शॉटगन प्रोटीओमिक्स में माइक्रोप्लेट सोनिकेशन – अनुप्रयोग नोट
जटिल जैविक सामग्री को LC-MS/MS के लिए तैयार पेप्टाइडों में बदलने के लिए शॉटगन प्रोटीओमिक्स कुशल और पुनरुत्पादनीय नमूना तैयारी पर निर्भर करती है। UIP400MTP माइक्रोप्लेट सोनिकेटर कम आयतन वाले नमूनों का मानकीकृत, समानांतर सोनिकेशन संभव बनाकर इस प्रक्रिया में सहायता करता है, जिससे प्रयोगशालाओं को माइक्रोप्लेट-आधारित कार्यप्रवाहों में विघटन, निष्कर्षण और पुनः विलेयीकरण में सुधार करने में मदद मिलती है। यह अनुप्रयोग नोट बताता है कि UIP400MTP को प्रोटीओमिक नमूना तैयारी में कैसे एकीकृत किया जा सकता है। इसके लिए PLA2G12A/Th17 अध्ययनों के एक प्रकाशित बाह्यकोशिकीय पुटिका कार्यप्रवाह को प्रयोगशाला में परीक्षित उदाहरण के रूप में लिया गया है।
अधिक पुनरुत्पादनीय शॉटगन प्रोटीओमिक्स के लिए माइक्रोप्लेट सोनिकेशन
प्रोटीओमिक्स शोधकर्ताओं के लिए उच्च गुणवत्ता वाले LC-MS/MS डेटा प्राप्त करने हेतु पुनरुत्पादनीय नमूना तैयारी अत्यंत महत्वपूर्ण है। UIP400MTP माइक्रोप्लेट सोनिकेटर प्लेट-आधारित और कम आयतन/उच्च नमूना प्रसंस्करण क्षमता वाले कार्यप्रवाहों में मानकीकृत, समानांतर सोनिकेशन में सहायता करता है।
यह विशेष रूप से उन प्रयोगशालाओं के लिए उपयोगी है जो निम्नलिखित के साथ काम करती हैं:
- नमूनों के बड़े समूह, जिनके लिए अनेक वेलों में एकसमान प्रसंस्करण आवश्यक होता है
- सीमित प्रारंभिक मात्रा वाली सामग्री, जिसमें नमूने की हानि और परिवर्तनशीलता को न्यूनतम करना आवश्यक होता है
- लिपिड-समृद्ध नमूने, जैसे बाह्यकोशिकीय पुटिकाएँ
- जटिल जैविक नमूना तैयारियाँ, जिनके लिए कुशल विघटन, निष्कर्षण या पुनः विलेयीकरण आवश्यक होता है
- तुलनात्मक शॉटगन प्रोटीओमिक्स, जिसमें विभिन्न परिस्थितियों और प्रतिकृतियों में पुनरुत्पादनीयता आवश्यक होती है
पाचन से पहले माइक्रोप्लेट सोनिकेशन को एकीकृत करके शोधकर्ता निम्नलिखित के लिए नमूनों की तत्परता में सुधार कर सकते हैं:
- प्रोटीन निष्कर्षण और पुनः विलेयीकरण
- ट्रिप्सिन/Lys-C पाचन
- नैनो-LC/MS/MS डेटा अधिग्रहण
- बाद के चरणों में मात्रात्मक प्रोटीओमिक्स विश्लेषण
जानें कि माइक्रोप्लेट सोनिकेशन किस प्रकार मैन्युअल कार्य से उत्पन्न परिवर्तनशीलता को कम करने, नमूना विघटन में सुधार करने और विश्वसनीय LC-MS/MS विश्लेषण के लिए जटिल जैविक नमूने तैयार करने में मदद करता है।
माइक्रोप्लेट सोनिकेशन से निम्नलिखित को लाभ हो सकता है:
- प्रोटीओमिक्स की केंद्रीय सुविधाएँ
- EV अनुसंधान प्रयोगशालाएँ
- प्रतिरक्षाविज्ञान और कोशिका जीवविज्ञान प्रयोगशालाएँ
- अनुप्रयोगोन्मुख अनुसंधान समूह
- एकल नमूने की तैयारी से अधिक नमूना प्रसंस्करण क्षमता वाले कार्यप्रवाहों की ओर विस्तार कर रही जीवन विज्ञान टीमें
बाह्यकोशिकीय पुटिका प्रोटीओम विश्लेषण के लिए उच्च नमूना प्रसंस्करण क्षमता वाली नमूना तैयारी
शॉटगन प्रोटीओमिक्स क्या है?
