Proteomic Workflows with High-Throught Protein Digestion

Proteomics-ը կենսաբանական պրոցեսների և համակարգերի ըմբռնման կարևոր ոլորտ է, որտեղ սպիտակուցի մարսումը կարևոր քայլ է կազմում նրա աշխատանքային հոսքերում: Ավանդաբար, սպիտակուցի մարսումն իրականացվում է լուծույթում՝ օգտագործելով պրոտեոլիտիկ ֆերմենտներ, ինչպիսին է տրիփսինը, որը հատուկ հիդրոլիզացնում է պեպտիդային կապերը լիզինի և արգինինի մնացորդներում: Այս գործընթացը առաջացնում է պեպտիդներ, որոնք լավ հարմար են զանգվածային սպեկտրոմետրիայի (MS) կիրառություններում իոնացման և մասնատման համար: Այնուամենայնիվ, մարսողության ավանդական մեթոդները պահանջում են 12-24 ժամ ավարտին հասնելու համար՝ ստեղծելով զգալի խոչընդոտներ պրոտեոմային աշխատանքային հոսքերում:
Ուլտրաձայնային հետազոտությունն առաջարկում է հզոր այլընտրանք՝ կտրուկ կրճատելով մարսողության ժամանակը ժամերից մինչև ընդամենը մի քանի րոպե: Երբ զուգակցվում են առաջադեմ բազմակի նմուշների ձայնային սարքերի հետ, ինչպիսիք են Hielscher CupHorn-ը, VialTweeter-ը և 96-հորանոց ափսեի UIP400MTP-ի ձայնային սարքը, ուլտրաձայնային ախտորոշումը հնարավորություն է տալիս արագացված, բարձր թողունակության պրոտեոմիկա: Այս տեխնոլոգիաները պարզեցնում են աշխատանքային հոսքերը՝ նվազեցնելով նմուշների պատրաստման ժամանակը և բարձրացնելով արդյունավետությունը՝ չվնասելով վերարտադրելիությունը կամ տվյալների որակը:

Ուլտրաձայնային էներգիայի դերը սպիտակուցների մարսողության մեջ

Ultrasonication-ը օգտագործում է կենտրոնացված ուլտրաձայնային ալիքներ՝ ստեղծելու կավիտացիա՝ տեղայնացված միկրոփուչիկներ, որոնք փլուզվում են՝ առաջացնելով ինտենսիվ կտրող ուժեր: Այս երևույթը ուժեղացնում է զանգվածի փոխանցումը, նպաստում է ֆերմենտների խառնմանը սուբստրատների հետ և բացում սպիտակուցային կառուցվածքները՝ ճեղքման վայրերը ենթարկելով պրոտեոլիտիկ ֆերմենտների, ինչպիսին է տրիպսինը:
Արդյունքը. Մարսողության ժամանակի զգալի կրճատում՝ առանց արդյունավետության կամ վերարտադրելիության վտանգի:

Ուլտրաձայնային ուժեղացված պրոտեոլիտիկ մարսողություն. մեթոդաբանություն և արդյունքներ

Արագացված մարսողության արձանագրություն

Ուլտրաձայնային օգնությամբ մարսողությունը համատեղում է պրոտեոլիտիկ ֆերմենտները և ուլտրաձայնային էներգիան՝ արագացնելու աշխատանքային հոսքերը: Օրինակ, օգտագործելով Hielscher UP200St-CupHorn-ը (200 Վտ, 26 կՀց), մարսողության աշխատանքային հոսքն ընթանում է հետևյալ կերպ.

1. Կրճատում. Սպիտակուցի նմուշները (0,5 մգ/մլ, 20 µL) մշակվում են DTT-ով (2 µL, 110 մՄ) ամոնիումի բիկարբոնատային բուֆերում (12,5 մՄ): Sonication կիրառվում է 50% ամպլիտուդով 5 րոպե:
2. Ալկիլացում. IAA (2 µL, 400 մՄ) ավելացումից հետո կրկնվում է հնչյունավորումը նույն պայմաններում:
3. Մարսում. Նմուշները նոսրացվում և ինկուբացվում են անշարժացված տրիփսինի նանոմասնիկներով: Sonication-ի վերջին փուլը (5 րոպե) ավարտում է մարսողությունը: Պեպտիդներն առանձնացվում են, չորանում և պահվում MS վերլուծության համար:

Այս ուլտրաձայնային մեթոդը նվազեցնում է պատրաստման ընդհանուր ժամանակը 12 ժամից մինչև 30 րոպե: Չնայած արագացված գործընթացին, պեպտիդների բերքատվությունը և որակը մնում են համահունչ ավանդական մեկ գիշերվա մեթոդներին:

