Ուլտրաձայնային՝ ֆիլտրի օգնությամբ նմուշապատրաստում (FASP)․ պրոտեոմիկայի աշխատանքային գործընթացների բարելավում առաջադեմ ուլտրաձայնային մշակմամբ

Ուլտրաձայնային՝ ֆիլտրի օգնությամբ նմուշապատրաստումը (FASP) ժամանակակից պրոտեոմիկայում ի հայտ է գալիս որպես բարձր արդյունավետությամբ և վերարտադրելի մեթոդ։ Հաստատված FASP աշխատանքային գործընթացներում վերահսկվող ուլտրաձայնային մշակման ներդրմամբ հետազոտողները կարող են զգալիորեն բարելավել սպիտակուցների էքստրակցիան, մարսման արդյունավետությունը և տվյալների ընդհանուր որակը։ Բարձր թողունակությամբ և վերարտադրելի նմուշապատրաստման պահանջարկի աճին զուգընթաց՝ կենտրոնացված ուլտրաձայնային մշակման սարքերը, օրինակ՝ միկրոպլանշետների ուլտրաձայնային մշակման UIP400MTP սարքը, ձեռք են բերում գիտական և գործնական նշանակություն։

Գիտական համատեքստ․ ինչու է FASP մեթոդը կարևոր պրոտեոմիկայում

Ֆիլտրի օգնությամբ նմուշապատրաստումը (FASP) դարձել է ոսկե ստանդարտ «ներքևից վերև» մոտեցմամբ պրոտեոմիկայում՝ դետերգենտները, աղերը և այլ աղտոտիչները հեռացնելու և միաժամանակ արդյունավետ ֆերմենտային մարսում ապահովելու իր ունակության շնորհիվ։ Սակայն դասական FASP արձանագրությունները հաճախ բախվում են ոչ լիարժեք լիզիսի, մարսման անհամասեռության և նմուշների փոփոխականության հետ կապված սահմանափակումների՝ հատկապես բարդ կամ կայուն կենսաբանական բջիջների կամ հյուսվածքների հետ աշխատելիս։
Հենց այստեղ է կենտրոնացված ուլտրաձայնային էներգիան (ուլտրաձայնային մշակումը) վճռորոշ առավելություն ապահովում։ Առաջացնելով մեխանիկական սահքի ուժեր և կավիտացիա՝ ուլտրաձայնային մշակումը բարելավում է FASP աշխատանքային գործընթացի մի շարք առանցքային փուլեր՝ առանց խախտելու սպիտակուցների ամբողջականությունը։

Ուլտրաձայնային մշակման դրական ազդեցությունները ուլտրաձայնային FASP մեթոդում

Ուլտրաձայնային մշակումը առաջացնում է վերահսկվող ակուստիկ կավիտացիա՝ մանրադիտակային պղպջակների առաջացում և փլուզում, որն առաջացնում է տեղային սահքի ուժեր և միկրոհոսքեր։
Ուլտրաձայնային մշակումը բարելավում է ուլտրաձայնային FASP մեթոդի և՛ ալկիլացման, և՛ մարսման փուլերը՝ բարելավելով զանգվածափոխանակությունը և արագացնելով ռեակցիաների կինետիկան։ Ուլտրաձայնային էներգիայի կիրառումն առաջացնում է կավիտացիա՝ հանգեցնելով տեղային միկրոհոսքերի և անցողիկ սահքի ուժերի առաջացման, որոնք նպաստում են արագ խառնմանը և ռեագենտների արդյունավետ ներթափանցմանը սպիտակուցային մատրից կամ ֆիլտրի միջավայր։ Ալկիլացման ընթացքում սա հանգեցնում է յոդացետամիդով ցիստեինային մնացորդների ավելի համաչափ և արագ մոդիֆիկացման։ Մարսման փուլում ուլտրաձայնային մշակումը մեծացնում է պրոտեոլիտիկ տրոհման տեղամասերի հասանելիությունը և բարելավում ֆերմենտ–սուբստրատ փոխազդեցությունները՝ այդպիսով արագացնելով տրիպսինի ազդեցությունը և բարձրացնելով մարսման արդյունավետությունը։ Ընդհանուր առմամբ, ուլտրաձայնային մշակումը կրճատում է մշակման ժամանակը՝ միաժամանակ պահպանելով կամ բարելավելով ռեակցիայի լրիվությունն ու վերարտադրելիությունը։

