מיצוי חלבונים מרקמת גידול בסיוע סוניקציה – פרוטוקול

פרוטוקול זה מתאר שיטה למיצוי חלבונים מרקמת גידול בסיוע סוניקציה, המשפרת את תהליך העבודה הסטנדרטי של CPTAC לליזיס באמצעות אוראה על ידי הוספת שלב מבוקר של סוניקציה באמצעות גשוש במהלך פירוק הרקמה. שינוי זה מתבסס על האסטרטגיה המבוססת של CPTAC להכנת הפרוטאום והפוספופרוטאום לניתוח מעמיק, ומשפר את פירוק התאים והמבנים התת־תאיים, מפחית את צמיגות הדגימה ומגביר את שחרורם של חלבונים שבדרך כלל קשה יותר להפיק באמצעות ליזיס באוראה בלבד, במיוחד חלבונים הקשורים לממברנה וחלבונים קושרי DNA או הקשורים לגרעין. במחקר שעליו מבוסס הפרוטוקול, תהליך העבודה בסיוע סוניקציה הגביר את הזיהוי של חלבונים ושל פוספופפטידים, תוך שמירה על התאימות לשלבים הבאים בתהליך העבודה בסגנון CPTAC: עיכול, סימון ב־TMT, הפרדה למקטעים, העשרת פוספופפטידים וניתוח LC-MS/MS.

מיצוי חלבונים מרקמת גידול בסיוע סוניקציה לניתוח פרוטאומי ופוספופרוטאומי מעמיק

הפרוטוקול הבא מותאם למיצוי חלבונים מרקמת גידול שנטחנה לאבקה בתנאים קריוגניים, בבופר ליזיס המכיל אוראה בריכוז 8 M: הוספת שלב סוניקציה באמצעות גשוש משפרת את ההפקה של קבוצות חלבונים שקשה למצותן, במיוחד חלבונים הקשורים לממברנה וחלבונים הקשורים ל־DNA או לגרעין, לפני העיכול וניתוח ה־LC-MS/MS בהמשך. במחקר של Li et al. (2025), שעליו מבוסס הפרוטוקול, הוספת סוניקציה הגבירה את הזיהוי של חלבונים הקשורים לממברנה ולגרעין ואפשרה כיסוי מעמיק של >12,000 חלבונים ושל >25,000 פוספופפטידים במסגרת תהליך העבודה שלהם.

תחום היישום של הפרוטוקול

השתמשו בהליך זה עבור:

• רקמת גידול שהוקפאה כשהיא טרייה ונטחנה לאבקה בתנאים קריוגניים
• משקעי תאים או דגימות ביולוגיות אחרות שכבר קיים עבורן תהליך מבוסס למיצוי באמצעות אוראה
• תהליכי עבודה לפרוטאומיקה ולפוספופרוטאומיקה כלל־מערכתיות, המשתמשים בעיכול באמצעות טריפסין ובסימון אופציונלי ב־TMT

במחקר של Li et al. (2025) מצוין כי תהליך העבודה ישים גם לסוגי דגימות אחרים, כגון קווי תאים, דם ושתן, אך ייתכן שתידרש אופטימיזציה בהתאם לסוג הדגימה.

תהליך עבודה ממוטב להכנת דגימות, הכולל שלב סוניקציה. תהליך העבודה הממוטב ותכנון הניסוי מבוססים על פרוטוקול CPTAC להכנת דגימות לניתוח פרוטאומי ופוספופרוטאומי כלל־מערכתי.
מחקר ותרשים: ©Li et al., 2025

עקרון הפעולה

במחקר המקורי נוספה סוניקציה לתהליך העבודה הסטנדרטי של CPTAC לליזיס באמצעות אוראה, ונמצא שיפור בזיהוי חלבונים הקשורים לממברנות ולגרעינים. המחברים מציינים שיש לכוונן במדויק את פרמטרי הסוניקציה בהתאם לגודל הדגימה ולריכוזה – באמצעות בחירת גודל הסונוטרודה, כמות האנרגיה המושקעת ותזמון הפולסים.

לדוגמה, עבור Hielscher UP200Ht ו־UP200St, המשמעות היא:

• השתמשו באמפליטודה ובמצב הפולסים כמשתני הבקרה העיקריים
• שמרו על הדגימות קרות לאורך כל התהליך (כלומר, על קרח)
• התחילו בהגדרות מתונות
• בצעו אופטימיזציה לפי צלילות הדגימה, הטמפרטורה, תפוקת החלבונים ואיכות הפפטידים בשלבים הבאים

 
שני דגמי מכשירי הסוניקציה של Hielscher בהספק 200 ואט, UP200Ht ו־UP200St, מיועדים לנפחי דגימה קטנים ובינוניים, וכוללים הגדרות אמפליטודה ופולסים הניתנות להתאמה; שני ההומוגנייזרים האולטרסוניים מציעים בקרה דיגיטלית באמצעות מסך מגע לכוונון מדויק של הפרמטרים, רישום נתונים אוטומטי, חיישן טמפרטורה הניתן לחיבור, שליטה מרחוק ותאורת דגימה.
 