शॉटगन प्रोटीओमिक्स जटिल जैविक नमूनों के अभिलक्षणन की एक प्रमुख विश्लेषणात्मक रणनीति बन गई है। इन नमूनों में संपूर्ण कोशिका लाइसेट और ऊतक निष्कर्षों से लेकर शुद्ध कोशिकांग, बाह्यकोशिकीय पुटिकाएँ और सीमित प्रारंभिक मात्रा वाले नैदानिक नमूने शामिल हैं। इसकी मूल शक्ति प्रोटीन पाचन, उच्च-विभेदन द्रव क्रोमैटोग्राफी–टैंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री और पेप्टाइडों से प्रोटीन की पहचान का संगणकीय अनुमान लगाने के संयोजन में निहित है। हालाँकि, अंतिम प्रोटीओम डेटासेट की गुणवत्ता नमूने के मास स्पेक्ट्रोमीटर तक पहुँचने से बहुत पहले ही निर्धारित हो जाती है। कुशल नमूना विघटन, प्रोटीन विलेयीकरण, हस्तक्षेप करने वाले पदार्थों का निष्कासन, पुनरुत्पादनीय एंज़ाइमी पाचन और विश्वसनीय पेप्टाइड पुनर्प्राप्ति – ये सभी कवरेज की गहराई और मात्रात्मक विश्वसनीयता के लिए निर्णायक हैं।
सीमित या बहुमूल्य नमूनों के साथ काम करने वाले प्रोटीओमिक्स शोधकर्ताओं और जीवन विज्ञान प्रयोगशालाओं के लिए नमूना तैयारी अक्सर एक बाधक चरण होती है।
UIP400MTP विश्वसनीय नमूना तैयारी और मौजूदा प्रयोगशाला कार्यप्रवाहों में सुगम एकीकरण सुनिश्चित करता है
प्रोटीओमिक्स में बाह्यकोशिकीय पुटिकाओं की चुनौती
उदाहरण के लिए, बाह्यकोशिकीय पुटिकाएँ (EVs) नमूनों का एक विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण वर्ग हैं। ये झिल्ली से घिरे, लिपिड-समृद्ध, नैनोस्तरीय कण होते हैं, जिनसे अपेक्षाकृत कम प्रोटीन प्राप्त होता है और जिनके साथ लिपिड, लवण, डिटर्जेंट, सीरम प्रोटीन तथा अन्य मैट्रिक्स घटकों के आगे के चरणों में पहुँचने की संभावना अधिक होती है। ये विशेषताएँ पाचन की दक्षता, क्रोमैटोग्राफिक प्रदर्शन, इलेक्ट्रोस्प्रे स्थिरता और पेप्टाइड की पहचान में बाधा डाल सकती हैं। इसलिए EV प्रोटिओमिक्स के लिए तैयारी कार्यप्रवाह इतना प्रभावी होना चाहिए कि वह पुटिका संरचनाओं को विघटित कर सके और उनमें मौजूद प्रोटीन को घोल सके, साथ ही आगे के एंज़ाइमी पाचन और LC-MS/MS विश्लेषण के अनुकूल बना रहे।
इस संदर्भ में, माइक्रोप्लेट के अनुकूल अल्ट्रासोनिकेशन पुनरुत्पादनीय, समानांतर नमूना प्रसंस्करण के लिए एक व्यावहारिक तरीका प्रदान करता है। Hielscher के माइक्रोप्लेट सोनिकेटर मॉडल UIP400MTP (400 W) और UIP550MTP (550 W) मल्टी-वेल प्लेटों और कम आयतन वाले पात्रों में नमूनों के सोनिकेशन के लिए डिज़ाइन किए गए हैं और पारंपरिक एकल-प्रोब सोनिकेटरों की तुलना में अधिक नमूना प्रसंस्करण क्षमता वाले कार्यप्रवाहों का समर्थन करते हैं। प्रोटिओमिक्स प्रयोगशालाओं के लिए यह प्रारूप आकर्षक है, क्योंकि यह मैनुअल कार्य से उत्पन्न परिवर्तनशीलता को कम कर सकता है, कई नमूनों के समानांतर उपचार को बेहतर बना सकता है और प्लेट-आधारित नमूना तैयारी प्रक्रियाओं में अधिक सहजता से एकीकृत हो सकता है।
कार्यप्रवाह का उदाहरण
PLA2G12A-संचालित Th17-कोशिका जीवविज्ञान में बाह्यकोशिकीय पुटिकाओं के प्रोटिओमिक्स का एक हालिया कार्यप्रवाह इस बात का उपयोगी, प्रयोगशाला में परीक्षित उदाहरण प्रस्तुत करता है कि माइक्रोप्लेट सोनिकेटर UIP400MTP को शॉटगन प्रोटिओमिक्स की नमूना तैयारी में कैसे शामिल किया जा सकता है। उस अध्ययन शृंखला में, प्रोटीओम विश्लेषण के लिए EV नमूनों को मेथनॉल उपचार, UIP400MTP सोनिकेशन, अपकेंद्रीकरण, सुखाने, trypsin/Lys-C पाचन और नैनो-प्रवाह LC–उच्च-विभेदन टैंडम MS का उपयोग करके संसाधित किया गया था। इस जैविक शोध की रिपोर्ट Mochizuki-Ono और सहकर्मियों ने 2026 में प्रकाशित की थी, जिसमें प्रोटिओमिक्स विश्लेषण ने यह स्पष्ट करने में मदद की कि रोगजनक T-कोशिका प्रतिक्रियाओं के संदर्भ में PLA2G12A, EV में मौजूद प्रोटीनों को कैसे बदलता है।
