Szilárd fázisú peptidszintézis – hatékonyabban ultrahangos kezeléssel
A szilárd fázisú peptidszintézis (SPPS) a peptidszintézis szokásos módszere. Az ultrahangos kezelés megbízható eszköz a szilárd fázisú peptidszintézis intenzifikálására, amely nagyobb hozamot, jobb tisztaságot, racemizációmentességet és jelentősen gyorsabb reakciót eredményez. A Hielscher Ultrasonics különféle ultrahangos megoldásokat kínál a peptidek szintéziséhez, lehasításához és feloldásához.
Ultrahangos szilárd fázisú peptidszintézis
Az ultrahangos kezelést már széles körben alkalmazzák intenzifikáló módszerként a szerves szintézisben, és jól ismert előnyei közé tartozik a drasztikusan rövidebb reakcióidő, a nagyobb hozam, a kevesebb melléktermék, a más módon el nem érhető reakcióutak elindítása és/vagy a jobb szelektivitás. Jelentős előnyök érhetők el akkor is, ha az ultrahangos kezelést peptidszintézis-reakciókban alkalmazzák. A kutatási eredmények igazolták, hogy az ultrahanggal segített peptidszintézis rövid reakcióidő alatt, racemizáció nélkül biztosítja a nagy tisztaságú peptidek optimalizált hozamát.
- Nagy peptidhozam
- Jelentősen gyorsabb szintézis
- Nagyobb peptidtisztaság
- Nincs racemizáció
- Különféle peptidek párhuzamos szintézise
- Bármilyen térfogatra méretezhető
Ultrahangos cuphorn több reakcióedény egyenletes ultrahangos kezeléséhez, a peptidszintézis javítása érdekében.
A Merrifield-féle szilárd fázisú peptidszintézist bemutató ábra. Az ultrahangos kezelést a szintézisreakció elősegítésére és fokozására, valamint a szintetizált peptidek gyantáról történő lehasítására használják.
Ábra: ©Conejos-Sanchez et al., 2014)
| Tanulmány | Vizsgált peptid(ek) | Reakcióidő (klasszikus módszer és US-SPPS) | A nyerstermék tisztasága (klasszikus módszer és US-SPPS) | Racemizáció és mellékreakciók | Fő megállapítások |
|---|---|---|---|---|---|
| Wołczański et al. (2019) | Met-enkefalin, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH2, B2m58-69-NH2, ACP65-74-NH2, β-endorfin | 600–1920 min → 48–284 min | 24,2–71,3% → 60,6–89,9% | Cys/His esetén nem figyeltek meg ilyet, még 70°C-on sem | ~7–12-szer gyorsabb szintézis; jelentős tisztaságjavulás, különösen az aggregációra hajlamos szekvenciák, például a TAT esetében. |
| Silva et al. (2021) | Pep1 (12-mer), Pep2 (9-mer), Pep3 (25-mer) | >3515/365 min → ~250/85 min (Pep1/Pep2); Pep3: 347 min (csak US) | 73–84% → 72–82% (Pep1/Pep2) | Nem vizsgálták; a Pep2 esetében enyhe tisztaságcsökkenést észleltek | A Pep1 esetében 14-szeres időcsökkenés; a nyerstermékhozamok jelentősen növekedtek. |
| Merlino et al. (2019) | Modell-pentapeptidek, legfeljebb 44-mer peptidek, „nehéz szekvenciák” (Aβ 1-42, ACP 65-74) | 60 min → 30 min (modell) | 84% → 93% (modell); jelentősen nagyobb, mint termikus melegítés esetén (~45°C) | A Cys/His enantiomerek esetében nincs jelentős növekedés | Rendkívül hatékony a nehéz, illetve aggregációra hajlamos szekvenciák esetében; lehetővé teszi a reagensfelesleg csökkentését a nagy tisztaság fenntartása mellett. |
Ultrahanggal javított szilárd fázisú peptidszintézis
A szilárd fázisú peptidszintézis (SPPS) olyan kémiai reakció, amely lehetővé teszi egy peptidlánc felépítését aminosavszármazékok egymást követő reakcióival, oldhatatlan, porózus hordozón. A hagyományos szilárd fázisú peptidszintézis azonban viszonylag alacsony hatékonyságú és lassú folyamat. Ezért a peptidszintézis ultrahangos intenzifikálása nagyra értékelt eszköz a peptidek hatékonyabb és gyorsabb szintéziséhez.
Silva et al. (2021) a „klasszikus”, fluorenil-metoxi-karbonil (Fmoc) alapú szilárd fázisú peptidszintézist (SPPS) hasonlították össze az ultrahanggal (US) segített SPPS-sel három peptid előállítása alapján: ezek a fibroblaszt-növekedési faktor 3-as receptorára (FGFR3) specifikus Pep1 peptid (VSPPLTLGQLLS-NH2), valamint az új Pep2 (RQMATADEA-NH2) és Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2) peptidek voltak.