ריאגנטים למיצוי חלבונים בסיוע סוניקציה

בופר ליזיס המכיל אוראה

הכינו בופר טרי מיד לפני השימוש:

• אוראה בריכוז 8 M
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8.0
• 1 mM EDTA
• אפרוטינין בריכוז 2 µg/mL
• לאופפטין בריכוז 10 µg/mL
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• תערובת מעכבי פוספטאז 2, 1:100 (v/v)
• תערובת מעכבי פוספטאז 3, 1:100 (v/v)

יש להמיס את האוראה לחלוטין לפני הוספת התוספים; יש להוסיף מעכבים מיד לפני השימוש; יש לשמור את הבופר על קרח; ולאחר הוספת התוספים מומלץ לערבב בתנועה סיבובית עדינה במקום לערבל בעוצמה במערבל וורטקס.
 

ריאגנטים נוספים:

• ריאגנטים לבדיקת ריכוז חלבון בשיטת BCA
• 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
• DTT
• יודואצטאמיד
• LysC
• טריפסין
• חומצה פורמית
• ריאגנטים של TMT, אם משתמשים בפרוטאומיקה כמותית מרובבת
• ריאגנטים של IMAC, אם מבצעים העשרת פוספופפטידים

ציוד למיצוי חלבונים בסיוע סוניקציה

ציוד נדרש

בחירת גשוש מומלצת

לדגימות בנפח של כ־200–1000 µL, השתמשו בסונוטרודה בקוטר קטן המתאימה לעיבוד ישיר בעוצמה גבוהה של נפחים קטנים. Hielscher מציעה סונוטרודות במגוון קטרים, וקטרים קטנים יותר של הקצה מספקים עוצמה גבוהה יותר בקצה.

הערה מעשית: השתמשו בגשוש הקטן ביותר המספק ערבוב יעיל ללא הקצפה מופרזת או מגע בדופן הכלי.

אם אתם עובדים עם כמה דגימות בו־זמנית, תוכלו לשקול את הסוניקטור הרב־מבחנתי VialTweeter או הסוניקטור למיקרופלטות UIP400MTP!

הוראות שלב אחר שלב: הליך מיצוי חלבונים בסיוע סוניקציה

א. קירור מקדים והכנה

1. קררו את הצנטריפוגה ל־4°C.
2. הכינו בופר ליזיס טרי המבוסס על אוראה ושמרו אותו על קרח.
3. התקינו את UP200Ht או UP200St על מעמד בתוך תא אקוסטי.
4. הכינו אמבט קרח גדול דיו להחזקת מבחנות הדגימה במצב זקוף ויציב.

הכנת בופר טרי וטיפול בדגימות בתנאי קור הם קריטיים.

ב. מיצוי ראשוני באוראה

1. שמרו את הרקמה שנטחנה לאבקה בתנאים קריוגניים על קרח.
2. הוסיפו 200 µL של בופר ליזיס מקורר המבוסס על אוראה לכל 50 mg של רקמה רטובה.
3. ערבלו בוורטקס במשך 5–10 s במהירות גבוהה.
4. הדגירו במשך 15 min ב־4°C.
5. חזרו פעם נוספת על שלב הערבול בוורטקס וההדגרה.
6. צנטריפגו ב־20,000g במשך 10 min ב־4°C.
7. העבירו את הליזט/הנוזל העליון למבחנה נקייה בעלת ספיחה נמוכה.

ג. סוניקציה באמצעות UP200Ht או UP200St

תנאי התחלה לסוניקציה

• משרעת: התחילו ב־20–30%
• משך הפולס: 5 s במצב פעיל
• קירור: 2 min על קרח בין הפולסים
• מספר מחזורים: 4 מחזורים
• זמן סוניקציה פעילה כולל: 20 s
• משך התהליך הכולל, לרבות קירור: כ־8–10 min

