոլիտիկ ֆերմենտներին, օրինակ՝ տրիպսինին։
Արդյունքո՞ւմ։ Մարսման տևողության զգալի կրճատում՝ առանց արդյունավետությունը կամ վերարտադրելիությունը վատթարացնելու։

Ուլտրաձայնով ուժեղացված պրոտեոլիտիկ մարսում․ մեթոդաբանություն և արդյունքներ

Արագացված մարսման արձանագրություն

Ուլտրաձայնի օժանդակությամբ մարսումը համատեղում է պրոտեոլիտիկ ֆերմենտներն ու ուլտրաձայնային էներգիան՝ աշխատանքային գործընթացներն արագացնելու համար։ Օրինակ՝ Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz) սարքն օգտագործելիս մարսման աշխատանքային գործընթացն ընթանում է հետևյալ կերպ․

1. Վերականգնում․ սպիտակուցային նմուշները (0,5 mg/mL, 20 µL) մշակվում են DTT (2 µL, 110 mM) ռեագենտով՝ ամոնիումի բիկարբոնատային բուֆերում (12,5 mM)։ Ուլտրաձայնային մշակումը կատարվում է 50% ամպլիտուդով՝ 5 րոպե։
2. Ալկիլացում․ IAA (2 µL, 400 mM) ավելացնելուց հետո ուլտրաձայնային մշակումը կրկնվում է նույն պայմաններում։
3. Մարսում․ նմուշները նոսրացվում են և ինկուբացվում տրիպսին պարունակող նանոմասնիկների հետ, որոնց վրա այն անշարժացված է։ Ուլտրաձայնային մշակման վերջին փուլը (5 րոպե) ավարտում է մարսումը։ Պեպտիդներն առանձնացվում են, չորացվում և պահվում MS վերլուծության համար։

Այս ուլտրաձայնային մեթոդը նախապատրաստման ընդհանուր տևողությունը 12 ժամից կրճատում է մինչև 30 րոպեից պակաս։ Չնայած գործընթացի արագացմանը՝ պեպտիդների ելքն ու որակը մնում են համահունչ ամբողջ գիշեր տևող ավանդական մեթոդների արդյունքներին։

Սպիտակուցների ուլտրաձայնային մարսման արդյունավետությունը

E. coli մանրէի պրոտեոմների օգտագործմամբ համեմատական ուսումնասիրություններում՝

• Սպիտակուցների նույնականացում․ Ուլտրաձայնով մարսված նմուշներում 5 րոպեում նույնականացվել է 777 սպիտակուց՝ ի համեմատ 12 ժամում նույնականացված 817 սպիտակուցի։ Երկու մեթոդներով նույնականացված ընդհանուր սպիտակուցների բաժինը գերազանցել է 70%։
• Վերարտադրելիություն․ Կրկնակի վերլուծությունները յուրաքանչյուր մեթոդի շրջանակում ցույց են տվել 98%-ից բարձր կորելյացիայի արժեքներ՝ վկայելով հուսալիության մասին։
• Ընտրողականություն․ Յուրաքանչյուր մեթոդով որոշ սպիտակուցներ նախընտրելիորեն են մարսվել․ ուլտրաձայնային մարսումն առավել նպաստավոր է եղել 65 սպիտակուցի, իսկ ամբողջ գիշեր տևող մարսումը՝ 54 սպիտակուցի համար։ Նման նուրբ տարբերություններն ընդգծում են ուլտրաձայնային մշակման եզակի ներուժը որոշակի կիրառությունների համար։

E. coli մանրէի նմուշին ավելացված յոթ սպիտակուցների՝ առանց պիտակավորման քանակական որոշման
արդյունքները։ Հետևյալ սպիտակուցներն ավելացվել են երկու տարբեր մակարդակներով, ինչպես նշված է
«Theo Ratio» անվանումով սյունակում։ Theo Ratio ցուցանիշը այս փորձարկման մեջ օգտագործված երկու մակարդակների տեսական
հարաբերությունն է։ Ցուլի շիճուկային ալբումին (ALBU), β-լակտոգլոբուլին (LACB), α-S1 կազեին (CASA1),
α-S2 կազեին (CASA2), ցիտոքրոմ c (CYC), օվալբումին (OVAL) և կարբոանհիդրազ 2
(CAH2)։ Հարաբերությունները հաշվարկվել են սպիտակուցների LFQ ինտենսիվությունների հիման վրա, որոնք ստացվել են MaxQuant ծրագրով
վերլուծությունից։ Յուրաքանչյուր մեթոդով ստացված արժեքները համեմատելու համար կիրառվել է Ստյուդենտի t-թեստը (p>0,01, n=3, t-theoretical=4,6)։
Ուսումնասիրությունը և գրաֆիկը՝ © Martins et al., 2019)