उच्च नमूना प्रसंस्करण क्षमता के साथ प्रोटीन निष्कर्षण के लिए 96-वेल प्लेट सोनिकेटर UIP400MTP
सोनिकेटर: UIP400MTP माइक्रोप्लेट सोनिकेटर
इनपुट: 5 µg प्रोटीन के समतुल्य EV सामग्री
पाचन: Trypsin/Lys-C
विश्लेषणात्मक मापन: नैनो-LC-MS/MS / DIA प्रोटिओमिक्स
चरण-दर-चरण निर्देश: शॉटगन प्रोटिओमिक्स के लिए UIP400MTP की सहायता से EV नमूना तैयारी
यह कार्यप्रवाह UIP400MTP माइक्रोप्लेट सोनिकेटर का उपयोग करके कम प्रारंभिक सामग्री से बाह्यकोशिकीय पुटिकाओं (EV) के शॉटगन प्रोटिओमिक्स की नमूना तैयारी विधि का वर्णन करता है। यह एक प्रकाशित EV प्रोटिओमिक्स कार्यप्रवाह पर आधारित है, जिसमें EV नमूनों को सामान्यीकृत किया गया, सुखाया गया, मेथनॉल से उपचारित किया गया, उनका सोनिकेशन किया गया, trypsin/Lys-C से पाचन किया गया, अम्लीकृत किया गया और नैनो-LC-MS/MS द्वारा विश्लेषित किया गया।
यह प्रक्रिया उन प्रोटिओमिक्स शोधकर्ताओं और जीवन-विज्ञान प्रयोगशालाओं के लिए है जो बॉटम-अप शॉटगन प्रोटिओमिक्स के लिए EV या अन्य कम आयतन वाले, लिपिड-समृद्ध जैविक नमूने तैयार करते हैं।
कार्यप्रवाह का अवलोकन
| चरण | उद्देश्य | मुख्य परिणाम |
|---|---|---|
| EV की तैयारी | EV नमूनों को अलग करें, धोएँ और उनका मात्रात्मक निर्धारण करें | सामान्यीकृत EV इनपुट |
| नमूना सुखाना | विलायक-सहायित प्रसंस्करण से पहले तरल हटाएँ | सूखी EV सामग्री |
| मेथनॉल उपचार | लिपिड-समृद्ध EV सामग्री के विघटन में सहायता करें | मेथनॉल से गीला किया गया नमूना |
| UIP400MTP सोनिकेशन | विघटन, निष्कर्षण और समांगीकरण को बढ़ावा दें | संसाधित EV नमूना |
| पाचन | EV प्रोटीनों से पेप्टाइड बनाएँ | Trypsin/Lys-C पाचन से प्राप्त पेप्टाइड मिश्रण |
| LC-MS/MS विश्लेषण | पेप्टाइड अलग करें, उनका पता लगाएँ और उनका मात्रात्मक निर्धारण करें | प्रोटिओमिक्स डेटासेट |
| डेटा विश्लेषण | पेप्टाइड और प्रोटीन की पहचान तथा मात्रात्मक निर्धारण करें | प्रोटीन-स्तरीय परिणाम |
चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल
| चरण | निर्देश | महत्वपूर्ण प्राचल |
|---|---|---|
| 1 | प्रयोगशाला के स्थापित पृथक्करण कार्यप्रवाह का उपयोग करके शुद्ध EV नमूने तैयार करें। | प्रोटिओमिक्स की तैयारी से पहले कोशिकाएँ, मलबा और प्रमुख संदूषक हटाएँ। |
| 2 | EV में प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करें, उदाहरण के लिए BCA परीक्षण द्वारा। | सभी नमूनों को सामान्यीकृत करें ताकि प्रत्येक का इनपुट समान प्रोटीन मात्रा के समतुल्य हो। |
| 3 | 5 µg प्रोटीन के समतुल्य EV सामग्री को साफ PCR ट्यूबों या संगत कम आयतन वाली ट्यूबों में स्थानांतरित करें। | जहाँ नमूने की हानि चिंता का विषय हो, वहाँ कम बंधन वाली ट्यूबों का उपयोग करें। |
| 4 | EV नमूनों को पूरी तरह सुखाएँ। | अत्यधिक गर्म होने से बचाएँ; पुष्टि करें कि कोई दिखाई देने वाला तरल शेष नहीं है। |
| 5 | प्रत्येक सूखे EV नमूने में 25 µL मेथनॉल मिलाएँ। | सुनिश्चित करें कि सूखी सामग्री पूरी तरह गीली हो गई है। |
| 6 | UIP400MTP माइक्रोप्लेट सोनिकेटर का उपयोग करके नमूनों का 3 मिनट तक सोनिकेशन करें। | सभी नमूनों के लिए समान सोनिकेशन सेटिंग्स और नमूना व्यवस्था के समान सिद्धांतों का उपयोग करें। |
| 7 | सोनिकेशन किए गए नमूनों को 4°C पर 19,000 × g पर 20 मिनट तक अपकेंद्रित करें। | अपकेंद्रीकरण के बाद किसी भी तलछट या अघुलनशील पदार्थ को हिलने से बचाएँ। |
| 8 | सावधानीपूर्वक 20 µL अधिप्लवी द्रव निकालें। | सभी नमूनों के लिए एकसमान पिपेटिंग तकनीक का उपयोग करें। |
| 9 | शेष नमूना सामग्री को पूरी तरह सुखाएँ। | सीधे पाचन चरण पर जाएँ या केवल सत्यापित परिस्थितियों में भंडारित करें। |
| 10 | 50 mM अमोनियम बाइकार्बोनेट में 100 ng/µL सांद्रता वाला 4 µL trypsin/Lys-C विलयन डालें। | एंज़ाइम विलयन ताज़ा तैयार करें या उचित रूप से भंडारित छोटे विभाजित अंशों का उपयोग करें। |
| 11 | सूखी प्रोटीन सामग्री को पाचन विलयन में घोलने के लिए थोड़े समय तक सोनिकेशन करें। | सोनिकेशन के बाद सारा द्रव ट्यूब के तल पर एकत्र करें। |
| 12 | 37°C पर 300 rpm की गति से हिलाते हुए 2 घंटे तक पाचन करें। | वाष्पीकरण रोकने के लिए ढक्कन कसकर बंद रखें। |
| 13 | पाचित मिश्रण को अम्लीकृत करने के लिए 1 µL 1.25% TFA डालें। | अम्लीकरण पाचन को रोकता है और पेप्टाइडों को LC-MS/MS के लिए तैयार करता है। |
| 14 | पाचित मिश्रण को LC-MS के अनुकूल वायल या प्लेटों में स्थानांतरित करें। | अघुलनशील मलबे को स्थानांतरित करने से बचें। |
| 15 | nano-LC-MS/MS द्वारा विश्लेषण करें। | इंजेक्शन आयतन, LC ग्रेडिएंट और MS डेटा अधिग्रहण सेटिंग्स एकसमान रखें। |
| 16 | उपयुक्ततानुसार DIA, DDA या लक्षित प्रोटिओमिक्स सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके कच्चे डेटा को संसाधित करें। | उपयुक्त डेटाबेस, एंज़ाइम विशिष्टता, संशोधन सेटिंग्स और FDR सीमाएँ लागू करें। |
(cf. Mochizuki-Ono et al., 2026)
मल्टी-वेल प्लेट सोनिकेटर UIP400MTP
माइक्रोप्लेट सोनिकेशन क्यों?
UIP400MTP कम आयतन वाले नमूनों का मानकीकृत, समानांतर सोनिकेशन सक्षम करता है। यह तब उपयोगी होता है जब पुनरुत्पादकता, नमूने की कम प्रारंभिक मात्रा और अनेक नमूनों की प्रसंस्करण क्षमता महत्वपूर्ण हों।
किसी भी मानक माइक्रोप्लेट का उपयोग करें! UIP400MTP के साथ उच्च नमूना प्रसंस्करण क्षमता वाली नमूना तैयारी
संदर्भित EV प्रोटिओमिक्स कार्यप्रवाह में 5 µg प्रोटीन-समतुल्य EV की प्रारंभिक मात्रा, 25 µL मेथनॉल, UIP400MTP से 3 मिनट का सोनिकेशन, trypsin/Lys-C पाचन, TFA द्वारा अम्लीकरण और nano-LC-MS/MS विश्लेषण का उपयोग किया गया था।
LC-MS/MS और डेटा विश्लेषण के अनुशंसित चरण
पाचन और अम्लीकरण के बाद, उच्च-विभेदन टैंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री से युग्मित नैनो-प्रवाह रिवर्स्ड-फेज़ LC का उपयोग करके नमूनों का विश्लेषण किया जा सकता है। प्रकाशित कार्यप्रवाह में, पेप्टाइडों को नैनो-LC प्रणाली पर अलग किया गया और Orbitrap मास स्पेक्ट्रोमीटर पर डेटा-स्वतंत्र अधिग्रहण द्वारा उनका विश्लेषण किया गया।
| चरण | अनुशंसा | उद्देश्य |
|---|---|---|
| नमूना लोडिंग | C18 ट्रैप या समतुल्य पेप्टाइड-लोडिंग व्यवस्था का उपयोग करें। | पेप्टाइडों को सांद्रित करता है और अत्यधिक ध्रुवीय संदूषकों को हटाता है। |
| पेप्टाइड पृथक्करण | नैनो-प्रवाह रिवर्स्ड-फेज़ LC का उपयोग करें। | पेप्टाइड पृथक्करण और MS संवेदनशीलता में सुधार करता है। |
| MS डेटा अधिग्रहण | अध्ययन की रूपरेखा के अनुसार DIA, DDA या लक्षित MS का उपयोग करें। | पेप्टाइड-स्तरीय स्पेक्ट्रल डेटा उत्पन्न करता है। |
| डेटाबेस खोज | प्रजाति के लिए उपयुक्त संदर्भ डेटाबेस का उपयोग करें। | पेप्टाइड और प्रोटीन की पहचान में सहायता करता है। |
