הכנת דגימות בעזרת מסנן קולי (FASP): שיפור תהליכי העבודה בפרוטאומיקה באמצעות סוניקציה מתקדמת

הכנת דגימות בסיוע מסנן קולי (FASP) מתגלה כשיטה יעילה ביותר וניתנת לשחזור בתחום הפרוטאומיקה המודרנית. באמצעות שילוב של טיפול קולי מבוקר בתהליכי FASP מקובלים, יכולים חוקרים לשפר באופן משמעותי את מיצוי החלבונים, את יעילות העיכול ואת איכות הנתונים הכוללת. עם העלייה בביקוש להכנת דגימות בעלת תפוקה גבוהה וניתנת לשחזור, מכשירי סוניקציה ממוקדים כגון מכשיר הסוניקציה למיקרו-פלטה UIP400MTP צוברים חשיבות מדעית ומעשית.

הקשר מדעי: מדוע FASP חשוב בתחום הפרוטאומיקה

הכנת דגימות בסיוע מסננים (FASP) הפכה לסטנדרט הזהב בפרוטאומיקה מלמטה למעלה, בזכות יכולתה להסיר חומרי ניקוי, מלחים ומזהמים אחרים, תוך שהיא מאפשרת עיכול אנזימטי יעיל. עם זאת, פרוטוקולי FASP קלאסיים נתקלים לעתים קרובות במגבלות הקשורות לליזיס לא מלא, לעיכול לא אחיד ולשונות בין הדגימות – במיוחד כאשר מדובר בתאים או ברקמות ביולוגיים מורכבים או בעלי כושר התאוששות גבוה.
זהו המקום שבו אנרגיית אולטרה-סאונד ממוקדת (סוניקציה) מספקת יתרון מכריע. באמצעות הפעלת כוחות גזירה מכניים ותופעת הקוויטציה, הסוניקציה משפרת מספר שלבים קריטיים בתהליך ה-FASP מבלי לפגוע בשלמות החלבונים.

ההשפעות החיוביות של סוניקציה בשיטת FASP אולטראסונית

הסוניקציה יוצרת קוויטציה אקוסטית מבוקרת – היווצרות והתמוטטות של בועות מיקרוסקופיות – הגורם להיווצרות כוחות גזירה מקומיים ולזרימה מיקרוסקופית.
השימוש באולטרסאונד משפר הן את שלב האלקילציה והן את שלב הפירוק בשיטת FASP האולטרסונית, באמצעות שיפור העברת המסה והאצת קינטיקת התגובה. השימוש באנרגיה אולטרסונית יוצר קוויטציה, המובילה ליצירת זרמים מיקרוסקופיים מקומיים וכוחות גזירה חולפים, המקדמים ערבוב מהיר וחדירה יעילה של הריאגנטים לתוך מטריצת החלבון או סביבת המסנן. במהלך האלקילציה, הדבר מביא לשינוי אחיד ומהיר יותר של שאריות הציסטאין על ידי יודואצטאמיד. בשלב העיכול, הסוניקציה מגבירה את הנגישות לאתרי החיתוך הפרוטאוליטיים ומשפרת את האינטראקציות בין האנזים למצע, ובכך מאיצה את פעילות הטריפסין ומשפרת את יעילות העיכול. בסך הכל, הטיפול האולטראסוני מפחית את זמן העיבוד תוך שמירה על שלמות התגובה והשחזור או שיפורם.

בהכנת דגימות לפרוטאומיקה, שיטת FASP האולטראסונית מתבטאת ב:

• פירוק תאים ומיצוי חלבונים יעילים יותר, אפילו ברקמות קשות או בדגימות מיקרוביאליות
• שיפור המסיסות של חלבונים
• נגישות משופרת לאנזימים במהלך העיכול
• קיצור זמן העיבוד ושיפור יכולת השחזור

בניגוד לשיטות פירוק מכניות או כימיות מסורתיות, העיבוד הקולי ניתן לשליטה ולהרחבה במידה רבה, מה שהופך אותו למתאים במיוחד לתהליכי עבודה סטנדרטיים בתחום הפרוטאומיקה.

יתרונות השיטה האולטראסונית FASP על פני שיטות מסורתיות

שילוב הטיפול באולטרסאונד בפרוטוקולי FASP מספק יתרונות מדידים המשפיעים באופן ישיר על תוצאות הספקטרומטריית מסות בהמשך התהליך.
שיטת FASP האולטראסונית מאפשרת השבת חלבונים מלאה יותר, במיוחד מדגימות קשות כגון רקמות סיביות או ביופילמים. פיזור האנרגיה האחיד מבטיח טיפול עקבי בכל הדגימות, ובכך מפחית את השונות – תנאי הכרחי לפרוטאומיקה כמותית.
בנוסף, השימוש באולטרסאונד מאיץ את קינטיקת העיכול באמצעות שיפור האינטראקציה בין האנזים למצע. תופעה זו מובילה לעתים קרובות לזמני עיכול קצרים יותר ולתפוקה גבוהה יותר של פפטידים, תוך שמירה על כיסוי הרצף.
מבחינת זרימת העבודה, מערכות אולטראסוניות מצמצמות את הצורך בהתערבות ידנית ומבטלות את הצורך בטיפולים כימיים אגרסיביים, ובכך שומרות על שלמות הדגימה ומפשטות את תהליך הסטנדרטיזציה של הפרוטוקולים.