Az US-sel segített SPPS a „klasszikus” módszerhez képest 14-szeres (Pep1), illetve 4-szeres (Pep2) csökkenést eredményezett a peptid felépítéséhez szükséges időben. Érdekes módon az ultrahanggal segített SPPS nagyobb tisztaságú Pep1-et eredményezett (82%), mint a „klasszikus” SPPS (73%). A jelentős időcsökkenés és az elért nagy nyerspeptid-tisztaság együttesen arra ösztönözte a kutatócsoportot, hogy az US-sel segített SPPS-t a nagy méretű Pep3 peptidre is alkalmazza, amely nagyszámú hidrofób aminosavat és homooligomer szekvenciát tartalmaz. Figyelemre méltó, hogy e 25-mer peptid szintézisét kevesebb mint 6 óra (347 min) alatt sikerült megvalósítani, közepes tisztasággal (kb. 49%).
Gyorsabb peptidszintézis ultrahangos keverést alkalmazó szilárd fázisú peptidszintézissel.
(Tanulmány és elemzés: Wołczański et al., 2019)
Merlino et al. (2019) szintén átfogó vizsgálatot végeztek az ultrahang Fmoc-alapú szilárd fázisú peptidszintézisre gyakorolt hatásairól; ez különféle biológiailag aktív peptidek szintézisét tette lehetővé (legfeljebb 44-mer méretig), figyelemre méltó anyag- és reakcióidő-megtakarítással. Kimutatták, hogy az ultrahangos kezelés nem fokozta a fő mellékreakciókat, és javította a „nehéz szekvenciájú” peptidek szintézisét, így az ultrahanggal elősegített szilárd fázisú peptidszintézis (US-SPPS) a jelenlegi, nagy hatékonyságú peptidszintézis-stratégiák közé sorolható.
A peptidek ultrahangos szintéziséhez rendelkezésre álló nagy teljesítményű rendszerek lehetővé teszik a szintézis sebességének jelentős növelését és a nyerstermékek tisztaságának javítását. (Vö. Wołczański et al., 2019)
A racemizáció vizsgálata. A szobahőmérsékleten, kézzel, klasszikus eljárással, illetve emelt hőmérsékleten, ultrahangos módszerrel szintetizált modellpeptidek jellemző 1H NMR-spektrumainak összehasonlítása. A His és a Cys α-protonjainak és az Acm metiléncsoportjának kémiai eltolódásai (bal oldali panelek), valamint a Val ɣ-metil-protonjainak kémiai eltolódásai (jobb oldali panelek) azt mutatják, hogy a 70°C-on végzett ultrahangos kezelés nem okoz racemizációt.
(Tanulmány és elemzés: Wołczański et al., 2019)
Peptidek ultrahangos lehasítása
A szilárd fázisú peptidszintézis (SPPS) után a szintetizált peptideket le kell hasítani a polimer gyantákról. Ezt a lépést védőcsoport-eltávolításnak is nevezik. A peptidek gyantáról történő lehasítására alkalmazott szokásos rázatás és ultrahangos kezelés összehasonlításakor a rázatásos módszer kb. 1 órát igényel, míg az ultrahangos lehasítás 15–20 min alatt elvégezhető. Az ultrahangos peptidlehasítás alkalmazható a polisztirolgyantákhoz benzil-észter-kötésekkel kapcsolódó védett aminosavak és peptidek lehasítására.
A peptidek polisztirolgyantáról történő ultrahangos lehasítása gyors eljárással, racemizáció nélkül biztosít nagy hozamot és nagy tisztaságú peptideket.
(Tanulmány és ábra: ©Anuradha és Ravindranath, 1995)
Ultrahanggal kevert reaktor a peptidszintézis javításához és felgyorsításához. A képen az UP200St ultrahangos készülék látható egy kevert üvegreaktorban.
Nagy teljesítményű ultrahangos készülékek peptidszintézishez
A Hielscher Ultrasonics különféle ultrahangos megoldásokat kínál közvetlen és közvetett ultrahangos kezeléshez. A nagy teljesítményű és precízen szabályozható ultrahangos processzorok pontosan a megfelelő mennyiségű ultrahangenergiát juttatják a reakcióedénybe. Akár fecskendőket, csöveket, többlyukú lemezeket vagy üvegreaktorokat használ szintézisedényként, a Hielscher Ultrasonics a peptidalkalmazásához leginkább megfelelő ultrahangos készüléket kínálja.
- egyedi peptidek szintézise
- nagyüzemi peptidgyártás
- peptidkönyvtárak szintézise
Számos peptidszintézist fecskendőkben végeznek (például szűrőfrittes fecskendőreaktorokban). A Hielscher ultrahangos fecskendőkeverője úgy kezeli ultrahanggal a peptidoldatot, hogy az ultrahanghullámokat a fecskendő falán keresztül csatolja be a folyadékba. Az ultrahangos fecskendőkeverő az egyik legnépszerűbb ultrahangos megoldás az ultrahanggal segített peptidszintézishez.
Az ultrahangos cuphorn alkalmas legfeljebb 5 reakcióedény ultrahangos kezelésére, míg a VialTweeter legfeljebb tíz reakciócsövet, továbbá egy rácsíptethető tartozékkal további öt nagyobb edényt is képes befogadni.
