शॉटगन प्रोटिओमिक्स में माइक्रोप्लेट सोनिकेशन – एप्लिकेशन नोट

शॉटगन प्रोटिओमिक्स जटिल जैविक सामग्री को एलसी-एमएस/एमएस-रेडी पेप्टाइड्स में परिवर्तित करने के लिए कुशल, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य नमूना तैयार करने पर निर्भर करता है। UIP400MTP माइक्रोप्लेट सोनिकेटर छोटी मात्रा के नमूनों के मानकीकृत, समानांतर सोनिकेशन को सक्षम करके इस प्रक्रिया का समर्थन करता है, जिससे प्रयोगशालाओं को माइक्रोप्लेट-आधारित वर्कफ़्लो में व्यवधान, निष्कर्षण और रिसोल्यूबिलाइजेशन में सुधार करने में मदद मिलती है। यह एप्लिकेशन नोट बताता है कि प्रयोगशाला-परीक्षण किए गए उदाहरण के रूप में PLA2G12A/Th17 अध्ययनों से प्रकाशित एक्स्ट्रासेल्युलर-वेसिकल वर्कफ़्लो का उपयोग करके UIP400MTP को प्रोटिओमिक नमूना तैयार करने में कैसे एकीकृत किया जा सकता है।

अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य शॉटगन प्रोटिओमिक्स के लिए माइक्रोप्लेट सोनिकेशन

प्रोटीओमिक्स शोधकर्ताओं के लिए, उच्च-गुणवत्ता वाले LC-MS/MS डेटा के लिए पुनरुत्पादन योग्य सैंपल तैयारी अत्यंत महत्वपूर्ण है। UIP400MTP माइक्रोप्लेट सोनिकेटर प्लेट-आधारित और छोटे-आयतन/उच्च-थ्रूपुट कार्यप्रवाहों में मानकीकृत, समानांतर सोनिकेशन का समर्थन करता है।

यह विशेष रूप से उन प्रयोगशालाओं के लिए उपयोगी है जो काम करती हैं:

• बड़े सैंपल सेट जिनमें कई वेल्स में सुसंगत प्रोसेसिंग की आवश्यकता होती है
• सीमित इनपुट सामग्री, जहां सैंपल हानि और असंगति को न्यूनतम करना आवश्यक है
• लिपिड-समृद्ध सैंपल, जैसे बाह्य कोशिकीय वेसिकल्स
• जटिल जैविक तैयारियाँ जिनमें कुशल विघटन, निष्कर्षण या पुनः घुलन आवश्यक होता है
• तुलनात्मक शॉटगन प्रोटीओमिक्स, जहां स्थितियों और प्रतिकृतियों में पुनरुत्पादनशीलता अनिवार्य है

पाचन से पहले माइक्रोप्लेट सोनिकेशन को एकीकृत करके, शोधकर्ता सैंपल तैयारियों में सुधार कर सकते हैं:

• प्रोटीन निष्कर्षण और पुनः घुलन
• ट्रिप्सिन/लाइस-सी पाचन
• नैनो-LC/MS/MS अधिग्रहण
• मात्रात्मक डाउनस्ट्रीम प्रोटिओमिक्स विश्लेषण

 

पूरी तरह से आत्मविश्वास के साथ अपने प्रोटिओमिक्स सैंपल तैयारी को स्केल करें!
जानें कि माइक्रोप्लेट सोनिकेशन कैसे मैनुअल वेरिएबिलिटी को कम करने, सैम्पल विघटन में सुधार करने, और विश्वसनीय LC-MS/MS विश्लेषण के लिए जटिल जैविक नमूनों को तैयार करने में मदद करता है।

सूचना अनुरोध


ईमेल पता (आवश्यक)


उत्पाद या रुचि का क्षेत्र



मैं गोपनीयता नीति से सहमत हूं









जानकारी का अनुरोध करें

माइक्रोप्लेट सोनिकेशन से लाभ हो सकते हैं:

• प्रोटिओमिक्स कोर सुविधाएँ
• EV अनुसंधान प्रयोगशालाएँ
• इम्यूनोलॉजी और सेल-बायोलॉजी लैब्स
• अनुवादनीय अनुसंधान समूह
• लाइफ-सायन्स टीम्स जो एकल-सैंपल तैयारी से उच्च-थ्रूपुट वर्कफ़्लो तक स्केल कर रही हैं

एक्स्ट्रासेलुलर वेसिकल प्रोटियोम विश्लेषण के लिए उच्च-थ्रूपुट सैम्पल तैयारी

शॉटगन प्रोटियोमिक्स क्या है?

Shotgun proteomics has become a central analytical strategy for characterizing complex biological samples, from whole-cell lysates and tissue extracts to purified organelles, extracellular vesicles, and low-input clinical specimens. Its core strength lies in the coupling of protein digestion, high-resolution liquid chromatography-tandem mass spectrometry, and computational peptide-to-protein inference. However, the quality of the final proteome dataset is determined long before the sample reaches the mass spectrometer. Efficient sample disruption, protein solubilization, removal of interfering substances, reproducible enzymatic digestion, and robust peptide recovery are all decisive for depth of coverage and quantitative reliability.
सीमित या कीमती नमूनों के साथ काम करने वाले प्रोटिओमिक्स शोधकर्ताओं और जीवन-विज्ञान प्रयोगशालाओं के लिए, नमूना तैयार करना अक्सर अड़चन होती है।

प्रोटिओमिक्स में बाह्य पुटिकाओं की चुनौती

Extracellular vesicles (EVs), for example, represent a particularly demanding sample class. They are membrane-bound, lipid-rich, nanoscale particles with relatively low protein yield and a high potential for carry-over of lipids, salts, detergents, serum proteins, and other matrix components. These features can interfere with digestion efficiency, chromatographic performance, electrospray stability, and peptide identification. A preparation workflow for EV proteomics must therefore be strong enough to disrupt vesicle structures and solubilize protein cargo, while remaining compatible with downstream enzymatic digestion and LC-MS/MS analysis.
इस संदर्भ में, माइक्रोप्लेट-उपयुक्त अल्ट्रासोनिकेशन पुनरुत्पादक, समानांतर नमूना संसाधन के लिए एक व्यावहारिक दृष्टिकोण प्रदान करता है। Hielscher माइक्रोप्लेट सोनिकेटर मॉडल UIP400MTP (400 W) और UIP550MTP (550 W) बहु-वेल प्लेटों और छोटे आयतन वाले पात्रों में नमूनों के सोनिकेशन के लिए डिज़ाइन किए गए हैं, जो पारंपरिक सिंगल-प्रोब सोनिकेटरों की तुलना में उच्च थ्रूपुट वर्कफ़्लो का समर्थन करते हैं। प्रोटिओमिक्स प्रयोगशालाओं के लिए, यह प्रारूप आकर्षक है क्योंकि यह हाथों से होने वाले भिन्नता को कम कर सकता है, कई नमूनों के समानांतर उपचार में सुधार कर सकता है, और प्लेट-आधारित नमूना तैयारी पाइपलाइनों में अधिक प्राकृतिक रूप से एकीकृत हो सकता है।

उदाहरणात्मक वर्कफ़्लो

A recent extracellular vesicle proteomics workflow in PLA2G12A-driven Th17-cell biology provides a useful, lab-tested example of how the microplate sonicator UIP400MTP can be incorporated into shotgun proteomics sample preparation. In that study series, EV samples were processed for proteome analysis using methanol treatment, UIP400MTP sonication, centrifugation, drying, trypsin/Lys-C digestion, and nano-flow LC-high-resolution tandem MS. The same biological work was first reported as a bioRxiv preprint and subsequently published in Cell Reports, where the proteomics analysis helped characterize how PLA2G12A alters EV cargo proteins in the context of pathogenic T-cell responses.

मल्टी-वेल प्लेट सोनिकेटर UIP400MTP

Why microplate sonication?
UIP400MTP छोटे-आयतन नमूनों के मानकीकृत, समानांतर सोनिकेशन की सुविधा प्रदान करता है। यह तब उपयोगी होता है जब पुनरुत्पादनशीलता, कम नमूना इनपुट, और बहु-नमूना थ्रूपुट महत्वपूर्ण होते हैं।


गुणवत्ता नियंत्रण चेकलिस्ट

• सभी नमूनों में समान EV प्रोटीन-समतुल्य इनपुट की पुष्टि करें।
• यादृच्छिक या संतुलित नमूना प्रसंस्करण लेआउट का उपयोग करें।
• मेथानॉल की मात्रा, सोनिकेशन समय, सुखाने का समय, और पाचन मात्रा को स्थिर रखें।
• पेप्टाइड की उपज और कुल प्रोटीन पहचान की निगरानी करें।
• मिस्ड-क्लीवेज दर और पेप्टाइड लंबाई वितरण की जाँच करें।
• क्रोमैटोग्राफिक पीक आकार और रिटेंशन-टाइम पुनरुत्पादकता का निरीक्षण करें।
• कैरीओवर की निगरानी के लिए खाली नमूने शामिल करें।
• बड़े अध्ययन के लिए पूल किए गए QC नमूनों का उपयोग करें।
• प्रतिलिपि सहगुणांक का मूल्यांकन करें।
• बैच प्रभाव या अपूर्ण नमूनों की पहचान के लिए PCA या संबंधित विधियों का उपयोग करें।