| FDR नियंत्रण | पेप्टाइड और प्रोटीन की मिथ्या खोज दर की सीमाएँ लागू करें। | पहचान की विश्वसनीयता को नियंत्रित करता है। |
| मात्रा निर्धारण | पेप्टाइड, पूर्वगामी और प्रोटीन की प्रचुरता की तालिकाएँ निर्यात करें। | समूहों के बीच सांख्यिकीय तुलना सक्षम करता है। |
गुणवत्ता नियंत्रण जाँचसूची
- पुष्टि करें कि सभी नमूनों में EV की प्रारंभिक प्रोटीन-समतुल्य मात्रा समान है।
- यादृच्छिकीकृत या संतुलित नमूना प्रसंस्करण व्यवस्थाओं का उपयोग करें।
- मेथनॉल का आयतन, सोनिकेशन का समय, सुखाने का समय और पाचन का आयतन एकसमान रखें।
- पेप्टाइड उपज और पहचाने गए प्रोटीनों की कुल संख्या की निगरानी करें।
- छूटे हुए विदलन की दर और पेप्टाइड लंबाई के वितरण की जाँच करें।
- क्रोमैटोग्राफिक शिखर के आकार और अवधारण समय की पुनरुत्पादकता की जाँच करें।
- पिछले नमूने के अवशेषों के अगले नमूने में पहुँचने की निगरानी के लिए ब्लैंक शामिल करें।
- बड़े अध्ययनों के लिए संयुक्त QC नमूनों का उपयोग करें।
- प्रतिकृति नमूनों के विचरण गुणांक का मूल्यांकन करें।
- बैच प्रभावों या बाह्यस्थ नमूनों की पहचान करने के लिए PCA या संबंधित विधियों का उपयोग करें।
प्रक्रिया अभिलेखन के लिए अनुशंसाएँ
इस कार्यप्रवाह को प्रकाशित या प्रलेखित करते समय, EV की प्रारंभिक मात्रा, प्लेट प्रारूप, मेथनॉल आयतन, UIP400MTP का आयाम और सोनिकेशन समय, अपकेंद्रीकरण की परिस्थितियाँ, सुखाने की विधि, पाचन बफ़र, एंज़ाइम सांद्रता, पाचन समय, अम्लीकरण की परिस्थितियाँ, LC-MS/MS प्लेटफ़ॉर्म, अधिग्रहण मोड, सॉफ़्टवेयर संस्करण, डेटाबेस, FDR सीमा, सामान्यीकरण विधि और सांख्यिकीय कार्यप्रवाह की जानकारी दें।
सभी Hielscher माइक्रोप्लेट सोनिकेटर आयाम, सोनिकेशन की अवधि और तापमान जैसे महत्वपूर्ण प्रक्रिया पैरामीटरों को दिनांक और समय की मुहर के साथ एकीकृत SD-कार्ड पर CVS फ़ाइल के रूप में स्वचालित रूप से रिकॉर्ड करते हैं। पुनरुत्पादकता और गुणवत्ता नियंत्रण के लिए डेटा रिकॉर्ड करना पहले कभी इतना आसान नहीं था!
DIA प्रोटिओमिक्स के लिए, सभी नमूनों में एकसमान डेटा अधिग्रहण सेटिंग्स का उपयोग करें और जहाँ संभव हो, पूल किए गए QC नमूने शामिल करें। प्रीकर्सर की संख्या, प्रतिधारण समय की स्थिरता और पुनरावृत्त नमूनों के बीच परिवर्तनशीलता की निगरानी करें।
यह कार्यप्रवाह EV प्रोटिओमिक्स के लिए प्रयोगशाला में परीक्षित एक उदाहरण है। अन्य प्रकार के नमूनों के लिए, पूर्ण अध्ययन तक विस्तार करने से पहले इनपुट मात्रा, विलायक की स्थितियों, सोनिकेशन समय, पाचन आयतन और LC-MS/MS इंजेक्शन रणनीति को अनुकूलित करें।
अध्ययन का विस्तृत विवरण: PLA2G12A अध्ययन में EV शॉटगन प्रोटिओमिक्स
PLA2G12A अध्ययन शॉटगन प्रोटीओमिक्स कार्यप्रवाह में UIP400MTP के उपयोग का एक ठोस उदाहरण प्रस्तुत करता है। जैविक प्रश्न यह था कि स्रावित फॉस्फोलाइपेज़ PLA2G12A, Th17 कोशिकाओं से उत्पन्न बाह्यकोशिकीय पुटिकाओं को कैसे संशोधित करता है और इस प्रकार रोगजनक T कोशिकाओं के विभेदन को कैसे प्रभावित करता है। लेखकों ने दिखाया कि PLA2G12A, EV झिल्लियों पर क्रिया करके लाइसोफॉस्फोलिपिड बनाता है, जिनमें 1-oleoyl-lysophosphatidylethanolamine शामिल है, और LPA2 के माध्यम से होने वाला अनुवर्ती लाइसोफॉस्फेटिडिक अम्ल संकेतन Th17 विभेदन में योगदान देता है। लिपिड संकेतन के अलावा, अध्ययनों में EV के भीतर मौजूद सामग्री की भी जाँच की गई, जिसमें RNA और प्रोटीन की मात्रा शामिल थी। इससे शॉटगन प्रोटीओमिक्स अभिलक्षणन रणनीति का एक महत्वपूर्ण घटक बन गया।
