מיצוי חלבונים מרקמת גידול בעזרת אולטרסאונד – פרוטוקול

פרוטוקול זה מתאר שיטת מיצוי חלבונים בסיוע סוניקציה מרקמת גידול, המשפרת את תהליך הליזה הסטנדרטי של CPTAC באמצעות אוריאה על ידי הוספת שלב מבוקר של סוניקציה באמצעות מתמר במהלך פירוק הרקמה. בהתבסס על אסטרטגיית ההכנה המוכחת של פרוטאום ופוספופרוטאום CPTAC בקנה מידה עמוק, שינוי זה משפר את פירוק המבנה התאי והתת-תאי, מפחית את צמיגות הדגימה ומשפר את שחרור החלבונים שקשה בדרך כלל לשחזר באמצעות ליזיס אוריאה בלבד, במיוחד חלבונים הקשורים לקרום, הקשורים ל-DNA או הקשורים לגרעין. במחקר הבסיסי, תהליך העבודה המסייע בסוניקציה הגביר את זיהוי החלבונים והפוספופפטידים, תוך שמירה על תאימות עם תהליך העיכול בסגנון CPTAC בהמשך, תיוג TMT, חלוקה, העשרת פוספופפטידים וצינור ניתוח LC-MS/MS.

מיצוי חלבונים מרקמת גידול בעזרת אולטרסאונד לצורך ניתוח פרוטאומי ופוספופרוטאומי מעמיק

The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.

תחום היישום של הפרוטוקול

השתמש בהליך זה עבור:

• רקמת גידול קפואה טרייה, שעברה תהליך של פיזור בקור
• משקעי תאים או דגימות ביולוגיות אחרות, שבהן כבר מקובל להשתמש בשיטת מיצוי מבוססת אוריאה
• תהליכי עבודה בתחום הפרוטאומיקה והפוספו-פרוטאומיקה הגלובליים, תוך שימוש בעיכול טריפסי וסימון TMT אופציונלי

במחקרם של Li et al. (2025) נטען כי תהליך העבודה ישים גם לסוגי דגימות אחרים, כגון קווי תאים, דם ושתן, אך ייתכן שיהיה צורך לבצע התאמות בהתאם לסוג הדגימה.

תהליך עבודה מיטבי להכנת דגימות הכולל שלב של טיפול באולטרסאונד. תהליך העבודה המיטבי ותכנון הניסוי מבוססים על פרוטוקול הכנת הדגימות של CPTAC לניתוח פרוטאומי ופוספו-פרוטאומי גלובלי.
מחקר ותרשים: ©Li et al., 2025

עקרון העבודה

במחקר המקורי שולב תהליך של טיפול בקול (sonication) בתהליך הסטנדרטי של פירוק אוריאה בשיטת CPTAC, ונמצא כי הדבר שיפר את זיהוי החלבונים הקשורים לקרומים ולגרעינים. החוקרים מציינים כי יש לכוונן את פרמטרי הטיפול בקול בהתאם לגודל הדגימה ולריכוז – על ידי בחירת גודל הסונוטרוד, עוצמת האנרגיה ותזמון הפולסים.

לדוגמה, עבור דגמי Hielscher UP200Ht ו-UP200St, פירוש הדבר הוא:

• להשתמש במשרעת ובמצב הדופק כמשתני הבקרה העיקריים
• יש לשמור על הדגימות בקירור לאורך כל התהליך (כלומר, על קרח)
• התחל בהגדרות שמרניות
• ביצוע אופטימיזציה בהתחשב בבהירות הדגימה, הטמפרטורה, תפוקת החלבון ואיכות הפפטידים בשלבים הבאים

 
שני דגמי הסוניקטור של Hielscher בהספק 200 וואט, UP200Ht ו-UP200St, מיועדים לנפחי דגימה קטנים ובינוניים, עם הגדרות משרעת ודופק הניתנות לכוונון; שני ההומוגניזרים האולטראסוניים כוללים מסך מגע דיגיטלי לשליטה מדויקת בפרמטרים, רישום נתונים אוטומטי, חיישן טמפרטורה נתיק, שלט רחוק ותאורה לדגימה.
 