Նանոմասնիկների վրա անշարժացված տրիպսին

Անշարժացված տրիպսին պարունակող նանոմասնիկների (օրինակ՝ T-FMNPs) համակցումն ուլտրաձայնային մշակման հետ էլ ավելի է բարելավում պրոտեոմիկայի աշխատանքային ընթացակարգերը։ Այս նանոմասնիկներն ապահովում են մակերևույթի մեծ մակերես ֆերմենտ–սուբստրատ փոխազդեցությունների համար՝ բարձրացնելով արդյունավետությունը։ Բարդ պրոտեոմների, օրինակ՝ E. coli պրոտեոմի նկատմամբ կիրառելիս համակցված մեթոդն ապահովում է՝

• Արագություն. Ամբողջական մարսում՝ 5 րոպեի ընթացքում։
• Ճշգրտություն. Սպիտակուցների քանակական որոշում՝ ավանդական մեթոդների հետ համադրելի արդյունքներով (p > 0,01, n=3)։
• Մասշտաբի մեծացման հնարավորություն. UIP400MTP սարքի նման բազմափոսիկ հարթակներին հարմարեցումը հնարավորություն է տալիս նմուշները մշակել բարձր թողունակությամբ։

Սեղմեք այստեղ՝ քայլ առ քայլ հրահանգներով մանրամասն արձանագրությանը ծանոթանալու համար։
(համեմ.՝ Martins et al., 2019)

Բարձր արագությամբ և նմուշների մշակման բարձր թողունակությամբ պրոտեոլիտիկ մարսում՝ Hielscher սոնիկատորներով

Սոնիկատորների լավագույն մոդելները պրոտեոմիկայի համար

Hielscher Ultrasonics ընկերությունն առաջարկում է սոնիկատորների տարբեր մոդելներ՝ բազմաթիվ նմուշների միաժամանակյա նախապատրաստման համար՝ նպաստելով նմուշների մշակման բարձր թողունակությամբ աշխատանքային ընթացակարգերին։ Անկախ նրանից՝ աշխատում եք սրվակներով, փորձանոթներով, բազմափոսիկ թիթեղներով (օրինակ՝ 6, 24 կամ 96 փոսիկ ունեցող թիթեղներով), թե Պետրիի թասերով՝ մենք առաջարկում ենք իդեալական սոնիկատորներ ձեր փորձերի համար։

UIP400MTP բազմափոսիկ թիթեղների սոնիկատոր

Առավելագույն թողունակություն ապահովելու համար UIP400MTP սարքը հնարավորություն է տալիս ուլտրաձայնով մշակել 96 փոսիկ ունեցող թիթեղներ։ Համատեղելի լինելով ցանկացած ստանդարտ միկրոթիթեղի հետ՝ UIP400MTP սարքը չի պահանջում թանկարժեք, միայն տվյալ արտադրողին հատուկ միանգամյա պարագաներ և ձեզ ազատություն է տալիս ընտրելու ձեր հետազոտության համար լավագույն բազմափոսիկ թիթեղը։ Թիթեղի ամբողջ մակերեսով հավասարաչափ էներգիա հաղորդելով՝ այն հնարավորություն է տալիս ընդամենը 1 ժամում կատարել մինչև 200 բարդ պրոտեոմների արագ վերականգնում, ալկիլացում և մարսում։ Ավտոմատացման և արդյունավետության այս մակարդակը վճռորոշ է նմուշների մշակման բարձր թողունակությամբ պրոտեոմիկայի և կլինիկական կիրառությունների համար։ Իմացեք ավելին բազմափոսիկ թիթեղների սոնիկատորի մասին։

VialTweeter

VialTweeter սարքը նախատեսված է այն լաբորատորիաների համար, որոնց անհրաժեշտ է միաժամանակ ուլտրաձայնով մշակել մինչև 10 սրվակ կամ փորձանոթ։ Դրա ոչ ինվազիվ մոտեցումը վերացնում է խաչաձև աղտոտման ռիսկերը՝ միաժամանակ ապահովելով սպիտակուցների մարսման վերարտադրելիությունը։ Այս սարքն իդեալական է այն հետազոտողների համար, որոնք աշխատում են սահմանափակ ծավալով կամ տարբեր տեսակի նմուշների հետ։
Իմացեք ավելին VialTweeter բազմափորձանոթ սոնիկատորի մասին։