Ուլտրաձայնային սպիտակուցի մարսողության արդյունավետությունը

E. coli պրոտեոմների օգտագործմամբ համեմատական ուսումնասիրություններում.

• Սպիտակուցի նույնականացում. Ուլտրաձայնային մարսված նմուշները 5 րոպեում հայտնաբերել են 777 սպիտակուց՝ 12 ժամվա ընթացքում 817-ի դիմաց: Ընդհանուր սպիտակուցի նույնականացումը գերազանցել է 70%-ը:
• Վերարտադրելիություն: Կրկնվող վերլուծությունները ցույց են տվել, որ հարաբերակցության արժեքները 98%-ից բարձր են յուրաքանչյուր մեթոդի շրջանակներում՝ ցույց տալով հուսալիություն:
• Ընտրողականություն: Որոշ սպիտակուցներ գերադասելիորեն մարսվում էին յուրաքանչյուր մեթոդով, ընդ որում ուլտրաձայնային մարսումը նպաստում էր 65 սպիտակուցի, իսկ գիշերվա մարսողությանը՝ 54 սպիտակուցի: Նման նրբերանգ տարբերությունները ընդգծում են հատուկ կիրառությունների համար ուլտրաձայնային ախտահանման եզակի ներուժը:

E. coli-ի մեջ յոթ սպիտակուցների քանակական պիտակավորման արդյունքները
նմուշ. Հետևյալ սպիտակուցները ավելացվել են երկու տարբեր մակարդակներում, ինչպես նշված է սյունակում
անվանվել է «Theo Ratio»: Theo Ratio-ն սա երկու մակարդակների տեսական հարաբերակցությունն է
փորձ. Տավարի շիճուկի ալբումին (ALBU), β-լակտոգլոբուլին (LACB), α-S1 կազեին (CASA1),
α-S2 կազեին (CASA2), ցիտոքրոմ c (CYC), օվալբումին (OVAL) և ածխածնի անհիդրազ 2
(CAH2): Հարաբերակցությունները հաշվարկվել են՝ օգտագործելով MaxQuant-ից ստացված LFQ սպիտակուցի ինտենսիվությունը
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
Ուսումնասիրություն և գրաֆիկա՝ © Martins et al., 2019)

Նանոմասնիկներ-անշարժացված տրիպսին

Տրիպսինի անշարժացված նանոմասնիկների (օրինակ՝ T-FMNPs) ինտեգրումը ուլտրաձայնային ախտորոշման հետ ավելի է ուժեղացնում պրոտեոմիկայի աշխատանքի հոսքերը: Այս նանոմասնիկները մեծ մակերես են ապահովում ֆերմենտ-սուբստրատ փոխազդեցության համար՝ բարձրացնելով արդյունավետությունը: Երբ կիրառվում է բարդ պրոտեոմների վրա, ինչպիսին է E. coli-ն, համակցված մեթոդը հասնում է.

• Արագություն: Ամբողջական մարսողությունը 5 րոպեի ընթացքում։
• Ճշգրտություն: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• Մասշտաբայնություն: UIP400MTP-ի նման բազմահոր հարթակներին հարմարվելը թույլ է տալիս բարձր թողունակության մշակում:

Սեղմեք այստեղ մանրամասն արձանագրության համար՝ քայլ առ քայլ հրահանգներով:
(տես Martins et al., 2019)

Պրոտեոլիտիկ մարսում բարձր արագությամբ և բարձր թողունակությամբ Hielscher sonicators-ով

Լավագույն Sonicator մոդելները Proteomics-ի համար

Hielscher Ultrasonics-ն առաջարկում է ձայնային սարքերի տարբեր մոդելներ միաժամանակյա բազմակի նմուշների պատրաստման համար՝ հեշտացնելով բարձր թողունակության աշխատանքային հոսքերը: Անկախ նրանից՝ դուք աշխատում եք սրվակներով, փորձանոթներով, բազմափոր թիթեղներով (օրինակ՝ 6-, 24-, 96-հորանոց ափսեներով) կամ Պետրի ափսեներով – մենք առաջարկում ենք ձեզ իդեալական ձայնային սարքեր ձեր փորձերի համար:

UIP400MTP բազմաբնակարան ափսեի ձայնավորիչ

Առավելագույն թողունակության համար UIP400MTP-ն ապահովում է 96 ջրհորի թիթեղները ուլտրաձայնային եղանակով մշակելու հնարավորություն: Համատեղելի ցանկացած ստանդարտ միկրոափսեի հետ՝ UIP400MTP-ը չի պահանջում թանկարժեք միանգամյա օգտագործման պիտույքներ և ձեզ ազատություն է տալիս ընտրել լավագույն բազմահոր ափսեը ձեր հետազոտության համար: Միատեսակ էներգիա փոխանցելով ափսեի միջով, այն հնարավորություն է տալիս արագ կրճատել, ալկիլացում և մարսել մինչև 200 բարդ պրոտեոմներ ընդամենը 1 ժամում: Ավտոմատացման և արդյունավետության այս մակարդակը կարևոր է բարձր թողունակության պրոտեոմիկայի և կլինիկական կիրառությունների համար: Իմացեք ավելին բազմաբնակարան ափսեի ձայնային սարքի մասին:

VialTweeter

VialTweeter-ը հարմարեցված է լաբորատորիաների համար, որոնք պահանջում են մինչև 10 սրվակի կամ փորձանոթների միաժամանակյա ձայնագրում: Դրա ոչ ինվազիվ մոտեցումը վերացնում է խաչաձեւ աղտոտման ռիսկերը՝ միաժամանակ ապահովելով վերարտադրվող սպիտակուցի մարսողությունը: Այս սարքը իդեալական է հետազոտողների համար, ովքեր աշխատում են նմուշների սահմանափակ ծավալներով կամ տարբեր տեսակի նմուշներով:
Իմացեք ավելին VialTweeter բազմախողովակային sonicator-ի մասին:

Hielscher UP200St-CupHorn

CupHorn sonicator-ը հզոր սարք է, որը նախատեսված է փակ տարաներում բազմաթիվ նմուշների միաժամանակյա մշակման համար: Այն ապահովում է միասնական ուլտրաձայնային էներգիայի բաշխում և ճշգրիտ ջերմաստիճանի վերահսկում: Մինչև հինգ նմուշ միաժամանակ մշակելու ունակությունը, որը զուգորդվում է կրճատված, ալկիլացված և մարսվող աշխատանքային հոսքերի հետ համատեղելիությամբ, CupHorn-ը դարձնում է հուսալի գործիք MS-ի վրա հիմնված պրոտեոմիկայի համար:
Իմացեք ավելին CupHorn SonoReactor-ի մասին:

Քայլ առ քայլ արձանագրություն ուլտրաձայնային օգնությամբ պրոտեոլիտիկ մարսողության համար՝ օգտագործելով նանոմասնիկներով անշարժացված տրիպսին

Մարտինսի և այլքների այս արձանագրությունը: (2019) օպտիմիզացված է սպիտակուցների արագ մարսման համար՝ օգտագործելով ուլտրաձայնային էներգիան և նանոմասնիկներով անշարժացված տրիպսինը (T-FMNPs): Նշված քայլերը ապահովում են արդյունավետ նվազեցում, ալկիլացում և պրոտեոլիզ, որը հարմար է զանգվածային սպեկտրոմետրիայի (MS) կիրառությունների համար:
Արձանագրության քայլեր

1. Դիսուլֆիդային կապերի կրճատում
   • AmBic բուֆերում ավելացրեք 2 µL DTT լուծույթ (110 մՄ) 20 µL սպիտակուցի նմուշին (0,5 մգ/մլ):
   • Տեղադրեք նմուշի խողովակը UP200St-CupHorn սոնորեակտորում:
   • Նմուշը 2,5 րոպեի ընթացքում 50% ամպլիտուդով (200 Վտ, 26 կՀց) ներծծում են ձայնով:
   • Դադարեցրեք կարճ ընդմիջումով, որպեսզի սառչեք, ապա նույն պայմաններում ևս 2,5 րոպե հնչյունավորեք:
2. Նվազեցված ցիստեինի մնացորդների ալկիլացում
   • Կրճատված սպիտակուցի նմուշին ավելացրեք 2 µL IAA լուծույթ (400 մՄ):
   • Ալկիլացումը հեշտացնելու համար 2,5 րոպե 50% ամպլիտուդով քսել ձայնով:
   • Դադարեցրեք սառեցման համար, այնուհետև լրացուցիչ 2,5 րոպե հնչյունավորեք:

   Նշում. Նվազագույնի հասցրեք ալկիլացված նմուշի ազդեցությունը լույսի ներքո՝ IAA-ի քայքայումը կանխելու համար:

3. Նմուշի նոսրացում
   • Ալկիլացված սպիտակուցի նմուշը նոսրացրեք մինչև 100 µL վերջնական ծավալ՝ օգտագործելով 25 մՄ AmBic բուֆեր, որը պարունակում է 4% ացետոնիտրիլ (v/v):
   • Մանրակրկիտ խառնել՝ նուրբ խողովակով:
4. Պրոտեոլիտիկ մարսողություն նանոմասնիկների կողմից անշարժացված տրիփսինով
   • Նոսրացված սպիտակուցի նմուշին ավելացրեք 20 µL T-FMNP լուծույթ (3 մգ/մլ):
   • Խառնուրդը սոնորեակտորում 2,5 րոպեով 50% ամպլիտուդով լուծեք:
   • Դադարեցրեք սառեցման համար, այնուհետև նույն պայմաններում ևս 2,5 րոպե հնչյունավորեք:
5. Տրիպսինի նանոմասնիկների տարանջատում
   • Օգտագործեք մագնիս՝ T-FMNP-ները մարսված պեպտիդներ պարունակող վերին նյութից առանձնացնելու համար:
   • Վերցրած նյութը տեղափոխեք նոր միկրոցենտրիֆուգային խողովակի մեջ:
6. Պեպտիդային պատրաստում MS վերլուծության համար
   • Պեպտիդներ պարունակող գերնույն նյութը չորացրեք վակուումային ցենտրիֆուգայում:
   • Պահպանեք չորացրած պեպտիդները -20°C-ում մինչև զանգվածային սպեկտրաչափով հետագա վերլուծությունը: