Amiloidfibrillumok képződése a mikrolemezek ultrahangos kezelésére szolgáló UIP400MTP berendezéssel

Az amiloidfibrillumok a kristályokhoz hasonlóan magképződéssel és azt követő növekedéssel keletkeznek. A magképződés magas szabadenergia-gátja miatt azonban az amiloidfibrillumok spontán képződése csak hosszú késleltetési fázis után következik be. Az ultrahangos kezelés az amiloid-magképződés kiváltásának hatékony eszközévé vált, ezáltal jelentősen felgyorsítva a fibrillumképződést. A tioflavin T (ThT) fluoreszcenciáját mérő mikrolemez-leolvasóval kombinálva az ultrahangos kezelés lehetővé teszi az amiloidfibrillumok nagy áteresztőképességű kimutatását egyidejűleg több mintában.

Ultrahanggal kiváltott amiloidfibrillum-képződés a mikrolemezek ultrahangos kezelésére szolgáló UIP400MTP berendezéssel

A többlyukú lemezek ultrahangos kezelésére szolgáló UIP400MTP berendezéssel kutatási célokra gyorsan, nagy mennyiségben szintetizálhatók azonos minőségű amiloidfibrillumok. Ez a hatékony megközelítés lehetővé teszi a fehérjék amiloidképző hajlamának vizsgálatát. Ez a technika elősegíti a gyors és reprodukálható amiloidfibrillum-képződést, amint azt a dialízishez kapcsolódó amiloidózissal összefüggő amiloidképző fehérje, a β2-mikroglobulin (β2-m) esetében bemutatták.

Egyszerű kísérleti megközelítés: ultrahanggal kiváltott amiloidfibrillum-képződés

A fibrillumképződés kiváltásához egy 96 lyukú mikrolemezt helyeztek a többlyukú lemezek ultrahangos kezelésére szolgáló UIP400MTP berendezés közepére, amely minden lyukban egyenletes ultrahanghatást biztosít. A kísérleti körülmények a következők voltak:

Minden lyuk 0,2 ml β2-mikroglobulin-oldatot (0,3 mg/ml, pH 2,5) tartalmazott, 5 μM ThT-vel kiegészítve.
A lemezt ultrahangos kezelési ciklusoknak vetették alá, például 1 perces ultrahangos kezelésnek, amelyet 9 perces szünet követett.
Az ultrahangos kezelés után a ThT fluoreszcenciáját mikrolemez-leolvasóval mérték.

(vö. So et al., 2011)

A Hielscher UIP400MTP a legsokoldalúbban használható ultrahangos kezelőkészülék többüregű lemezekhez, PCR-lemezekhez és mintacsövekhez. 400 watt folyamatos ultrahangos kimenőteljesítményével olyan alkalmazásokra készült, mint a sejtlízis, az emulgeálás, a fehérjekivonás, a DNS / RNS fragmentálása, a deagglomerálás, az FFPE-extrakció, a sejtek és biofilmek leválasztása vagy az emulgeálás. Az UIP400MTP nem ultrahangos fürdő, hanem nagy intenzitású, csésze alakú szonotróddal működő készülék célzott ultrahangos kezeléshez. Ez a nagy teljesítményű, érintésmentes készülék egyenletes ultrahangos kezelést biztosít a szabványos mikrolemez minden üregében. Az amplitúdó, a teljesítmény és az impulzusüzem pontosan szabályozható. A beépített időzítő és hőmérséklet-érzékelő egyenletes eredményeket biztosít. Az UIP400MTP lemezkezelő készülék vízfürdővel hűti a mintákat, opcionálisan külső hűtőberendezéssel.

Összehasonlítás a hagyományos rázatással

A hagyományos rázatási módszerekhez képest az ultrahangos kezelés drasztikusan lerövidítette a fibrillumképződés késleltetési fázisát. Hagyományos mikrolemez-rázatási körülmények között 20 óra elteltével 10 lyukból csak 1-ben mutatkozott fokozott ThT-fluoreszcencia. Ezzel szemben ciklikus ultrahangos kezelés alkalmazásakor (15 perc ultrahangos kezelés, majd 5 perc nyugalmi szakasz) közvetlenül az első ultrahangos kezelés után jelentős ThT-fluoreszcencia-növekedést észleltek.