Պրոտեոմիկայի համար նմուշապատրաստման մեջ ուլտրաձայնային FASP մեթոդն ապահովում է՝

• Բջիջների ավելի արդյունավետ քայքայում և սպիտակուցների էքստրակցիա՝ նույնիսկ ամուր հյուսվածքների կամ մանրէային նմուշների դեպքում
• Սպիտակուցների սոլյուբիլացման բարելավում
• Մարսման ընթացքում ֆերմենտների հասանելիության բարելավում
• Մշակման ժամանակի կրճատում և վերարտադրելիության բարձրացում

Ի տարբերություն լիզիսի ավանդական մեխանիկական կամ քիմիական մեթոդների՝ ուլտրաձայնային մշակումը բարձր աստիճանի վերահսկելի է և ենթակա է մասշտաբի մեծացման, ինչի շնորհիվ այն հատկապես հարմար է պրոտեոմիկայի ստանդարտացված աշխատանքային գործընթացների համար։

Ուլտրաձայնային FASP մեթոդի առավելությունները ավանդական մոտեցումների նկատմամբ

FASP արձանագրություններում ուլտրաձայնային մշակման ներդրումն ապահովում է չափելի առավելություններ, որոնք ուղղակիորեն ազդում են հետագա զանգվածային սպեկտրաչափության արդյունքների վրա։
Ուլտրաձայնային FASP մեթոդը հնարավորություն է տալիս ավելի լիարժեք վերականգնել սպիտակուցները, հատկապես դժվար մշակվող նմուշներից, օրինակ՝ թելքավոր հյուսվածքներից կամ կենսաթաղանթներից։ Էներգիայի համաչափ բաշխումն ապահովում է կրկնօրինակ նմուշների միատեսակ մշակում՝ նվազեցնելով փոփոխականությունը, ինչը քանակական պրոտեոմիկայի առանցքային պահանջներից է։
Բացի այդ, ուլտրաձայնային մշակումն արագացնում է մարսման կինետիկան՝ բարելավելով ֆերմենտ–սուբստրատ փոխազդեցությունը։ Սա հաճախ հանգեցնում է մարսման ժամանակի կրճատման և պեպտիդների ելքի բարձրացման՝ միաժամանակ պահպանելով ամինաթթվային հաջորդականության ծածկույթը։
Աշխատանքային գործընթացի տեսանկյունից՝ ուլտրաձայնային համակարգերը նվազեցնում են ձեռքով միջամտությունը և վերացնում ագրեսիվ քիմիական մշակումների անհրաժեշտությունը՝ պահպանելով նմուշի ամբողջականությունը և պարզեցնելով արձանագրության ստանդարտացումը։

Վենի դիագրամ, որը ցույց է տալիս ուլտրաձայնային FASP մեթոդով նույնականացված սպիտակուցների քանակի ավելացումը՝ գիշերվա ընթացքում իրականացվող FASP մեթոդի համեմատ
Պատկերը և հետազոտությունը՝ ©Carvalho et al., 2020

Արձանագրություն․ բարձր արտադրողականությամբ ուլտրաձայնային FASP՝ UIP400MTP սարքի կիրառմամբ

Նմուշների մեծ խմբաքանակներ մշակող լաբորատորիաների համար UIP400MTP միկրոթիթեղների ուլտրաձայնային սարքը հնարավորություն է տալիս միաժամանակ ուլտրաձայնով մշակել ստանդարտ բազմահորատիկ թիթեղները (օրինակ՝ 96 հորատիկով թիթեղները)՝ զգալիորեն բարձրացնելով նմուշների մշակման արտադրողականությունն ու վերարտադրելիությունը։
Այս ձևաչափով նմուշները (սովորաբար՝ 50–200 µL յուրաքանչյուր հորատիկում) պատրաստվում են անմիջապես այնպիսի միկրոթիթեղներում, որոնք համատեղելի են ուլտրաֆիլտրացիայի կամ հետագա մշակման հետ։ Լիզիսի բուֆերները նման են ստանդարտ FASP արձանագրություններում օգտագործվողներին։

