הכנת דגימות בסיוע מסנן ובאמצעות אולטרסאונד (FASP): שיפור תהליכי עבודה בפרוטאומיקה באמצעות סוניקציה מתקדמת

הכנת דגימות בסיוע מסנן ובאמצעות אולטרסאונד (FASP) מתבססת כשיטה יעילה ביותר והדירה בפרוטאומיקה המודרנית. באמצעות שילוב סוניקציה מבוקרת בתהליכי עבודה מבוססים של FASP, חוקרים יכולים לשפר משמעותית את מיצוי החלבונים, את יעילות העיכול ואת איכות הנתונים הכוללת. עם העלייה בביקוש להכנת דגימות הדירה בתפוקה גבוהה, סוניקטורים ממוקדים כגון סוניקטור המיקרופלטות UIP400MTP מקבלים חשיבות מדעית ומעשית הולכת וגוברת.

ההקשר המדעי: מדוע FASP חשוב בפרוטאומיקה

הכנת דגימות בסיוע מסנן (FASP) הפכה לתקן זהב בפרוטאומיקה בגישת מלמטה למעלה, הודות ליכולתה להסיר דטרגנטים, מלחים ומזהמים אחרים תוך מתן אפשרות לעיכול אנזימטי יעיל. עם זאת, פרוטוקולי FASP קלאסיים נתקלים לעיתים קרובות במגבלות הקשורות לפירוק תאים לא מלא, לעיכול לא עקבי ולשונות בין דגימות – במיוחד כשמדובר בתאים או ברקמות ביולוגיים מורכבים או עמידים.
כאן אנרגיה אולטרסונית ממוקדת (סוניקציה) מספקת יתרון מכריע. באמצעות יצירת כוחות גזירה מכניים וקוויטציה, סוניקציה משפרת כמה שלבים קריטיים בתהליך העבודה של FASP מבלי לפגוע בשלמות החלבונים.

ההשפעות החיוביות של סוניקציה ב-FASP אולטרסוני

סוניקציה יוצרת קוויטציה אקוסטית מבוקרת – היווצרות וקריסה של בועות מיקרוסקופיות – המחוללת כוחות גזירה מקומיים ומיקרו-זרימה.
סוניקציה משפרת הן את שלב האלקילציה והן את שלב העיכול ב-FASP אולטרסוני באמצעות שיפור מעבר המסה והאצת קינטיקת התגובה. הפעלת אנרגיה אולטרסונית מחוללת קוויטציה, המובילה למיקרו-זרימה מקומית ולכוחות גזירה חולפים המקדמים ערבוב מהיר וחדירה יעילה של ריאגנטים למטריצת החלבונים או לסביבת המסנן. במהלך האלקילציה, הדבר מוביל לשינוי אחיד ומהיר יותר של שיירי ציסטאין באמצעות יודואצטאמיד. בשלב העיכול, סוניקציה מגבירה את הנגישות של אתרי ביקוע פרוטאוליטיים ומשפרת אינטראקציות בין אנזים לסובסטרט, ובכך מאיצה את פעילות הטריפסין ומשפרת את יעילות העיכול. בסך הכול, טיפול אולטרסוני מקצר את זמן העיבוד תוך שמירה על שלמות התגובה והדירותה או שיפורן.

בהכנת דגימות לפרוטאומיקה, FASP אולטרסוני מתבטא ביתרונות הבאים:

• פירוק תאים ומיצוי חלבונים יעילים יותר, גם ברקמות קשות לפירוק או בדגימות מיקרוביאליות
• המסה משופרת של חלבונים
• נגישות משופרת לאנזימים במהלך העיכול
• קיצור זמן העיבוד והגברת ההדירות

בניגוד לשיטות קונבנציונליות של פירוק תאים מכני או כימי, עיבוד אולטרסוני מאפשר רמת שליטה גבוהה והתאמה להיקפי עיבוד שונים, ולכן מתאים במיוחד לתהליכי עבודה מתוקננים בפרוטאומיקה.

יתרונות FASP אולטרסוני לעומת גישות קונבנציונליות

שילוב סוניקציה בפרוטוקולי FASP מספק יתרונות מדידים המשפיעים ישירות על תוצאות ספקטרומטריית המסות בהמשך התהליך.
FASP אולטרסוני מאפשר השבה מלאה יותר של חלבונים, במיוחד מדגימות מאתגרות כגון רקמות סיביות או ביופילמים. פיזור האנרגיה האחיד מבטיח טיפול עקבי בין חזרות ומפחית שונות – דרישה חיונית לפרוטאומיקה כמותית.
בנוסף, סוניקציה מאיצה את קינטיקת העיכול באמצעות שיפור האינטראקציה בין אנזים לסובסטרט. הדבר מוביל לעיתים קרובות לזמני עיכול קצרים יותר ולתפוקת פפטידים גבוהה יותר, תוך שמירה על כיסוי הרצף.
מבחינת תהליך העבודה, מערכות אולטרסוניות מצמצמות את ההתערבות הידנית ומבטלות את הצורך בטיפולים כימיים אגרסיביים, תוך שמירה על שלמות הדגימות ופישוט התקנון של הפרוטוקולים.