תרשים ון המציג את הגידול במספר החלבונים שזוהו בשיטת FASP אולטראסונית בהשוואה לשיטת FASP לילה
תמונה ומחקר: ©Carvalho et al., 2020

פרוטוקול: FASP קולי בתפוקה גבוהה באמצעות ה-UIP400MTP

למעבדות המעבדות קבוצות גדולות של דגימות, מכשיר הסוניקציה למיקרו-פלטה UIP400MTP מאפשר ביצוע סוניקציה בו-זמנית של צלחות רב-תאיות סטנדרטיות (כגון צלחות 96-תאיות), מה שמגדיל באופן משמעותי את התפוקה ואת יכולת השחזור.
בפורמט זה, הדגימות (בדרך כלל 50–200 מיקרוליטר לכל באר) מוכנות ישירות במיקרו-פלטה התואמת לאולטרה-סינון או לעיבוד המשך. תמיסות הליזה דומות לאלה המשמשות בפרוטוקולי FASP סטנדרטיים.

מכשיר ה-UIP400MTP מפיץ אנרגיית אולטרה-סאונד אחידה בכל התאים. הטיפול באולטרה-סאונד מתבצע בדרך כלל בעוצמה של 60–80% למשך 2–4 דקות, בהתאם לסוג הדגימה. יש לפקח על הטמפרטורה באמצעות חיישן הטמפרטורה הניתן לחיבור. יש להשתמש בטיפול באולטרה-סאונד פועם, ובאופן אופציונלי – במקרר מעבדה.

פרוטוקול לדוגמה:

1. בשלב האלקילציה, הדגימות עוברות טיפול קולי באמצעות מכשיר הסוניקציה למיקרו-פלטה (UIP400MTP) בעוצמה של 40% למשך 7 מחזורים (30 שניות פועל, 15 שניות כבוי; משך הטיפול הקולי הכולל: 5 דקות ו-45 שניות).
2. לאחר הטיפול באולטרסאונד, מסירים את תמיסת היודואצטאמיד (IAA) באמצעות צנטריפוגה. לפני העיכול בטריפסין, יש לשטוף את הדגימות כדי להסיר שאריות אוריאה, חומר כאוטרופי חזק המעכב את הפעילות האנזימטית. לפיכך, הדגימות נשטפות פעמיים עם 200 μL של ביקרבונט אמוניום (AmBic) בריכוז של 25 mM.
3. לאחר מכן, מוסיפים 100 μL של תמיסת טריפסין (ביחס של 1:30 בין האנזים לחלבון) שהוכנה בתמיסת ביקרבונט אמוניום בריכוז של 12.5 mM. לאחר מכן, מתבצע פירוק החלבון באמצעות מכשיר ה-UIP400MTP באותם תנאי סוניקציה (משרעת של 40%, 7 מחזורים, 30 שניות פועל / 15 שניות כבוי; זמן כולל: 5 דקות ו-45 שניות).
4. לאחר הטיפול באולטרסאונד, הדגימות מועברות לצלחות סינון או מעובדות באמצעות מערכות FASP מבוססות צלחות. שלבי ההפחתה והאלקילציה מתבצעים בתוך הצלחת, תוך שמירה על תהליך עבודה יעיל.
5. העיכול בטריפסין מתבצע בתנאים מבוקרים (למשל, בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, במשך 4–16 שעות), עם אפשרות לגירוי קצר באמצעות גלי קול כדי להאיץ את הפעילות האנזימטית ולשפר את תפוקת הפפטידים.
6. הפפטידים מופרדים באמצעות צנטריפוגה ומוכנים לניתוח LC-MS/MS.

היתרון העיקרי של מערכת זו טמון ביכולתה לספק תנאי עיבוד זהים בכל הבארות, דבר שמצמצם את השפעות האצווה ומאפשר ביצוע השוואות כמותיות אמינות במחקרי פרוטאומיקה בקנה מידה גדול.

תכנון, ייצור וייעוץ – איכות תוצרת גרמניה

Hielscher ultrasonicators ידועים באיכות הגבוהה ביותר שלהם סטנדרטים עיצוב. חוסן ותפעול קל מאפשרים שילוב חלק של האולטרסאונד שלנו במתקנים תעשייתיים. תנאים קשים וסביבות תובעניות מטופלים בקלות על ידי אולטרסוניקטורים Hielscher.

Hielscher Ultrasonics היא חברה מוסמכת ISO לשים דגש מיוחד על ultrasonicators ביצועים גבוהים שמציעות טכנולוגיה חדישה וידידותיות למשתמש. כמובן, Hielscher ultrasonicators הם תואמי CE ולעמוד בדרישות של UL, CSA ו RoHs.

ספרות / מקורות