EV तैयार करने के कार्यप्रवाह में, Th17 कोशिकाओं का संवर्धन ऐसे माध्यम में किया गया जिसमें एक्सोसोम से रहित भ्रूणीय गोवंशीय सीरम था। संवर्धन के अधिप्लावी द्रवों को पहले कोशिकाएँ हटाने के लिए अपकेंद्रित किया गया, फिर 0.22 µm फ़िल्टर से छाना गया, अल्ट्राफिल्ट्रेशन/अल्ट्रासेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा सांद्रित किया गया, धोया गया, PBS में पुनः निलंबित किया गया और BCA प्रोटीन परख द्वारा उनका मात्रात्मक निर्धारण किया गया। EV तैयार करने के इस प्रारंभिक चरण ने सुनिश्चित किया कि EV सामग्री की एक निर्धारित प्रोटीन-समतुल्य मात्रा प्रोटीओमिक्स कार्यप्रवाह में ले जाई जा सके।
शॉटगन प्रोटीओमिक विश्लेषण के लिए, लेखकों ने 5 µg प्रोटीन के समतुल्य EV नमूनों का उपयोग किया। इन नमूनों को PCR ट्यूबों में सुखाया गया और 25 µL मेथनॉल मिलाया गया। इसके बाद UIP400MTP माइक्रोप्लेट सोनिकेटर का उपयोग करके नमूनों का 3 मिनट तक सोनिकेशन किया गया। सोनिकेशन के बाद, नमूनों को 4°C पर 20 मिनट तक 19,000 × g पर अपकेंद्रित किया गया। 20 µL अधिप्लावी द्रव हटाने के बाद, नमूनों को सूखने तक अपकेंद्रित किया गया। इसके बाद प्रोटीनों को सोनिकेशन द्वारा 4 µL ट्रिप्सिन/Lys-C विलयन में घोला गया, जिसमें 50 mM अमोनियम बाइकार्बोनेट में ट्रिप्सिन/Lys-C की सांद्रता 100 ng/µL थी। पाचन 37°C पर 2 घंटे तक, 300 rpm पर हिलाते हुए किया गया। पाचित नमूने को 1 µL 1.25% ट्राइफ्लुओरोएसीटिक अम्ल से अम्लीकृत किया गया और नैनो-प्रवाह LC–उच्च-विभेदन टैंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए भेजा गया।
यह कार्यप्रवाह कम इनपुट वाली EV प्रोटीओमिक्स के लिए कई उपयोगी सिद्धांतों को उजागर करता है। पहला, इनपुट को प्रोटीन-समतुल्य मात्रा के आधार पर सामान्यीकृत किया गया था, जो विभिन्न जीनोटाइप या उपचारों से प्राप्त EV की तुलना करते समय महत्वपूर्ण है। दूसरा, सोनिकेशन से पहले मेथनॉल का उपयोग किया गया, जिससे विघटन और निष्कर्षण में सहायता मिली और ऐसी डिटर्जेंट प्रणालियों के उपयोग से बचा गया जो LC-MS/MS को जटिल बना सकती हैं। तीसरा, सोनिकेशन चरण संक्षिप्त और मानकीकृत था, जो समानांतर नमूना प्रसंस्करण के अनुकूल है। चौथा, ट्रिप्सिन/Lys-C पाचन बहुत कम आयतन में किया गया, जिससे तनुकरण कम हुआ और कम इनपुट वाले नमूनों से पेप्टाइड की पुनर्प्राप्ति में सहायता मिली। अंत में, पाचन से सीधे अम्लीकरण और LC-MS/MS की ओर बढ़ने से अनावश्यक हैंडलिंग चरण न्यूनतम हो गए।
बाद की LC-MS/MS विधि में Q-Exactive HF Orbitrap मास स्पेक्ट्रोमीटर से युग्मित नैनो-प्रवाह प्रतिलोम-चरण पृथक्करण का उपयोग किया गया। नमूनों को C18 प्री-कॉलम पर रोका गया, फिर 50 µm आंतरिक व्यास वाले विश्लेषणात्मक कॉलम पर 200 nL/min और 40°C पर अलग किया गया। ग्रेडिएंट 60 मिनट में कम कार्बनिक विलायक वाले स्तर से 35% विलायक B तक गया, जिसके बाद उच्च कार्बनिक विलायक अंश से धुलाई और पुनः संतुलन किया गया। MS डेटा अधिग्रहण धनायन मोड में, उच्च-ऊर्जा संघट्टन-प्रेरित विखंडन के साथ डेटा-स्वतंत्र अधिग्रहण का उपयोग करके किया गया। DIA की कच्ची फ़ाइलों का विश्लेषण DIA-NN 1.8 द्वारा, इन सिलिको पूर्वानुमानित स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी का उपयोग करके किया गया।
उच्च नमूना प्रसंस्करण क्षमता के साथ प्रोटीन निष्कर्षण 96-वेल प्लेट सोनिकेटर UIP400MTP की सहायता से
अक्सर पूछे जाने वाले प्रश्न
शॉटगन प्रोटीओमिक्स में माइक्रोप्लेट सोनिकेशन से सबसे अधिक लाभ किसे होता है?