שלבי הסוניקציה

1. העבירו את הליזט למבחנה המתאימה לסוניקציה. השתמשו במבחנה צרה בעלת דפנות דקות, המאפשרת מעבר חום טוב וטבילה בטוחה של הגשוש.
2. הניחו את המבחנה באמבט קרח. המאמר מציין שקירור במהלך הסוניקציה הוא קריטי למניעת נזקי חום.
3. טבלו את קצה הגשוש בדגימה. שמרו את הקצה טבול בעומק מספיק לקוויטציה יציבה, אך אל תאפשרו לו לגעת בדופן המבחנה או בתחתיתה.
4. הפעילו פולס אחד של 5 s במשרעת ההתחלתית.
5. החזירו מיד את הדגימה במלואה לקרח למשך 2 min.
6. חזרו על הפעולה עד להשלמת 4 מחזורים.
7. בדקו את הליזט לאחר מחזור.
8. המשיכו רק במידת הצורך, עם פולס נוסף אחד של 5 s בכל פעם, ותמיד עם קירור מלא לאחריו.
9. הפסיקו ברגע שהליזט נעשה אחיד יותר ופחות חוטי/צמיג.
   נקודת הסיום היא ליזט שקוף למחצה במידה רבה יותר, היוצר טיפות במקום זרימה צמיגה רציפה.
10. צנטריפגו בכ־16,000g במשך 15 min ב־4°C.
11. העבירו את הנוזל העליון הצלול למבחנה חדשה ומדדו את ריכוז החלבון.

השוואה של פרוטאומיקה גלובלית ופוספופרוטאומיקה בין דגימות שעברו סוניקציה לדגימות שלא עברו סוניקציה.
א. מספר החלבונים שזוהו (פרוטאומיקה גלובלית) בכל רקמות הגידול מסוג PDX, עם סוניקציה או בלעדיה. ב. מספר הפוספופפטידים שזוהו (העשרת IMAC) בכל רקמות הגידול מסוג PDX, עם סוניקציה או בלעדיה. נספרו רק חלבונים ופוספופפטידים בעלי יחס שפע הגדול מהאחוזון ה־25 או שווה לו. יחס השפע חושב בין דגימות מאותו סוג.
מחקר וגרפים: ©Li et al., 2025

עיכול ואנליזה בהמשך התהליך

לאחר הסוניקציה וההצללה, המשיכו כמתואר בתהליך העבודה המקורי בסגנון CPTAC:

1. מהלו את הליזט ביחס 1:3 (v/v) באמצעות 50 mM Tris-HCl ב־pH 8.0 כדי להפחית את ריכוז האוראה ל־<2 M.
2. הוסיפו LysC בכמות של 1 mAU לכל 50 µg חלבון והדגירו במשך 2 h ב־25°C.
3. הוסיפו טריפסין ביחס אנזים:סובסטרט של 1:49 (w/w) ובצעו עיכול במשך הלילה ב־25°C.
4. עצרו את התגובה באמצעות חומצה פורמית לריכוז סופי של 1%.
5. המשיכו לסילוק מלחים, לסימון ב-TMT, להפרדה למקטעים, להעשרת פוספופפטידים ולניתוח LC-MS/MS לפי הצורך.

ביטוי דיפרנציאלי של פוספופפטידים בניתוח MS עם סימון ב-TMT.
a. תת-הסוג הבזאלי, תוך הדגשת כמה פוספופפטידים אנושיים (תחילת protein-sequence וסופו) שביטוים מוגבר בדגימות שעברו סוניקציה בהשוואה לדגימות שלא עברו סוניקציה. b. תת-הסוג הלומינלי, תוך הדגשת כמה פוספופפטידים אנושיים (תחילת protein_sequence וסופו) שביטוים מוגבר בדגימות שעברו סוניקציה בהשוואה לדגימות שלא עברו סוניקציה. c. מסלולי KEGG מועשרים על סמך החלבונים של הפוספופפטידים שביטוים מוגבר בגידולים מתת-הסוג הבזאלי שעברו סוניקציה. d. מסלולי KEGG מועשרים על סמך החלבונים של הפוספופפטידים שביטוים מוגבר בגידולים מתת-הסוג הלומינלי שעברו סוניקציה.
מחקר וגרפים: ©Li et al., 2025

תכנון, ייצור וייעוץ – איכות תוצרת גרמניה

מכשירי הסוניקציה של Hielscher ידועים בסטנדרטים הגבוהים ביותר של איכות ותכנון. עמידות ותפעול פשוט מאפשרים שילוב חלק של מכשירי הסוניקציה שלנו במתקנים תעשייתיים. מכשירי הסוניקציה של Hielscher מתמודדים בקלות עם תנאים קשים וסביבות תובעניות.

Hielscher Ultrasonics היא חברה בעלת הסמכת ISO, והיא שמה דגש מיוחד על מכשירי סוניקציה בעלי ביצועים גבוהים, המשלבים טכנולוגיה מתקדמת ביותר וידידותיות למשתמש. כמובן, מכשירי הסוניקציה של Hielscher תואמים לדרישות CE ועומדים בדרישות UL, CSA ו-RoHs.

ספרות / מקורות

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.