प्रोटोकॉल सिफारिशें

इस वर्कफ़्लो को प्रकाशित या दस्तावेज़ बनाते समय, UIP400MTP के EV इनपुट मात्रा, प्लेट प्रारूप, मेथनॉल मात्रा, एम्पलीट्यूड और सोनिकेशन समय, विश्लेषण अवस्थाएँ, सुखाने की विधि, पाचन बफर, एंज़ाइम सांद्रता, पाचन समय, अम्लीकरण की शर्तें, LC-MS/MS प्लेटफ़ॉर्म, अधिग्रहण मोड, सॉफ़्टवेयर संस्करण, डेटाबेस, FDR थ्रेशोल्ड, सामान्यीकरण विधि, और सांख्यिकीय वर्कफ़्लो की रिपोर्ट करें।
सभी Hielscher माइक्रोप्लेट सोनिकेटर स्वचालित रूप से महत्वपूर्ण प्रक्रिया मानकों जैसे कि एम्पलीट्यूड, सोनिकेशन अवधि और तापमान को दिनांक और समय स्टैंप के साथ एक CVS फ़ाइल के रूप में इंटीग्रेटेड SD-कार्ड पर रिकॉर्ड करते हैं। पुनरुत्पादकता और गुणवत्ता नियंत्रण के लिए डेटा प्रोटोकॉलिंग कभी भी इतनी आसान नहीं थी!

विस्तृत अध्ययन: PLA2G12A अध्ययन में EV शॉटगन प्रोटियोमिक्स

The PLA2G12A study provides a concrete example of UIP400MTP use in a shotgun proteomics workflow. The biological question was how the secreted phospholipase PLA2G12A modifies Th17-cell-derived extracellular vesicles and thereby influences pathogenic T-cell differentiation. The authors showed that PLA2G12A acts on EV membranes to produce lysophospholipids, including 1-oleoyl-lysophosphatidylethanolamine, and that downstream lysophosphatidic acid signaling via LPA2 contributes to Th17 differentiation. Beyond lipid signaling, the studies also examined EV cargo, including RNA and protein content, making shotgun proteomics an important component of the characterization strategy.
In the EV preparation workflow, Th17 cells were cultured in medium containing exosome-depleted fetal bovine serum. Culture supernatants were first centrifuged to remove cells, filtered through a 0.22 µm filter, concentrated by ultrafiltration/ultracentrifugation, washed, resuspended in PBS, and quantified by BCA protein assay. This upstream EV preparation ensured that a defined protein-equivalent amount of EV material could be carried into the proteomics workflow.
For shotgun proteomic analysis, the authors used EV samples corresponding to 5 µg protein equivalents. These samples were dried in PCR tubes, and 25 µL methanol was added. The samples were then sonicated for 3 minutes using the UIP400MTP microplate sonicator. Following sonication, the samples were centrifuged at 4°C for 20 minutes at 19,000 × g. After removal of 20 µL supernatant, the samples were centrifuged to dryness. Proteins were then dissolved by sonication in 4 µL trypsin/Lys-C solution at 100 ng/µL in 50 mM ammonium bicarbonate. Digestion was performed for 2 hours at 37°C with shaking at 300 rpm. The digest was acidified with 1 µL of 1.25% trifluoroacetic acid and submitted to nano-flow LC-high-resolution tandem mass spectrometry.
This workflow highlights several useful principles for low-input EV proteomics. First, the input was normalized by protein equivalent, which is important when comparing EVs from different genotypes or treatments. Second, methanol was used before sonication, supporting disruption and extraction while avoiding detergent systems that may complicate LC-MS/MS. Third, the sonication step was short and standardized, which is compatible with parallel sample processing. Fourth, trypsin/Lys-C digestion was performed in a very small volume, reducing dilution and supporting low-input peptide recovery. Finally, direct transition from digestion to acidification and LC-MS/MS minimized unnecessary handling steps.
डाउनस्ट्रीम एलसी-एमएस/एमएस विधि ने क्यू-एक्टिव एचएफ ऑर्बिट्रैप मास स्पेक्ट्रोमीटर के साथ युग्मित नैनो-फ्लो रिवर्स-फेज सेपरेशन का उपयोग किया। नमूने एक C18 पूर्व स्तंभ पर फंस गए थे, तो एक 50 माइक्रोन आंतरिक-व्यास विश्लेषणात्मक स्तंभ पर 200 एनएल / मिनट और 40 डिग्री सेल्सियस पर अलग कर दिया गया था। ढाल 60 मिनट में कम कार्बनिक विलायक से 35% विलायक बी तक चली, इसके बाद उच्च-जैविक धुलाई और पुन: संतुलन हुआ। एमएस अधिग्रहण उच्च-ऊर्जा टकराव पृथक्करण के साथ डेटा-स्वतंत्र अधिग्रहण का उपयोग करके सकारात्मक-आयन मोड में किया गया था। डीआईए कच्ची फाइलों का विश्लेषण डीआईए-एनएन 1.8 का उपयोग करके किया गया था, जिसमें सिलिको की भविष्यवाणी की गई वर्णक्रमीय लाइब्रेरी थी।