माइक्रोप्लेट सोनिकेशन विशेष रूप से उन प्रोटीओमिक्स प्रयोगशालाओं के लिए उपयोगी है जो कई नमूनों को समानांतर रूप से संसाधित करती हैं। इनमें केंद्रीय सुविधाएँ, प्रोटीओम अनुसंधान समूह, प्रतिरक्षाविज्ञान प्रयोगशालाएँ, अनुप्रयोगोन्मुख अनुसंधान दल और उच्चतर नमूना प्रसंस्करण क्षमता वाले LC-MS/MS कार्यप्रवाहों की ओर बढ़ रही जीवन विज्ञान प्रयोगशालाएँ शामिल हैं। यह विशेष रूप से तब प्रासंगिक है जब विभिन्न नमूनों के बीच पुनरुत्पादकता अत्यंत महत्वपूर्ण हो।
पारंपरिक प्रोब सोनिकेटर के बजाय UIP400MTP का उपयोग क्यों करें?
एक पारंपरिक प्रोब सोनिकेटर आमतौर पर एक बार में एक नमूने को संसाधित करता है और पिछले नमूने के अवशेष अगले नमूने में जाने को कम करने के लिए नमूनों के बीच सावधानीपूर्वक सफाई आवश्यक होती है। माइक्रोप्लेट सोनिकेटर मॉडल UIP400MTP और UIP550MTP प्लेट-आधारित या छोटे आयतन वाले प्रारूप में समानांतर सोनिकेशन का समर्थन करते हैं, जिससे हाथ से किए जाने वाले कार्यों को कम करने, एकरूपता में सुधार करने और अनेक नमूनों की तैयारी को सुव्यवस्थित करने में मदद मिलती है। वे स्वचालित कार्यप्रवाहों में भी आसान एकीकरण की सुविधा देते हैं।
शॉटगन प्रोटिओमिक्स कार्यप्रवाह में सोनिकेशन का उपयोग किस चरण में होता है?
सोनिकेशन आमतौर पर पाचन से पहले नमूना तैयार करने के चरण में किया जाता है। यह ट्रिप्सिन, Lys-C या ट्रिप्सिन/Lys-C मिश्रण से एंज़ाइमी पाचन से पहले विघटन, निष्कर्षण, समांगीकरण और पुनः घुलनशील बनाने में सहायक हो सकता है।
इसके अतिरिक्त, एंज़ाइमी प्रोटीन पाचन को काफी तेज़ करने के लिए पाचन के दौरान भी सोनिकेशन किया जा सकता है। तेज़ प्रोटिओमिक कार्यप्रवाह के लिए सोनिकेशन का उपयोग करके उच्च नमूना प्रसंस्करण क्षमता वाले प्रोटीन पाचन की संभावनाएँ जानें!
क्या माइक्रोप्लेट सोनिकेशन बाह्यकोशिकीय पुटिका प्रोटिओमिक्स के लिए उपयोगी है?
हाँ। बाह्यकोशिकीय पुटिकाएँ लिपिड-समृद्ध, झिल्ली से घिरे कण होते हैं, जिनका पुनरुत्पादनीय ढंग से प्रसंस्करण चुनौतीपूर्ण हो सकता है। संदर्भित PLA2G12A अध्ययनों में EV नमूनों को मेथनॉल से उपचारित किया गया, UIP400MTP से उनका सोनिकेशन किया गया, उन्हें सुखाया गया, ट्रिप्सिन/Lys-C से उनका पाचन किया गया और nano-LC/MS/MS द्वारा विश्लेषण किया गया।
किस प्रकार के नमूनों को माइक्रोप्लेट सोनिकेशन से लाभ हो सकता है?
माइक्रोप्लेट सोनिकेशन कोशिका लाइसेट, कोशिकांग अंशों, इम्यूनोप्रेसिपिटेट, प्रोटीन समुच्चयों, झिल्ली-समृद्ध नमूनों, बाह्यकोशिकीय पुटिकाओं और कम आयतन वाली अन्य जैविक तैयारियों के लिए उपयोगी हो सकता है। प्रत्येक प्रकार के नमूने के लिए सोनिकेशन की तीव्रता और समय, विलायक की स्थितियों, इनपुट मात्रा और पाचन रणनीति का अनुकूलन किया जाना चाहिए।
क्या सोनिकेशन एंज़ाइमी पाचन का स्थान लेता है?