Más reaktortípusokhoz, például a Merrifield- vagy Kamysz-féle szilárd fázisú reaktorokhoz, valamint más polipropilén- vagy boroszilikát edényekhez és reaktorokhoz a Hielscher egyedi rácsíptethető rögzítéssel vagy karimával ellátott ultrahangos készülékeket kínál közvetett és közvetlen ultrahangos kezeléshez.
Természetesen a nagyobb, kevert üvegreaktorok, például az oldatfázisú szintézishez használt reaktorok, is könnyen felszerelhetők bármilyen méretű ultrahangos szondákkal (más néven szonotródákkal vagy ultrahangos kürtökkel).
- különféle ultrahangos készüléktípusok
- közvetlen és közvetett ultrahangos kezelés
- pontos intenzitásszabályozás
- pontos hőmérséklet-szabályozás
- folyamatos vagy impulzusos ultrahang
- intelligens funkciók, programozható készülékek
- bármilyen térfogathoz elérhető
- lineáris méretnövelhetőség
A többlyukú lemezekben, illetve mikrotiterlemezekben végzett szilárd fázisú peptidszintézishez az UIP400MTP az ideális készülék. Az ultrahangos kavitáció közvetett módon, egyenletesen csatolódik be a számos mintamélyedésbe, így kiváló anyagátadást és szintézisreakciót biztosít. Nézze meg az alábbi videóban az UIP400MTP mikrolemez-kezelő ultrahangos készüléket működés közben!
Lépjen kapcsolatba velünk! / Kérdezzen tőlünk!
A Hielscher Ultrasonics nagy teljesítményű ultrahangos homogenizátorokat gyárt keveréshez, diszpergáláshoz, emulgeáláshoz és extrakcióhoz, laboratóriumi, félüzemi és ipari léptékben.
Tudnivalók az ultrahangos peptidszintézisről
Mik a peptidek?
A peptidek olyan vegyületek, amelyekben több aminosav amidkötésekkel, úgynevezett peptidkötésekkel kapcsolódik egymáshoz. Ha összetett – jellemzően 50 vagy több aminosavból álló – szerkezetekbe kapcsolódnak, ezeket a nagy peptidszerkezeteket fehérjéknek nevezik. A peptidek az élet alapvető építőelemei, és számos funkciót látnak el a szervezetben.
Hogyan működik a peptidszintézis?
A szerves kémiában, a molekuláris biológiában és az élettudományokban a peptidszintézis a peptidek előállításának folyamata. A peptideket kémiai úton, az egyik aminosav karboxilcsoportja és egy másik aminosav aminocsoportja közötti kondenzációs reakcióval szintetizálják. Általában védőcsoport-stratégiákat alkalmaznak, hogy elkerüljék a különféle aminosav-oldalláncokkal végbemenő nemkívánatos mellékreakciókat.
A kémiai (in-vitro) peptidszintézis leggyakrabban azzal kezdődik, hogy a beépülő aminosav karboxilcsoportját (C-terminusát) a növekvő peptidlánc N-terminusához kapcsolják. Ezzel a C→N irányú szintézissel ellentétben az élő szervezetekben a hosszú peptidek természetes fehérje-bioszintézise ellenkező irányban zajlik. Ez azt jelenti, hogy a bioszintézis során a beépülő aminosav N-terminusa kapcsolódik a fehérjelánc C-terminusához (N→C).
A peptidszintézishez használt legtöbb kutatási és fejlesztési protokoll szilárd fázisú módszereken alapul, míg az oldatfázisú szintézismódszereket a peptidek nagyüzemi ipari előállításában alkalmazzák.
Mi a peptidszintézis jelenlegi legkorszerűbb technológiája?
SUS-SPPS (fenntartható, ultrahanggal segített SPPS) esetében kimutatták, hogy a folyamat ciklusonként mindössze két lépésre csökkenthető (kombinált kapcsolás/lezárás/védőcsoport-eltávolítás + egyetlen mosás), ami jelentősen csökkenti az oldószerfelhasználást és az időigényt. (Vö. Mottola et al., 2025)
Az ultrahanggal segített TAPS olyan kibontakozó kombináció, amelynek sikerességét teljes szintézisekben már igazolták (például lipobactin esetében), és amelyet szerződéses fejlesztő és gyártó szervezetek (CDMO-k) vizsgálnak gyógyszerhatóanyagok (API-k) gyártására.
Fedezze fel az ultrahanggal segített TAGGING peptidszintézis előnyeit!
A folyamatos feldolgozást további fejlesztési lehetőségként vizsgálják – már leírtak szililezett jelölőcsoporttal segített, folyamatos, egyedényes szintézisplatformokat.
A szakterület a zöld kémia elvei felé halad: mind az ultrahang, mind a TAPS hozzájárul a kisebb oldószerfelhasználáshoz, az alacsonyabb reagensadagoláshoz és a jobb fenntarthatósághoz.
Szakirodalom / Hivatkozások
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
- Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.
A Hielscher Ultrasonics nagy teljesítményű ultrahangos homogenizátorokat gyárt a laboratóriumi mérettől az ipari méretig.