חומרים כימיים להפקת חלבונים בעזרת סוניקציה

תמיסת ליזיס של אוריאה

יש להכין טרי מיד לפני השימוש:

• 8 מ' אוריאה
• 75 מ"מ NaCl
• 50 מ"מ טריס, pH 8.0
• 1 מ"מ EDTA
• 2 מיקרוגרם/מ"ל אפרותינין
• 10 מיקרוגרם/מ"ל לופפטין
• 1 מ"מ PMSF
• 10 מ"מ NaF
• 20 מיקרומטר PUGNAc
• תערובת מעכבי פוספטאז 2, 1:100 (נפח/נפח)
• תערובת מעכבי פוספטאז 3, 1:100 (נפח/נפח)

יש להמיס את האוריאה לחלוטין לפני הוספת התוספים; יש להוסיף את המעכבים מיד לפני השימוש; יש לשמור את התמיסה על קרח; ומומלץ לערבב את התמיסה בתנועות סיבוביות עדינות ולא בערבוב נמרץ במערבל וורטקס לאחר הוספת התוספים.
 

חומרים נוספים:

• חומרים לניתוח חלבונים בשיטת BCA
• 50 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0
• טלוויזיה דיגיטלית
• יודואצטאמיד
• LysC
• טריפסין
• חומצה פורמית
• חומרים כימיים ל-TMT, במקרה של שימוש בפרוטאומיקה כמותית מרובת-ערוצים
• חומרים של IMAC, אם מבצעים העשרת פוספופפטידים

ציוד להפקת חלבונים בעזרת סוניקציה

חובה

בחירת בדיקה מומלצת

לדגימות בנפח של כ-200–1000 מיקרו-ליטר, יש להשתמש בסונוטרוד בקוטר קטן המתאים לעיבוד ישיר בעוצמה גבוהה של נפחים קטנים. חברת Hielscher מציעה סונוטרודים בקטרים שונים, כאשר קוטר קצה קטן יותר מספק עוצמה גבוהה יותר בקצה.

הערה מעשית: השתמשו בחיישן הקטן ביותר שמאפשר ערבוב יעיל ללא היווצרות קצף מוגזמת או מגע עם דפנות הכלי.

אם אתם עובדים עם מספר דוגמאות בו-זמנית, כדאי לשקול הסוניקטור רב-צינורי VialTweeter או מכשיר הסוניקציה למיקרו-פלטה UIP400MTP!

הוראות שלב אחר שלב: תהליך מיצוי חלבונים בעזרת אולטרסאונד

א. קירור מוקדם והכנה

1. יש לקרר את הצנטריפוגה לטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
2. הכינו תמיסת ליזיס אוריאה טרייה ושמרו אותה בקרח.
3. הציבו את ה-UP200Ht או ה-UP200St על מעמד בתוך תא אקוסטי.
4. הכינו אמבט קרח שיהיה גדול מספיק כדי להכיל את מבחנות הדגימה במצב זקוף ויציב.

הכנת תמיסה טרייה וטיפול בקירור הם גורמים מכריעים.

ב. מיצוי ראשוני של אוריאה

1. יש לשמור את הרקמה שעברה תהליך של פיזור בקור על קרח.
2. יש להוסיף 200 מיקרוליטר של תמיסת ליזיס אוריאה מקוררת לכל 50 מ"ג רקמה רטובה.
3. לערבב במערבל במהירות גבוהה במשך 5–10 שניות.
4. להשרייה במשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
5. חזור על שלב ה"וורטקס" וה"דגירה" פעם נוספת.
6. לסובב בצנטריפוגה ב-20,000 g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C.
7. העבר את התמיסה/הנוזל העליון למבחנה נקייה בעלת קישור נמוך.

ג. טיפול באולטרסאונד באמצעות UP200Ht או UP200St

תנאי התחלה לביצוע סוניקציה

• משרעת: התחל ב-20–30%
• אורך הדופק: 5 שניות במצב ON
• קירור: 2 דקות על קרח בין פולסים
• מספר מחזורים: 4 מחזורים
• משך הזמן הכולל של הטיפול באולטרסאונד: 20 שניות
• משך התהליך הכולל, כולל קירור: כ-8–10 דקות