A fibrillumképződés kinetikájának gyors felgyorsítása

So et al. (2011) eredményei azt mutatták, hogy a β2-mikroglobulin spontán fibrillumképződése pH 2,5 mellett ultrahangos kezeléssel több óráról mindössze 10–15 percre gyorsítható fel.
Az atomerő-mikroszkópos (AFM) felvételek megerősítették, hogy a 15 percenként alkalmazott 10 perces ultrahangos kezeléssel létrehozott fibrillumok morfológiailag megkülönböztethetetlenek voltak a 10 percenként alkalmazott 1 perces ultrahangos kezeléssel képződött fibrillumoktól. Ez kiemeli az ultrahanggal kiváltott amiloidfibrillum-képződés reprodukálhatóságát és robusztusságát.

A többlyukú lemezek ultrahangos kezelésére szolgáló UIP400MTP berendezés ultrahangos magképződéssel gyorsítja fel az amiloidfibrillumok képződését

A 10 min-enként alkalmazott 1 min-es ultrahangos kezeléssel (i), a 15 min-enként alkalmazott 10 min-es ultrahangos kezeléssel (ii), valamint ultrahangos kezelés nélküli magképzőmag-hozzáadási reakcióval (iii) előállított amiloidfibrillumok AFM-felvételei. A fehér méretarányjelző 1 μm-t jelöl.
Tanulmány és képek: ©So et al., 2011

Fibrillumképződés semleges pH mellett

Még semleges pH mellett is sikerült fibrillumképződést elérni 1,5 órás késleltetési idő után, ami azt mutatja, hogy az ultrahangos kezelés jelentősen csökkenti a magképződés és a növekedés energiagátját. Ez tovább erősíti azt a hipotézist, hogy az amiloidfibrillum-képződés elsősorban fizikai reakció, amelyet nagyrészt a magképződés energiagátja korlátoz, és ezt az ultrahangos kezelés hatékonyan csökkenti.

Hatás az amiloiddal összefüggő betegségek kutatására

Az amiloidfibrillumok egyszerű és megbízható létrehozása a mikrolemezek ultrahangos kezelésére szolgáló UIP400MTP berendezéssel jelentős hatással lehet az Alzheimer-kór (AD) és más, amiloiddal összefüggő betegségek, például a Parkinson-kór, a II. típusú cukorbetegség és a szisztémás amiloidózisok kutatására. AD esetén az amiloid-β (Aβ) aggregációja kulcsfontosságú patológiai ismertetőjegy, fibrillumképződési kinetikájának vizsgálata azonban továbbra is nehézségekbe ütközik a hagyományos módszerek hosszú késleltetési fázisai és változékonysága miatt. Az ultrahangos kezeléssel előidézett fibrillumképződés felgyorsítja a magképződést, nagyfokú reprodukálhatóságot és csökkent változékonyságot biztosítva, ami döntő fontosságú a potenciális inhibitorok szűréséhez és az amiloidképző mechanizmusok megértéséhez. Ezenkívül a UIP400MTP nagy áteresztőképessége lehetővé teszi a fehérjék hibás feltekeredésének és aggregációjának nagyszabású vizsgálatát, elősegítve olyan terápiás szerek felfedezését, amelyek képesek módosítani a fibrillumképződést, és potenciálisan mérsékelhetik a neurodegeneratív folyamatok előrehaladását.

Ez a tanulmány igazolja, hogy a többlyukú lemezek ultrahangos kezelésére szolgáló UIP400MTP berendezéssel végzett ultrahangos kezelés rendkívül hatékony módszer az amiloidfibrillum-képződés felgyorsítására. A megközelítés fő előnyei a következők:

A fibrillumképződés késleltetési idejének drámai csökkenése.
Egyenletes ultrahanghatás minden lyukban, ami lehetővé teszi a reprodukálható fibrillumképződést.
Nagy áteresztőképességű szűrési lehetőség, amely alkalmassá teszi a módszert a fehérjék amiloidképző hajlamának teljes genomra kiterjedő keresésére.