דיאגרמת ון המציגה את המספר המוגדל של חלבונים שזוהו באמצעות FASP אולטרסוני בהשוואה ל-FASP הנמשך לאורך הלילה
תמונה ומחקר: ©Carvalho et al., 2020

פרוטוקול: FASP אולטרסוני בתפוקה גבוהה באמצעות UIP400MTP

במעבדות המעבדות קבוצות גדולות של דגימות, מכשיר הסוניקציה למיקרופלטות UIP400MTP מאפשר סוניקציה בו־זמנית של צלחות סטנדרטיות מרובות באריות (למשל, צלחות בעלות 96 באריות), ובכך מגדיל משמעותית את התפוקה ואת ההדירות.
במתכונת זו, הדגימות (בדרך כלל 50–200 µL לבארית) מוכנות ישירות במיקרופלטות המתאימות לאולטרה־פילטרציה או לעיבוד בהמשך התהליך. תמיסות הבופר לליזיס דומות לאלו המשמשות בפרוטוקולי FASP סטנדרטיים.

UIP400MTP מפעיל אנרגיה אולטרסונית אחידה בכל הבאריות. הסוניקציה מתבצעת בדרך כלל באמפליטודה של 60–80% במשך 2–4 דקות, בהתאם לסוג הדגימה. יש לנטר את הטמפרטורה באמצעות חיישן הטמפרטורה הניתן לחיבור. יש להשתמש בסוניקציה בפולסים, ולפי הצורך גם בצ'ילר מעבדתי.

פרוטוקול לדוגמה:

1. בשלב האלקילציה, הדגימות עוברות סוניקציה באמצעות מכשיר הסוניקציה למיקרופלטות (UIP400MTP) באמפליטודה של 40% במשך 7 מחזורים (30 s הפעלה, 15 s הפסקה; זמן סוניקציה כולל: 5 min 45 s).
2. לאחר הסוניקציה, תמיסת היודואצטאמיד (IAA) מוסרת באמצעות צנטריפוגה. לפני העיכול בטריפסין, חובה לשטוף את הדגימות כדי להסיר שאריות אוריאה, חומר כאוטרופי חזק המעכב פעילות אנזימטית. לכן, הדגימות נשטפות פעמיים ב־200 μL של אמוניום ביקרבונט (AmBic) בריכוז 25 mM.
3. לאחר מכן מוסיפים 100 μL של תמיסת טריפסין (יחס אנזים לחלבון של 1:30) שהוכנה באמוניום ביקרבונט בריכוז 12.5 mM. עיכול החלבונים מתבצע לאחר מכן באמצעות UIP400MTP באותם תנאי סוניקציה (אמפליטודה של 40%, 7 מחזורים, 30 s הפעלה / 15 s הפסקה; זמן כולל: 5 min 45 s).
4. לאחר הסוניקציה, הדגימות מועברות לצלחות סינון או מעובדות באמצעות מערכות FASP המבוססות על צלחות. שלבי החיזור והאלקילציה מתבצעים בתוך הצלחת, תוך שמירה על תהליך עבודה יעיל.
5. העיכול בטריפסין מתבצע בתנאים מבוקרים (למשל, 37°C, במשך 4–16 שעות), עם אפשרות לגירוי אולטרסוני קצר להאצת הפעילות האנזימטית ולשיפור תפוקת הפפטידים.
6. הפפטידים נאספים באמצעות צנטריפוגה ומוכנים לאנליזת LC-MS/MS.

היתרון המרכזי של מערכת זו טמון ביכולתה לספק תנאי עיבוד זהים בכל הבאריות, ובכך למזער השפעות אצווה ולאפשר השוואות כמותיות מהימנות במחקרי פרוטאומיקה בקנה מידה גדול.

תכנון, ייצור וייעוץ – איכות תוצרת גרמניה

המכשירים האולטרסוניים של Hielscher ידועים בתקני האיכות והתכנון הגבוהים ביותר שלהם. עמידות ותפעול קל מאפשרים שילוב חלק של המכשירים האולטרסוניים שלנו במתקנים תעשייתיים. המכשירים האולטרסוניים של Hielscher מתמודדים בקלות עם תנאים קשים וסביבות תובעניות.

Hielscher Ultrasonics היא חברה בעלת הסמכת ISO, והיא שמה דגש מיוחד על מכשירים אולטרסוניים עתירי ביצועים המשלבים טכנולוגיה מתקדמת ביותר וידידותיות למשתמש. כמובן, המכשירים האולטרסוניים של Hielscher תואמים לדרישות CE ועומדים בדרישות UL, CSA ו־RoHs.

ספרות / מקורות

FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
• Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
• Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).