Amiloid fibrillák képződése a UIP400MTP mikrolemezes ultrahangos készülékkel

Az amiloid fibrillák, hasonlóan a kristályokhoz, a nukleáció és az azt követő növekedés folyamata során alakulnak ki. A nukleáció magas szabad energiájú gátja miatt azonban a spontán amiloid fibrillák képződése csak hosszan tartó késleltetési fázis után következik be. Az ultrahangos kezelés hatékony eszközként jelent meg az amiloid nukleáció kiváltására, ezáltal jelentősen felgyorsítva a fibrillák képződését. A tioflavin T (ThT) fluoreszcenciát használó mikrolemez-olvasóval kombinálva az ultrahangos kezelés lehetővé teszi az amiloid fibrillák nagy áteresztőképességű kimutatását egyszerre több mintában.

Ultrahanggal indukált amiloid fibrillák képződése a UIP400MTP mikrolemez ultrahangos készülékkel

A UIP400MTP többlyukú lemezes ultrahangos készülékkel az azonos minőségű, nagy mennyiségben lévő amiloid fibrillák gyorsan szintetizálhatók kutatási célokra. Ez a hatékony megközelítés lehetővé teszi a fehérje amiloidogenitásának tanulmányozását. Ez a technika elősegíti a gyors és reprodukálható amiloid fibrillációt, amint azt a dialízissel összefüggő amiloidózissal társuló amiloidogén fehérje, a β2-mikroglobulin (β2-m) bizonyítja.

Egyszerű kísérleti megközelítés: ultrahanggal kiváltott amiloid fibrilláció

A fibrillák kialakulásának kiváltása érdekében egy 96 lyukú mikrolemezt helyeztek a UIP400MTP többlyukú lemezes ultrahangos ultrahangos ultrahangos készülék közepére, amely biztosítja az egyenletes ultrahangos expozíciót minden kútban. A kísérleti körülmények a következők voltak:

1. Mindegyik lyuk 0,2 ml β2-mikroglobulin oldatot (0,3 mg/ml, pH 2,5) tartalmazott, 5 μM ThT-vel kiegészítve.
2. A lemezt ultrahangos ciklusoknak vetették alá, például 1 perces ultrahangos kezelésnek, majd 9 perc szünetnek.
3. Az ultrahangos kezelés után a ThT fluoreszcenciát mikrolemez-olvasóval mértük.

(vö. So et al., 2011)

Összehasonlítás a hagyományos keveréssel

A hagyományos keverési módszerekhez képest az ultrahangos kezelés drasztikusan csökkentette a fibrillák képződésének késleltetési fázisát. Hagyományos mikrolemez-rázási körülmények között 10 lyukból csak 1 mutatott megnövekedett ThT-fluoreszcenciát 20 óra elteltével. Ezzel szemben a ciklusos ultrahangos kezeléssel (15 perc ultrahangos kezelés, majd 5 perc nyugalom) az első ultrahangos kezelés után közvetlenül a ThT fluoreszcencia jelentős növekedését észlelték.

A fibrillációs kinetika gyors gyorsulása

A So et al. (2011) kimutatta, hogy a β2-mikroglobulin spontán fibrillák képződése pH-n 2,5 órán keresztül felgyorsítható ultrahangos kezeléssel.
Az atomerő-mikroszkópos (AFM) képek megerősítették, hogy a 10 percenként 15 perces ultrahangos kezeléssel generált fibrillák morfológiailag megkülönböztethetetlenek a 10 percenként 1 perces ultrahangos kezeléssel kialakult fibrilláktól. Ez kiemeli az ultrahanggal kiváltott amiloid fibrilláció reprodukálhatóságát és robusztusságát.

Az amiloid fibrillák AFM képei 1 perces ultrahangos kezeléssel 10 percenként (i), 10 perces ultrahangos kezeléssel 15 percenként (ii) és az ultrahangos vetési reakcióval (iii). A fehér skálasáv 1 μm-t jelent.
Tanulmány és képek: ©So et al., 2011

Fibrilláció semleges pH-viszonyok között

Még semleges pH-körülmények között is 1,5 órás késleltetés után alakult ki a fibrillák képződése, ami azt mutatja, hogy az ultrahangos kezelés jelentősen csökkenti a nukleáció és a növekedés energetikai gátját. Ez tovább támasztja azt a hipotézist, hogy az amiloid fibrilláció elsősorban fizikai reakció, amelyet nagyrészt korlátoz a nukleációs energiagát, amelyet az ultrahangos kezelés hatékonyan csökkent.

Hatás az amiloiddal kapcsolatos betegségek kutatására

Az amiloid fibrillák könnyű és megbízható képződése a UIP400MTP mikrolemezes ultrahangos készülékkel jelentős következményekkel jár az Alzheimer-kór (AD) kutatására és más amiloiddal kapcsolatos rendellenességekre, például a Parkinson-kórra, a II. típusú cukorbetegségre és a szisztémás amiloidózisokra. Alzheimer-kórban az amiloid-β (Aβ) aggregáció kulcsfontosságú kóros jellemző, de a fibrillációs kinetika tanulmányozása továbbra is kihívást jelent a hosszú késleltetési fázisok és a hagyományos módszerek változékonysága miatt. Az ultrahangos kezelés által vezérelt fibrillák képződése felgyorsítja a nukleációt, biztosítva a magas reprodukálhatóságot és a csökkentett variabilitást, ami kulcsfontosságú a potenciális inhibitorok szűréséhez és az amiloid mechanizmusok megértéséhez. Ezenkívül a UIP400MTP nagy áteresztőképessége lehetővé teszi a fehérjék hibás feltekeredésének és aggregációjának nagyszabású vizsgálatát, megkönnyítve olyan terápiás szerek felfedezését, amelyek modulálhatják a fibrillák képződését és potenciálisan enyhíthetik a neurodegeneratív progressziót.

Ez a tanulmány az ultrahangos kezelést a UIP400MTP többlyukú lemezes ultrahangos készülékkel hozza létre, mint rendkívül hatékony módszert az amiloid fibrillák képződésének felgyorsítására. Ennek a megközelítésnek a legfontosabb előnyei a következők:

• A fibrilláció késleltetési idejének drámai csökkenése.
• Egyenletes ultrahang expozíció minden kútban, lehetővé téve a reprodukálható fibrillák képződését.
• Nagy áteresztőképességű szűrési képesség, így alkalmas a fehérje amiloidogenitás genomszintű kutatására.

Az ultrahangos kezelés és a ThT fluoreszcencia detektálás integrálásával ez a módszer gyors, skálázható és megbízható platformot biztosít az amiloid fibrilláció tanulmányozásához. Hatékonysága és nagy áteresztőképességi potenciálja miatt ez a megközelítés megkönnyítheti az amiloid fibrillák egyszerű szintézisét a biofizikai és gyógyszerészeti kutatásokhoz, ígéretes eszközt kínálva az amiloiddal kapcsolatos vizsgálatokhoz és a gyógyszerszűréshez.