UIP400MTP սարքը բոլոր հորատիկներին հավասարաչափ ուլտրաձայնային էներգիա է հաղորդում։ Ուլտրաձայնային մշակումը սովորաբար կատարվում է 60–80% ամպլիտուդով՝ 2–4 րոպե տևողությամբ՝ կախված նմուշի տեսակից։ Վերահսկեք ջերմաստիճանը միացվող ջերմաստիճանի տվիչի միջոցով։ Օգտագործեք իմպուլսային ուլտրաձայնային մշակում և, ըստ ցանկության, լաբորատոր սառեցնող սարք։

Արձանագրության օրինակ․

1. Ալկիլացման փուլի համար նմուշները մշակվում են միկրոթիթեղների ուլտրաձայնային սարքի (UIP400MTP) միջոցով՝ 40% ամպլիտուդով, 7 ցիկլով (30 s միացված, 15 s անջատված․ ուլտրաձայնային մշակման ընդհանուր տևողությունը՝ 5 min 45 s)։
2. Ուլտրաձայնային մշակումից հետո յոդացետամիդի (IAA) լուծույթը հեռացվում է ցենտրիֆուգմամբ։ Տրիպսինով մարսումից առաջ նմուշները պետք է լվանալ՝ մնացորդային միզանյութը հեռացնելու համար․ այն ուժեղ քաոտրոպային նյութ է, որն արգելակում է ֆերմենտային ակտիվությունը։ Ուստի նմուշները երկու անգամ լվացվում են 200 μL ծավալով 25 mM ամոնիումի բիկարբոնատի (AmBic) լուծույթով։
3. Այնուհետև ավելացվում է 12,5 mM ամոնիումի բիկարբոնատի լուծույթում պատրաստված տրիպսինի լուծույթից 100 μL (ֆերմենտի և սպիտակուցի հարաբերակցությունը՝ 1:30)։ Ապա սպիտակուցների մարսումը կատարվում է UIP400MTP սարքի միջոցով՝ ուլտրաձայնային մշակման նույն պայմաններում (40% ամպլիտուդ, 7 ցիկլ, 30 s միացված / 15 s անջատված․ ընդհանուր տևողությունը՝ 5 min 45 s)։
4. Ուլտրաձայնային մշակումից հետո նմուշները տեղափոխվում են ֆիլտրային թիթեղների մեջ կամ մշակվում թիթեղների վրա հիմնված FASP համակարգերով։ Վերականգնման և ալկիլացման փուլերը կատարվում են թիթեղի ներսում՝ պահպանելով աշխատանքի սահուն ընթացքը։
5. Տրիպսինով մարսումն իրականացվում է վերահսկվող պայմաններում (օրինակ՝ 37°C, 4–16 ժամ)՝ ֆերմենտային ակտիվությունն արագացնելու և պեպտիդների ելքը բարելավելու համար կարճատև ուլտրաձայնային խթանման հնարավորությամբ։
6. Պեպտիդներն անջատվում են ցենտրիֆուգմամբ և պատրաստ են LC-MS/MS վերլուծության համար։

Այս համակարգի հիմնական առավելությունը բոլոր հորատիկներում մշակման նույնական պայմաններ ապահովելու կարողությունն է՝ նվազագույնի հասցնելով խմբաքանակների միջև տարբերությունների ազդեցությունը և հնարավորություն տալով հուսալի քանակական համեմատություններ կատարել պրոտեոմիկայի լայնածավալ հետազոտություններում։

Նախագծում, արտադրություն և խորհրդատվություն – Գերմանիայում ստեղծված որակ

Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը հայտնի են որակի և նախագծման իրենց ամենաբարձր չափանիշներով։ Ամրությունն ու շահագործման պարզությունը թույլ են տալիս մեր ուլտրաձայնային սարքերը սահուն ներդնել արդյունաբերական արտադրամասերում։ Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը հեշտությամբ են գործում ծանր պայմաններում և բարձր պահանջներ ներկայացնող միջավայրերում։

Hielscher Ultrasonics ընկերությունն ունի ISO հավաստագրում և հատուկ ուշադրություն է դարձնում բարձր արդյունավետությամբ ուլտրաձայնային սարքերին, որոնք առանձնանում են գերժամանակակից տեխնոլոգիայով և օգտագործման հարմարավետությամբ։ Իհարկե, Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը համապատասխանում են CE նորմերին և բավարարում են UL, CSA և RoHs պահանջները։

Գրականություն / Հղումներ

FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator — Non-Contact Sonicator — Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation — English version — Hielscher Ultrasonics
• FactSheet VialTweeter — Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
• Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
• Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).