नहीं। सोनिकेशन विघटन, निष्कर्षण या पुनः घुलनशील बनाने की प्रक्रिया में सुधार करके नमूने को पाचन के लिए तैयार करने में मदद करता है। बॉटम-अप शॉटगन प्रोटिओमिक्स के लिए पेप्टाइड बनाने हेतु प्रोटीन अपघटनी पाचन की आवश्यकता बनी रहती है।
प्रोटिओमिक कार्यप्रवाहों में अल्ट्रासोनिक रूप से संवर्धित प्रोटीन पाचन के बारे में और पढ़ें!
क्या UIP400MTP कम इनपुट वाले प्रोटिओमिक्स के साथ संगत है?
हाँ, माइक्रोप्लेट प्रारूप छोटे आयतन वाले कार्यप्रवाहों के लिए उपयुक्त है, जहाँ नमूने का संरक्षण और एकसमान प्रसंस्करण महत्वपूर्ण हैं। प्रकाशित EV कार्यप्रवाह में प्रोटिओमिक्स की तैयारी 5 µg प्रोटीन के समतुल्य EV इनपुट के साथ की गई थी।
क्या माइक्रोप्लेट सोनिकेशन पुनरुत्पादनीयता में सुधार कर सकता है?
Hielscher सोनिकेटर अनेक नमूनों पर मानकीकृत सोनिकेशन स्थितियाँ लागू करके पुनरुत्पादनीयता में सहायक होते हैं। हालाँकि, कोशिका या EV पृथक्करण, इनपुट सामान्यीकरण, पाचन दक्षता, LC-MS/MS स्थिरता, डेटा प्रसंस्करण और सांख्यिकीय विश्लेषण जैसे अन्य कारक भी प्रोटिओमिक्स की समग्र पुनरुत्पादनीयता में योगदान देते हैं।
क्या माइक्रोप्लेट सोनिकेशन प्रोटीन पहचान की गहराई में सुधार करता है?
जब नमूना विघटन या पुनः घुलनशील बनाने की प्रक्रिया एक सीमाकारी कारक हो, तब यह पहचान की गहराई में सुधार में योगदान दे सकता है। इसका प्रभाव नमूने के प्रकार, प्रोटीन रसायन, शुद्धीकरण रणनीति, पाचन की स्थितियों और LC-MS/MS विधि के प्रदर्शन पर निर्भर करता है।
कार्यप्रवाह का नियमित उपयोग करने से पहले किन बातों का अनुकूलन किया जाना चाहिए?
प्रमुख मापदंडों में नमूना इनपुट, बफ़र या विलायक की संरचना, प्लेट प्रारूप, अल्ट्रासोनिक आयाम और अवधि, सुखाने की स्थितियाँ, पाचन आयतन, एंज़ाइम सांद्रता, ऊष्मायन समय और LC-MS/MS इंजेक्शन मात्रा शामिल हैं। कार्यप्रवाह को पूरे प्रायोगिक नमूना समूह पर लागू करने से पहले प्रारंभिक परीक्षण की अनुशंसा की जाती है।
क्या इस कार्यप्रवाह का उपयोग DIA प्रोटिओमिक्स के साथ किया जा सकता है?
हाँ। संदर्भित EV कार्यप्रवाह में डेटा-स्वतंत्र अधिग्रहण के बाद DIA-NN विश्लेषण का उपयोग किया गया था। माइक्रोप्लेट सोनिकेशन प्रारंभिक नमूना-तैयारी प्रक्रिया का हिस्सा है और इसे DIA, DDA या लक्षित प्रोटिओमिक्स विधियों के साथ एकीकृत किया जा सकता है।
किन गुणवत्ता-नियंत्रण मापकों की निगरानी की जानी चाहिए?
अनुशंसित QC मापदंडों में पेप्टाइड उपज, पहचाने गए पेप्टाइडों और प्रोटीन समूहों की संख्या, छूटे हुए विदलन की दर, पेप्टाइड लंबाई वितरण, क्रोमैटोग्राफिक पीक का आकार, अवधारण समय की स्थिरता, प्रतिकृति नमूनों का परिवर्तन गुणांक, कैरीओवर और PCA या संबंधित विधियों द्वारा जैविक समूहों का पृथक्करण शामिल हैं।
प्रोटिओमिक्स नमूना तैयारी में माइक्रोप्लेट सोनिकेटर मॉडल UIP400MTP या UIP550MTP को शामिल करने का मुख्य लाभ क्या है?
मुख्य लाभ कम आयतन वाले नमूनों का मानकीकृत, समानांतर प्रसंस्करण है। इससे प्रयोगशालाओं को मैनुअल कार्य से उत्पन्न परिवर्तनशीलता कम करने और जटिल जैविक नमूनों को पाचन, LC-MS/MS डेटा अधिग्रहण और मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स विश्लेषण के लिए अधिक एकरूपता से तैयार करने में मदद मिलती है।
Hielscher माइक्रोप्लेट सोनिकेटरों को स्वचालित कार्यप्रवाहों में सहजता से एकीकृत किया जा सकता है।
साहित्य / संदर्भ
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
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Hielscher Ultrasonics उच्च प्रदर्शन वाले अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइज़र बनाता है, जिनका आकार प्रयोगशाला स्तर से लेकर औद्योगिक स्तर तक होता है।