Hielscher UP200St-CupHorn

CupHorn սոնիկատորը հզոր սարք է, որը նախատեսված է հերմետիկ փակ տարաներում բազմաթիվ նմուշների միաժամանակյա մշակման համար։ Այն ապահովում է ուլտրաձայնային էներգիայի հավասարաչափ բաշխում և ջերմաստիճանի ճշգրիտ վերահսկում։ Միաժամանակ մինչև հինգ նմուշ մշակելու հնարավորությունը՝ վերականգնում, ալկիլացում և մարսում ներառող աշխատանքային ընթացակարգերի հետ համատեղելիության հետ միասին, CupHorn սարքը դարձնում է հուսալի գործիք MS մեթոդի վրա հիմնված պրոտեոմիկայի համար։
Իմացեք ավելին CupHorn SonoReactor սարքի մասին։

Նանոմասնիկների վրա անշարժացված տրիպսինով ուլտրաձայնի օժանդակությամբ պրոտեոլիտիկ մարսման քայլ առ քայլ արձանագրություն

Martins et al. (2019) հեղինակների այս արձանագրությունն օպտիմալացված է սպիտակուցների արագ մարսման համար՝ ուլտրաձայնային էներգիայի և նանոմասնիկների վրա անշարժացված տրիպսինի (T-FMNPs) կիրառմամբ։ Նկարագրված քայլերն ապահովում են արդյունավետ վերականգնում, ալկիլացում և պրոտեոլիզ՝ զանգվածային սպեկտրաչափության (MS) կիրառությունների համար պիտանի արդյունքներով։
Արձանագրության քայլերը

1. Դիսուլֆիդային կապերի վերականգնում
   • AmBic բուֆերում գտնվող 20 µL սպիտակուցային նմուշին (0,5 mg/mL) ավելացրեք 2 µL DTT լուծույթ (110 mM)։
   • Նմուշով փորձանոթը տեղադրեք UP200St-CupHorn սոնոռեակտորում։
   • Նմուշը մշակեք ուլտրաձայնով 2,5 րոպե՝ 50% ամպլիտուդով (200 W, 26 kHz)։
   • Կարճատև դադար տվեք՝ սառեցման համար, ապա նույն պայմաններում ուլտրաձայնով մշակեք ևս 2,5 րոպե։
2. Վերականգնված ցիստեինային մնացորդների ալկիլացում
   • Վերականգնված սպիտակուցային նմուշին ավելացրեք 2 µL IAA լուծույթ (400 mM)։
   • Ալկիլացմանը նպաստելու համար ուլտրաձայնով մշակեք 2,5 րոպե՝ 50% ամպլիտուդով։
   • Դադար տվեք՝ սառեցման համար, ապա ուլտրաձայնով մշակեք ևս 2,5 րոպե։

   Նշում. Նվազագույնի հասցրեք ալկիլացված նմուշի լուսային ազդեցությունը՝ IAA նյութի քայքայումը կանխելու համար։

3. Նմուշի նոսրացում
   • Ալկիլացված սպիտակուցային նմուշը նոսրացրեք մինչև 100 µL վերջնական ծավալ՝ օգտագործելով 4% ացետոնիտրիլ (v/v) պարունակող 25 mM AmBic բուֆեր։
   • Մանրակրկիտ խառնեք՝ պիպետով մեղմորեն ներծծելով և արտամղելով։
4. Պրոտեոլիտիկ մարսում՝ նանոմասնիկների վրա անշարժացված տրիպսինով
   • Նոսրացված սպիտակուցային նմուշին ավելացրեք 20 µL T-FMNP լուծույթ (3 mg/mL)։
   • Խառնուրդը սոնոռեակտորում մշակեք ուլտրաձայնով 2,5 րոպե՝ 50% ամպլիտուդով։
   • Սառեցման համար դադար տվեք, ապա նույն պայմաններում ուլտրաձայնով մշակեք ևս 2,5 րոպե։
5. Անշարժացված տրիպսին կրող նանոմասնիկների բաժանում
   • Մագնիսով առանձնացրեք T-FMNPs նանոմասնիկները մարսման արդյունքում ստացված պեպտիդներ պարունակող վերնստվածքային հեղուկից։
   • Վերնստվածքային հեղուկը տեղափոխեք նոր միկրոցենտրիֆուգային փորձանոթի մեջ։
6. Պեպտիդների նախապատրաստում MS վերլուծության համար
   • Պեպտիդներ պարունակող վերնստվածքային հեղուկը չորացրեք վակուումային ցենտրիֆուգում։
   • Չորացրած պեպտիդները պահեք -20°C ջերմաստիճանում՝ մինչև հետագա զանգվածային սպեկտրաչափական վերլուծությունը։