שלבי הטיפול באולטרסאונד

1. העבר את התמיסה למבחנה המתאימה לטיפול באולטרסאונד. השתמש במבחנה צרה ודקה-דופן, המאפשרת חילופי חום טובים וטבילה בטוחה של המתמר.
2. הכניסו את הצינור לאמבט קרח. במאמר מצוין כי קירור במהלך הטיפול באולטרסאונד הוא חיוני למניעת נזק מחום.
3. טבלו את קצה הבדיקה בדגימה. השאירו את הקצה שקוע מספיק זמן כדי ליצור קוויטציה יציבה, אך הימנעו ממגע עם דפנות הצינור או קרקעיתו.
4. הפעל פולס אחד בן 5 שניות בעוצמה ההתחלתית.
5. יש להחזיר את הדגימה מיד לקרח למשך 2 דקות.
6. יש לחזור על הפעולה עד להשלמת 4 מחזורים.
7. בדקו את התוצר לאחר המחזור.
8. המשך רק במידת הצורך, תוך שימוש בפולס נוסף של 5 שניות בכל פעם, שתמיד ילווה בקירור מלא.
9. יש להפסיק ברגע שהתמיסה הופכת לאחידה יותר ופחות סיבית/צמיגה.
   התוצר הסופי הוא תמיסת תאים שקופה יותר, היוצרת טיפות במקום זרם צמיג ורציף.
10. יש לסובב בצנטריפוגה במהירות של כ-16,000 g למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4°C.
11. העבר את הנוזל העליון המטוהר למבחנה נקייה ומדוד את ריכוז החלבון.

השוואה בין פרוטאומיקה ופוספו-פרוטאומיקה כוללת של דגימות שעברו טיפול באולטרסאונד לדגימות שלא עברו טיפול כזה.
א. מספר החלבונים שזוהו (פרוטאומיקה גלובלית) בכל רקמות הגידול מסוג PDX, עם או בלי טיפול באולטרסאונד. ב. מספר הפוספופפטידים שזוהו (העשרה באמצעות IMAC) בכל רקמות הגידול מסוג PDX, עם או בלי טיפול באולטרסאונד. נכללו בספירה רק חלבונים ופוספופפטידים שיחס השכיחות שלהם היה גדול או שווה לאחוזון ה-25. יחס השכיחות חושב בין דגימות מאותו הסוג.
מחקר וגרפים: ©Li et al., 2025

עיבוד וניתוח במורד הזרם

לאחר הטיפול באולטרסאונד וההבהרה, יש להמשיך כפי שתואר בתהליך העבודה המקורי בסגנון CPTAC:

1. יש לדלל את התוצר המפורק ביחס של 1:3 (נפח/נפח) ב-50 מ"מ טריס-HCl ב-pH 8.0 כדי להפחית את רמת האוריאה ל- <2 M.
2. יש להוסיף LysC בריכוז של 1 mAU לכל 50 µg חלבון ולהניח לתערובת להתפתח במשך שעתיים בטמפרטורה של 25°C.
3. יש להוסיף טריפסין ביחס של 1:49 בין האנזים למצע (משקל למשקל) ולבצע עיכול במשך לילה בטמפרטורה של 25°C.
4. יש לבצע מרווה בחומצה פורמית עד לריכוז סופי של 1%.
5. המשך בתהליך הפחתת המליחות, תיוג TMT, הפרדה, העשרת פוספופפטידים ו-LC-MS/MS לפי הצורך.

ביטוי דיפרנציאלי של פוספופפטידים באמצעות MS עם תיוג TMT.
א. תת-הסוג הבסיסי, המדגיש מספר פוספופפטידים אנושיים (התחלת וסיום רצף החלבון) שהביטוי שלהם עלה בדגימות שעברו סוניקציה בהשוואה לדגימות שלא עברו סוניקציה. ב. תת-הסוג הלומנלי, המדגיש כמה פוספופפטידים אנושיים (התחלת וסיום רצף החלבון) שעברו עלייה ברגולציה בדגימות שעברו סוניקציה בהשוואה לדגימות שלא עברו סוניקציה. ג. מסלולי KEGG מועשרים המבוססים על החלבונים של פוספופפטידים שעברו עלייה ברגולציה בתת-הסוג הבסיסי של גידולים שעברו סוניקציה. ד. מסלולי KEGG מועשרים המבוססים על החלבונים של פוספופפטידים שעברו עלייה ברגולציה בתת-הסוג הלומנלי של גידולים שעברו סוניקציה.
מחקר וגרפים: ©Li et al., 2025

תכנון, ייצור וייעוץ – איכות תוצרת גרמניה

Hielscher ultrasonicators ידועים באיכות הגבוהה ביותר שלהם סטנדרטים עיצוב. חוסן ותפעול קל מאפשרים שילוב חלק של האולטרסאונד שלנו במתקנים תעשייתיים. תנאים קשים וסביבות תובעניות מטופלים בקלות על ידי אולטרסוניקטורים Hielscher.

Hielscher Ultrasonics היא חברה מוסמכת ISO לשים דגש מיוחד על ultrasonicators ביצועים גבוהים שמציעות טכנולוגיה חדישה וידידותיות למשתמש. כמובן, Hielscher ultrasonicators הם תואמי CE ולעמוד בדרישות של UL, CSA ו RoHs.

ספרות / מקורות