Az ultrahangos kezelés és a ThT-fluoreszcencia kimutatásának integrálásával ez a módszer gyors, skálázható és megbízható platformot biztosít az amiloidfibrillum-képződés vizsgálatához. Hatékonysága és nagy áteresztőképességének lehetősége révén ez a megközelítés elősegítheti az amiloidfibrillumok egyszerű szintézisét biofizikai és gyógyszerészeti kutatásokhoz, ígéretes eszközt kínálva az amiloiddal kapcsolatos vizsgálatokhoz és a gyógyszerszűréshez.

Kapcsolódó témák

Szakirodalom / Hivatkozások

FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
Masatomo So, Hisashi Yagi, Kazumasa Sakurai, Hirotsugu Ogi, Hironobu Naiki, Yuji Goto (2011): Ultrasonication-Dependent Acceleration of Amyloid Fibril Formation. Journal of Molecular Biology, Volume 412, Issue 4, 2011. 568-577.
Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.

Gyakran ismételt kérdések

Mi az amiloid elsődleges magképződése?

Az amiloid elsődleges magképződése az amiloidfibrillum-képződés kezdeti, sebességmeghatározó lépése, amelynek során a monomer fehérjék konformációváltozásokon mennek keresztül, és önszerveződéssel kritikus maggá állnak össze. Ez a mag a további aggregáció sablonjaként szolgál.

Hogyan képződik fibrillum amiloidózisban?

Amiloidózisban a hibásan feltekeredett fehérjék magképződéstől függő polimerizáció révén aggregálódnak. Amint kialakul egy mag, a monomerek másodlagos magképződés és sablonvezérelt növekedés révén gyorsan β-redőkben gazdag fibrillumokká hosszabbodnak, ami amiloidlerakódásokhoz vezet.

Mi az amiloidfibrillumok polimorfizmusa?

Az amiloidfibrillumok polimorfizmusa az azonos fehérjéből képződő fibrillumok szerkezeti változatosságát jelenti. A fibrillumok morfológiájában, a protofilamentumok elrendeződésében és a molekulák térbeli rendeződésében mutatkozó különbségek a környezeti feltételek, mutációk vagy eltérő aggregációs útvonalak következtében alakulnak ki.

Mi a különbség az amiloidfibrillumok és a plakkok között?

Az amiloidfibrillumok lineáris, β-redőkben gazdag fehérjeaggregátumok, míg az amiloidplakkok aggregálódott fibrillumok sejten kívüli lerakódásai, amelyek gyakran lipidekkel, fémekkel és sejttörmelékkel keverednek, ahogyan az olyan neurodegeneratív betegségekben megfigyelhető, mint az Alzheimer-kór.

Mi a különbség az alfa-szinuklein és az amiloid között?

Az alfa-szinuklein a szinaptikus működésben részt vevő idegsejti fehérje, kóros körülmények között azonban hibásan tekeredik fel, és amiloidszerű fibrillumokat képez. Az „amiloid” a hibásan feltekeredett, fibrilláris fehérjeaggregátumok általános elnevezése, míg az alfa-szinuklein-fibrillumok olyan betegségekre jellemzőek, mint a Parkinson-kór.

Mi a fehérjefibrillum?

A fehérjefibrillum hibásan feltekeredett vagy részlegesen kitekeredett fehérjékből képződő, nagyfokú rendezettségű, β-redőkben gazdag, fonalszerű aggregátum. Ezek a fibrillumok jellemzően oldhatatlanok, és magképződéstől függő polimerizáció révén keletkeznek. Különböző kóros állapotokkal állnak összefüggésben, köztük amiloidózisokkal és neurodegeneratív betegségekkel (pl. Alzheimer-kór, Parkinson-kór). Biológiai rendszerekben azonban funkcionális fehérjefibrillumok is léteznek, például a baktériumok curli rostjai és a pókok selyemfibrillumai.